CC BY
43
8 -7 -6 -5 -
Дни 4 -3 -2 -1 -0 -
□ Средство на основе «Силативита» □ Средство на основе ДМСО
Рисунок. Эффективность применения мази, содержащей 2% кетопрофена, на основе «Силативита» при закрытых травмах вымени у коров
7,28
5.72 6,12
4,12 3,95
2,42
Отек Уплотнение тканей Кровоподтеки Болевая реакция
«Силативита» позволяет усилить эффект действия фармацевтических композиций, снизить их дозу и токсичность.
Активным компонентом новой мази является нестероидный противовоспалительный препарат кетопрофен группы карбоновых кислот - производное пропионовой кислоты. Он оказывает двойное действие: подавляет не только циклооксигеназный, но и липооксигена-зый путь обмена. Кетопрофен оказывает мощное воздействие на сосудистую и клеточную стадии воспаления, имеет более выраженный обезболивающий и противовоспалительный эффект по сравнению с другими препаратами этой фармакологической группы. Важным преимуществом кетопрофена является заметное снижение частоты случаев негативного побочного действия.
Концентрация (2%) действующего вещества кетопрофена в препарате была определена опытным путем с учетом получения лекарственной формы в виде нерасслаивающейся мази, легко наносимой на вымя коров, а также с учетом его лечебной эффективности по результатам исследований и испытаний.
Приготовление опытных партий средства в виде мази, содержащей 2% кетопрофена на основе «Силативита», осуществляли в лаборатории Института органического синтеза им. И.Я. По-стовского УрО РАН.
Исследования лекарственной эффективности мази на основе «Силативита», содержащей 2% кетопрофена, при закрытых травмах сосков были выполнены на двух группах коров-анало-гов по шесть голов в каждой. Всем животным исследуемый препарат втира-
ли в кожу травмированной четверти вымени 2 раза в день. В контрольных группах использовали жидкое средство на основе диметилсульфоксида (2-процентный раствор кетопрофена на 50процентном растворе ДМСО) по аналогичной схеме. При оценке эффективности лечения в этом опыте учитывали время нормализации таких клинических показателей, как отек, уплотнение тканей, кровоподтеки, болевая реакция.
Результаты исследования Клинические испытания показали, что исследуемый препарат при нанесении на кожу пораженных участков вымени и сосков хорошо и быстро всасывается, обеспечивает выраженный лечебный эффект (рисунок). При лечении закрытых механических повреждений
Ветеринария
болевая реакция сокращается в среднем на 1,3 суток (в 1,5 раза), кровоподтеки исчезают на 1,5 суток быстрее, чем при использовании средства на основе ДМСО, а время исчезновения посттрав-матического отека тканей при использовании нового препарата было на 1,7 суток (в 1,7 раза) меньше.
Выводы
Проведенные исследования показали, что применение мази на основе «Силативита», содержащей 2% кетопрофена, позволяет значительно сократить время лечения животных. Об этом свидетельствует сокращение на 1,27-1,70 суток срока нормализации основных клинических показателей по сравнению с препаратом на основе диметилсульфоксида.
Литература
Бояковская Т. Г., Хонина Т. Г., Ларионов Л. П., Филиппова Е. В., Шадрина Е. В. Кремнийорганический глицерогидрогель как новая основа лекарственных и косметических средств // Новые материалы для медицины. Екатеринбург, 2006. С. 108-135.
ОЦЕНКА МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПТИЦ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ И ПРИ ВИРУСНЫХ АНТИГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ
Е.Г. ТУРИЦЫНА,
кандидат ветеринарных наук, доцент, Красноярский ГАУ, г. Красноярск
Ключевые слова: метаболическая активность, лейкоциты птиц, миелопероксидаза, лизосомально-катионные белки, гликоген, иммунизация.
Основной функцией лейкоцитов, в том числе и у птиц, является защита организма от генетически чужеродных тел, появляющихся в крови и тканях. Функции гранулоцитов, особенно ней-трофильных, связаны с наличием большого количества ферментов и основных белков, содержащихся в азу-рофильных и специфических гранулах [1]. Кроме того, гранулоциты отлича-
ются высоким уровнем энергетического обмена, в основе которого лежит утилизация гликогена, который используется ими как энергетический субстрат [2].
Изменения метаболической активности лейкоцитов могут быть связаны с возрастом, физиологическим состоянием и воздействиями различных факторов на организм птиц, в том
числе инфекционных. Известно об ингибирующем влиянии многих вирусных инфекций на хемотаксис и бактерицидные способности гранулоцитов. Имеется возможность не только прямого влияния вирусов на клетки, но и последующее вторичное действие их продуктов на нейтрофилы. Некоторые вирусные инфекции сопровождаются
Metabolic activity, poultry leukocytes, myeloperoxidase, lysosomal cation proteins, glycogen, immunization.
Ветеринария
транзиторной гранулоцитопенией, что убедительно показано в экспериментах на животных [1 ].
Недостаточность метаболической активности различных форм лейкоцитов может рассматриваться как фактор риска для развития патологических состояний, сопровождающихся формированием вторичного иммунодефицита, поскольку именно на уровне клеток происходит формирование ответной реакции на воздействия различных факторов эндогенного и экзогенного происхождения [3].
Цель и методика исследований
В связи с тем, что в условиях промышленных птицефабрик птица раннего постнатального возраста подвергается интенсивным воздействиям живых вакцинных вирусов, была поставлена цель - провести оценку метаболической активности лейкоцитов периферической крови цыплят первых 2-х месяцев жизни при иммунизациях. В задачи исследований входило изучение кислород-зависимой биоцидности лейкоцитов по содержанию миелопероксидазы, кислороднезависимой бактерицидно-сти по уровню лизосомально-катион-ных белков и энергетических возможностей лейкоцитов по количеству гликогена.
Материалом для исследований являлись мазки крови цыплят первых месяцев жизни породы «Хайсекс коричневый», приготовленные в разные сроки после плановых иммунизаций живыми вирусвакцинами, проводимых в условиях промышленного птицеводческого предприятия в соответствии с утвержденной схемой вакци-нопрофилактики. Контролем служили мазки крови неиммунизированной птицы того же возраста.
Морфологический состав крови изучали на мазках, окрашенных комбинированным методом по Паппен-гейму [4], миелопероксидазу исследовали по методу Грэхем-Кнолля с о-толидином или бензидином, гликоген изучали в ШИК-реакции с реактивом Шиффа по МакМанусу [5]. Лизосомаль-
но-катионные белки определяли 0,1процентным забуференным спиртовым раствором прочного зеленого марки С.1.42053 (производство «Диа-эм») по В.Е. Пигаревскому. [6]. Для определения миелопероксидазы и гликогена использовали стандартные наборы («Диахим-ЦитоСтейн», Санкт-Петербург). Контролем при определении гликогена служили мазки крови, обработанные слюной, которые инкубировали при температуре 37°С в течение 30 минут. При последующем окрашивании они давали отрицательную реакцию, так как гликоген расщеплялся амилазой слюны.
Полуколичественную оценку интенсивности цитохимических реакций проводили, используя принцип Астальди-Верга, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые элементы делили на четыре группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++).
Определяли средний цитохимический коэффициент (СЦК) по 1_. Кар1о\« (1955) в модификации В.Е. Пи-гаревского, Ю.А. Мазинга [6]. С этой целью дифференцировали 100 исследуемых клеток по указанной выше системе. Полученный процент клеток в каждой группе умножали на соответствующее данной группе число плюсов. Сумма этих величин, деленная на 100, представляла собой СЦК для одной клетки.
В тех случаях, когда изучаемые вещества локализовались в клетках в виде единичных гранул (например, гликоген в лимфоцитах), результат цитохимической реакции выражали в процентах клеток, дающих положительную реакцию. При проведении исследований были соблюдены стандартные условия обработки препаратов и единые критерии визуальной оценки для выведения количественных показателей учета, что в целом могло отражаться на результатах исследования.
Исследование мазков крови и микрофотографирование проведено на микроскопе МС 100 (Micros, Austria) фотокамерой САМ V200, совмещенной с компьютером при увеличениях объектива х40 и х100. Полученные данные обработаны методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследований
Лизосомально-катионные белки. Биологическое значение лизосомально-катионных белков (ЛКБ), по современным представлениям, довольно широко. Они обладают высокой антибактериальной активностью и участвуют в формировании противоинфекционной неспецифической резистентности организма. Дефицит катионных белков или их недостаточный синтез приводят к снижению функциональной активности лейкоцитов [7].
В процессе исследований установлена положительная реакция на катионные белки гранул гранулоци-тов. В моноцитах и лимфоцитах ли-зосомально-катионный тест был отрицательным.
Лизосомально-катионный тест лейкоцитов у клинически здорового молодняка птиц первой недели жизни отличался крайне низкими показателями. Содержание ЛКБ в псевдоэози-нофилах цыплят суточного возраста колебалось от 0,75 до 1,28 и в среднем составляло 1,02±0,09 ед. Преобладали клетки со слабоположительной (48%) и умеренной (33%) реакцией. От 2 до 6% клеток давали отрицательную реакцию. Ряд авторов расценивают показатели лизосомально-катионного теста до 1,5 ед. как характеризующие низкий уровень естественной резистентности [8, 9]. В 7-суточном возрасте у всех экспериментальных цыплят отмечали снижение уровня ЛКБ. У интактных цыплят разница с исходными показателями составила 12,7%, у привитых - 4,9%. Содержание ЛКБ у вакцинированных цыплят на 11,3% превышало результаты интактной птицы (рис. 1).
Антигенное воздействие живыми вирусвакцинами вызывало слабое понижение ЛКБ у молодняка 14-су-точного возраста. У 21-суточных вакцинированных цыплят количество ЛКБ было на 16,3% ниже, чем в контроле (Р<0,05). По мере дальнейшего роста птицы содержание ЛКБ равномерно возрастало, достигая 1,6-2 ед. к 45-60-суточному возрасту, что соответствует показателям среднего уровня естественной резистентности. Достоверные отличия в этом показателе у привитой и интактной птицы в этот период отсутствовали. В псевдоэозинофилах наблюдались два типа катионных гранул: мелкие, дающие неравномерное светло-зеленое окрашивание цитоплазмы, и более крупные удлиненные светло- или темно-зеленые (рис. 2). Катионные гра-
и
-
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
О
fh
45
60
1 7 14 21 30
□ интактные □вакцинированные Рисунок 1. Показатели СЦК катионных белков в псевдоэозинофилах интактной и вакцинированной птицы
сут.
Ветеринария
нулы в эозинофилах и базофилах имели ярко-зеленую окраску.
Миелопероксидаза. Одним из основных компонентов бактерицидной системы организма является миелопероксидаза, которую помимо перок-сидазы образуют перекись водорода и ионы галоидов (хлора, брома и йода). Эта система является токсичной для бактерий, грибов, вирусов, микоплазм и хламидий.
Псевдоэозинофильные грануло-циты экспериментальных цыплят в первые три недели исследований показали отрицательную реакцию на пе-роксидазу. В возрасте 45-60 дней клетки демонстрировали слабое диффузное окрашивание цитоплазмы. В то же время гранулы эозинофилов и базофилов проявляли интенсивную положительную реакцию. Гранулы имели округлую форму и желто-коричневую окраску (рис. 3). О низком содержании либо о полном отсутствии миелопероксидазы в лейкоцитах у цыплят сообщает ряд авторов [2, 9]. В отличие от млекопитающих установлена положительная реакция на пероксидазу цитоплазмы эритроцитов птиц, что в настоящее время вызывает затруднение в объяснении этого эффекта.
Гликоген. Содержание гликогена как основного энергетического субстрата является важным показателем, определяющим способности клетки в осуществлении его функций. Молекула гликогена не имеет фиксированной структуры и находится в состоянии постоянного обмена глю-козных остатков. Ее размер варьирует в зависимости от потребности клетки в глюкозе в данный момент.
Исследование гликогена в клетках крови птиц показало, что количество ШИК-положительно реагирующих гранул и степень интенсивности их окраски зависит от возраста и функционального состояния птицы. У суточных цыплят наблюдали мелкие, пылевидные, едва заметные в световой микроскоп красноватые зернышки в цитоплазме гранулоцитов и тромбоцитов. СЦК составлял всего 0,26±0,03 ед. (рис. 4). Около 12-14% гетерофилов крови, идентифицируемых по морфологической характеристике как палочковидные и юные гранулоциты, давали отрицательную реакцию, что является показателем функциональной незрелости этих клеток.
В процессе постнатального онтогенеза количество гликогена в лейкоцитах возрастало и к 60 суткам более чем в 2 раза превышало исходные показатели. Цитоплазма псевдоэозино-филов содержала ШИК-положитель-ные гранулы двух видов: четко очерченные редко расположенные темно-вишневые гранулы удлиненной формы и мелкие округлые зерна красновато-розового цвета (рис. 5).
У вакцинированного молодняка на
Рисунок 2. Положительная реакция на катионные белки двух псевдоэозинофилов. Прочный зеленый по Пигаревскому. х10, х100
0,8
0,7
0,6
Рисунок 3. Положительная реакция гранул эозинофила на пероксидазу. х10, х100
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
О
Р<0,05
*
А
1
7 14
□ интактные
60 сут.
21 30 45
□ вакцинированные
Рисунок 4. СЦК гликогена в псевдоэозинофилах периферической крови интактных и вакцинированных цыплят
21-е и особенно на 30-е сутки содержание гликогена было ниже, чем в контроле (Р<0,05). Именно к этому периоду жизни количество антигенных стимуляций живыми вирусвак-цинами возрастает до 5-6 обработок. К 45-60-суточному возрасту разница в содержании гликогена у привитой и интактной птицы не превышала 5-6%.
Лимфоциты крови цыплят первой недели жизни не содержали гликогена. На 14-21-е сутки после начала вакцинации 16-20% лимфоцитов содержали в цитоплазме гранулы гликогена. Считается, что наличие гликогена в цитоплазме лимфоцитов характерно для В-клеток [5]. Увеличение в крови этих клеток свидетельствует об иммунной перестройке, происходящей в организме привитой птицы. В эозинофилах наблюдали диффузное окрашивание цитоплазмы в красноватый цвет. При этом гранулы клеток давали ШИК-отрицательную реакцию. Интенсивность окраски цитоплазмы эозинофилов с возрастом и при антигенных раздражениях достоверных изменений не претерпевала. Гранулы базофилов всегда были ШИК-негативными.
Незначительные запасы гликогена в лейкоцитах крови птиц раннего постнатального возраста свидетельствуют о слабых потенциальных способностях к фагоцитозу, зависящих от имеющегося в клетке энергетичес-
Рисунок 5. Гранулы гликогена в цитоплазме псевдоэозинофила.
ШИК-реакция. х10, х100
кого субстрата. Количество гликогена в псевдоэозинофильных гранулоцитах птиц на порядок меньше, чем у млекопитающих, что подтверждается работами ряда авторов [2, 9].
Выводы 1. Низкий уровень лизосомаль-но-катионных белков и гликогена, отсутствие миелопероксидазы в клетках, отвечающих за фагоцитарные реакции, свидетельствуют о низкой естественной резистентности организма птиц раннего постнатального возраста.
Изменения метаболической активности лейкоцитов птиц при действии вирусвакцин носят разнонаправленный характер. Небольшие антигенные стимуляции активируют синтез и накопление катионных бел-
Ветеринария
ков и энергетического субстрата в воздействия ведут к снижению уров- что является потенциально опасным
гетерофилах периферической крови, ня гликогена и ЛКБ в этих клетках в с точки зрения развития иммунопа-
тогда как многократные антигенные определенные моменты жизни птицы, тологических состояний.
Литература
1. Бережная Н. М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз. Киев : Наук. думка, 1988. 192 с.
2. Болотников И. А., Конопатов Ю. В. Практическая иммунология сельскохозяйственной птицы. СПб. : Наука, 1993. 208 с.
3. Кадричева С. Г., Савченко А. А. Метаболическая реакция лимфоцитов на воздействие биологически активных веществ in vitro // Гомеостаз и экстремальные состояния организма : тез. докл. XI Междунар. симп. Красноярск, 2003. С. 62-63.
4. Карпуть И. М. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных. Минск : Ураджай, 1986. С. 20.
5. Хейхоу Ф. Г. Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М. : Медицина, 1983. 320 с.
6. Пигаревский В. Е., Мазинг Ю. А. Лизосомально-катионный тест : методич. письмо. Ленинград, 1987. 13 с.
7. Кокряков В. Н. Катионные белки лизосом нейтрофильных гранулоцитов при фагоцитозе и воспалении // Вопросы медицинской химии. 1990. № 6. С. 13-16.
8. Коровин Р. Н., Зеленский В. П., Грошева И. А. Лабораторная диагностика болезней птиц : справочник. М. : Агропромиздат, 1989. С. 244-245.
9. Egami M., Sasso W. S. Topochemistry of blood cells of the Gallus domesticus (Aves, Galliforme) // Rev. Bras. Biol. 1991. Feb. 51 (1).
СПОСОБ ЦЕЛОСТНОЙ ФИКСАЦИИ КОМПЛЕКСА ОРГАНОВ У МЕЛКИХ ЖИВОТНЫХ С СОХРАНЕНИЕМ ТОПОГРАФИИ И ПОСЛЕДУЮЩИМИ КОМПЛЕКСНЫМИ МОРФОЛОГИЧЕСКИМИ
ИССЛЕДОВАНИЯМИ
Ю.М. МАЛОФЕЕВ,
доктор ветеринарных наук, профессор, Л.В. ТКАЧЕНКО, кандидат ветеринарных наук,
В.Н. ТАРАСЕВИЧ, аспирант, Алтайский ГАУ
B.К. КОНОВАЛОВ,
доктор медицинских наук, профессор,
C.В. ТЮТЮННИКОВ,
доктор медицинских наук, профессор, Алтайский ГМУ, Алтайский край
Ключевые слова: способ целостной фиксации, легкие, мелкие животные.
Изучение взаимосвязи органов, составляющих отдельные комплексы (органы грудной и брюшной полости, дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта и т.д.), невозможно без сохранения их анатомической взаимо-расположенности (топографии) и целостности. Так, например, нельзя отпрепарировать брыжейку не нарушая топографию кишечника [1].
Известен метод Брунетти [2, 3, 4, 5]. Наиболее близким по своей технической сущности являются методы:
- изготовления замороженных анатомических препаратов по Пирогову [6];
- изготовления пластинчатых патологоанатомических препаратов по Та-лалаеву [7];
- изготовления микропрепаратов [8].
Метод Брунетти предназначен для
изготовления демонстрационных препаратов. Он заключается в том, что сосуды органа или целого трупа (небольшого) вначале промывались водой, а затем спиртом. Для удаления жира через сосуды пропускался сернистый эфир. Далее вся система орга-
на наполнялась танином, который играл роль дубильного вещества. После этого через сосудистую систему органа пропускался сухой подогретый воздух, благодаря которому орган высушивался изнутри. В результате препараты выставлялись без банок, в полусухом состоянии, имели объемную форму, были эластичны и подвижны. Такой способ автор использовал для демонстрации фрагментов тела: торсы человека или кисти рук и т.д.
Недостатки:
1) возможность использования способа лишь для демонстрации органов и фрагментов тел;
2) хотя органы сохраняли натуральную величину, но теряли свою микроскопическую структуру;
3) процесс приготовления препаратов весьма сложен.
Метод Пирогова - заморозка отдельных фрагментов тела и его горизонтальный распил. Очевидным плюсом является возможность визуализации топографии органов, что давало точное и наглядное представление о
строении тела человека. Кроме того, распилы красивы и точны.
Недостатки:
1) взаиморасположение органов можно было увидеть лишь в плоском виде и на ограниченном фрагменте;
2) дальнейшие гистологические исследования при данном методе не предполагались.
Метод изготовления пластинчатых патологоанатомических препаратов по Талалаеву: из свежего нефиксированного органа вырезалась тонкая пластинка, которая фиксировалась и обрабатывалась по методу Кайзеринга [9]. После фиксации пластинка отжималась и проводилась через 96-процентные спирты. Далее производилась заливка в уксуснокислый агар. Препарат закладывался между двумя стеклами.
Недостатки:
1) возможность использования способа лишь для макроскопической демонстрации фрагмента ткани органов;
2) отсутствие возможности изучить микроскопическую структуру;
3) процесс приготовления препаратов сложен.
Цель исследований
Разработать способ целостной фиксации комплекса (с сохранением топографии) органов у мелких животных с последующими комплексными морфологическими исследованиями.
Материалы и методы исследований
В соответствии с поставленной целью необходимо было исследовать легкие и региональные лимфатические узлы кролика возраст - 1 год;
Method of integral fixation, lungs, small animals.
