CC BY
40
© Коллектив авторов, 2009 УДК біб. 153. 9б -097-078. 33
функциональные особенности нейтрофильных гранулоцитов при введении интактных липосом
А.А. Борздов, О.В. логвиненко, И.Ю. Борздова, В.И. Ефременко Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Проблема направленного транспорта лекарственных и лечебно-профилактических средств в пораженные болезнью органы, ткани и клетки макроорганизма вызывает особый интерес исследователей в последние десятилетия. С целью увеличения времени нахождения медикаментозного средства в организме и направления его в определенные области с преодолением анатомических барьеров или в клеточные системы препараты подвергают различным химическим модификациям. Иногда лекарственные препараты конъюгируют с векторами и системами, способствующими их доставке к заданным органам и тканям.
Многие из этих задач удается решить при включении лекарств в липосомы и последующем их введении в организм.
В связи с тем, что мембрана бислойных липидных везикул конструируется практически из тех же молекул, которые составляют структуру клеточных мембран организма, липосомы обладают такими важными свойствами, как химическая инертность, универсальность, биосовместимость, биодеградируемость, в них практически отсутствуют токсические и антигенные свойства, в ответ на их введение организм не проявляет аллергических реакций [5].
При оценке действия различных липосомаль-ных лекарственных препаратов важно учитывать возможные изменения функционального состояния органов и тканей макроорганизма под влиянием липосом. Однако в специальной литературе практически отсутствуют данные об изучении комплексного влияния интактных липосом на показатели естественного иммунитета макроорганизма.
Борздов Александр Анатольевич,
гл. специалист научно-производственной лаборатории чумных вакцин.
Тел.: (8652) 32-58-23. E-mail: ciborg1982@mail.ru
Процесс фагоцитоза является основным звеном неспецифической защиты организма от воздействия различных факторов окружающей среды. Фагоцитарную функцию осуществляют клетки мезодермального происхождения - полиморфноядерные лейкоциты и моноядерные фагоциты. Дефект механизма фагоцитоза определяет предрасположенность организма к тяжелым рецидивирующим инфекционным заболеваниям [6, 10]. Нарушение функций нейтрофильных гранулоцитов крови, являющихся активными фагоцитами, является одной из причин летального исхода при бактериальных инфекциях. Наоборот, благоприятный исход при многих заболеваниях наблюдается в результате выраженного фагоцитарного ответа. Зависимость фагоцитоза от физиологического состояния организма представляет собой реальную основу для использования фагоцитарных реакций в качестве индикатора для оценки состояния естественного иммунитета организма.
Помимо фагоцитарной функции, нейтрофилы активно участвуют в метаболических процессах, протекающих в организме.
В норме большинство нейтрофилов пребывает в инертном, покоящемся состоянии. Подобно другим лейкоцитам, их функциональные возможности раскрываются только на фоне стимулирующего воздействия. К наиболее ярким проявлениям реактивности зрелого нейтрофила относятся перестройка организма метаболизма, миграция, адгезия и т.д. В принципе один и тот же стимул способен индуцировать все или часть реакций нейтрофила. Стимуляция радикально меняет метаболический профиль нейтрофила.
Нейтрофилы содержат два основных типа гранул - азурофильные и специфические, которые различают по морфологии, гистогенезу, биохимическому составу. В гранулах нейтрофилов идентифицируют большое количество компонентов - миелопероксидазу, кислые гидролазы, эстеразы, неферментные катионные белки и т.д.
%
7сут 14сут 21сут 28сут
— • -Спонтанный — - - Контроль спонтанный
-----Индуцированный -----Контроль индуцированный
Рис. 1. Фагоцитарная активность нейтрофи-лов крови при введении интактных липо-сом.
Высвобождение биологически активных веществ из гранул составляет важный этап реализации эффекторного потенциала нейтрофила [1, 6]. Для оценки функционально-метаболических изменений в нейтрофилах крови используют цитохимические методы исследования. Благодаря относительной простоте исполнения, доступности эти методы получили широкое распространение.
В литературе встречаются данные об использовании функционально-метаболической активности нейтрофилов для диагностики иммунологического статуса организма, оценки тяжести протекающих в организме бактериальных и вирусных инфекций [9].
Целью проведенного исследования явилось изучение влияния интактных липосом на факторы естественной резистентности организма, включающие фагоцитарную активность нейтро-фильных гранулоцитов, а также определение ми-елопероксидазной (МПО) активности и содержания лизосомальных катионных белков (КБ).
Материал и методы. Липосомы, состоящие из фосфатидилхолина и холестерина в весовом соотношении 9:1, получали методом «ручного встряхивания» [2]. В опыте использовали беспородных белых мышей массой 18-20 г каждая, выращенных в питомнике ФГУЗ «СтавНИПЧИ». Животным вводили однократно перорально взвесь интактных липосом и исследовали иммунологи-
Рис. 2. Содержание катионных белков в нейтрофилах крови белых мышей при введении интактных липосом.
ческие показатели путем забора крови на 7, 14, 21 и 28 сутки. Контролем служили интактные белые мыши.
Для изучения поглотительной активности микрофагов крови животных использовали тест, основанный на регистрации количества клеток способных к поглощению объектов фагоцитоза. Учитывались все типы фагоцитирующих клеток (нейтрофилы, эозинофилы, моноциты). В качестве объекта фагоцитоза использовали пекарские дрожжи, предварительно тщательно отмытые в физиологическом растворе. Реакцию проводили в спонтанном и индуцированном состояниях. Для стимуляции полиморфноядерных лейкоцитов использовали пирогенал коммерческий. Приготовленные мазки фиксировали в метиловом спирте и окрашивали Азуром II и эозином К. Подсчет проводили в 100 клетках, потенциально способных к фагоцитозу.
При выявлении лизосомальных КБ использовали метод, предложенный В.Е. Пигаревским [8]. В местах наличия катионных белков отмечалось окрашивание гранул в зеленый цвет. Миелопе-роксидазу определяли по методу Р. Лилли [4]. Активность пероксидазы выявлялась в клетках миелоидного ряда в виде желтовато-коричневых гранул.
Содержание КБ и уровень МПО в нейтрофилах крови определяли полуколичественным методом с последующим определением среднего цитохимического показателя. Основой метода является определение степени интенсивности реакции по количеству окрашенного вещества цитоплазмы. При иммерсионной микроскопии мазков определяли степень интенсивности окраски в 100 клетках (нейтрофилах), затем подсчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК):
СЦК = 3а + 2б + 1в +0 100
Где цифры 3, 2, 1, 0 показывают степень интенсивности реакции (от +++ до 0), а буквы - число клеток с той или иной интенсивностью реакции. Цифра 100 в знаменателе указывает на число подсчитанных клеток.
Полученные данные обрабатывали по методике И.А. Ойвина [7] с определением показателей М (средних величин), т (их ошибок) и достоверности различий. Последний определяли с помощью критерия Стьюдента. При уровне статистической значимости Р<0,05 результаты считались достоверными. При определении информативности цитохимических показателей использовали метод, предложенный Т.Н. Копьевой и Л.В. Кактур-ским [3]. Информативность вычисляли только в отношении статистически достоверно различающихся признаков.
Результаты и обсуждение. Основной функцией нейтрофилов является фагоцитоз посторонней микрофлоры. Процесс фагоцитоза включает в себя несколько последовательных стадий
- активацию, адгезию, опсонизацию, поглощение объектов фагоцитоза, киллинг и переваривание.
В результате проведенных исследований было выявлено: фагоцитарная активность у интактных
СЦК
0,6 ■
0,4 ■
0,2 •
0 ---------------■---------------.--------------,
7 сут 14 сут 21 сут 28суг
— - - Контроль
- - - -Интактныелипосомы
Рис. 3. Активность МПО в нейтрофилах крови белых мышей при введении интактных липосом.
белых мышей составляла 85-87%, при использовании пирогенала - 92-95%.
Введение интактных липосом сопровождалось повышением фагоцитарной активности до 93-94% в спонтанном состоянии и до 96-98% - в индуцированном (рис. 1).
Уровень фагоцитарной активности нейтрофи-лов крови белых мышей в спонтанном и индуцированном состояниях при введении липосом был достоверно выше, чем у интактных животных. Для оценки функциональной активности нейтрофи-лов были изучены наиболее важные представители микробицидной системы, непосредственно участвующие в стадии киллинга фагоцитированных объектов - КБ и МПО.
В ходе исследования метаболической активности МПО и КБ в нейтрофильных гранулоцитах были получены следующие результаты. Средний цитохимический показатель КБ во все сроки наблюдения был значительно выше, чем в контрольной группе (0,81±0,07) (рис. 2). Достоверное увеличение активности МПО по сравнению с контролем (0,94±0,03) отмечали в отдаленные сроки наблюдения - 21-28 сутки - 1,16±0,07. На 7-14 сутки после введения липосом полученные цитохимические показатели были недостоверно выше, чем у интактных животных (рис. 3).
Заключение. Липосомы, мембрана которых построена из фосфатидилхолина и холестерина в весовом соотношении 9:1, полученные методом «ручного встряхивания» и имеющие размер 300-800 нм с удельным внутренним объемом 5 л/моль липидов, при введении per os белым мышам с суммарным количеством липидов ~ 35 мг преодолевают желудочно-кишечный барьер и оказывают длительное стимулирующее действие на иммунокомпетентные клетки (нейтрофилы), регистрируемое до 28 суток (срок наблюдения). При этом статистически достоверно возрастает уровень фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови белых мышей в спонтанном и индуцированном состоянии с одновременным повышением количества катионных белков и миелопероксидазы нейтрофилов, непосредственно участвующих в стадии киллинга фагоцитированных объектов.
Литература
1. Бережная, М.Н. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз / М.Н. Бережная. - Киев, 1988. - 192 с.
2. Ефременко, В.И. Липосомы / В.Н. Ефремен-ко. - Ставрополь, 1999. - 236 с.
3. Копьева, Т.Н. Определение диагностической информативности неспецифических морфологических признаков / Т.Н. Копьева, Л.В. Кактурский // Арх. патологии. - 1976. - №12.
- С.60-63.
4. Лилли, Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли. - Москва: Мир, 1969. - 645 с.
5. Лусс, Л.В. Роль иммуномодулирующей терапии в общеклинической практике / Л.В. Лусс, А.В. Некрасов // Иммунология. - 2000. - №5.
- С.34-38.
6. Маянский, А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. - Новосибирск: Наука, 1989. - 340 с.
7. Ойвин, И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований / И.А. Ойвин // Патологическая физиология.
- 1960. - №4. - С. 76-85.
8. Пигаревский, В.Е. К методике применения лизосомально-катионного теста в лабораторной диагностической практике / В.Е. Пигаревский, Ю.А. Мазинг // Лабораторное дело. - 1981. - №10. - С. 7-11.
9. Ракитина, Е.Л. Изучение факторов естественной резистентности у детей и взрослых при различной патологии / Е.Л.Ракитина // Сб. научн. тр. / Здоровье: социальные и медико-биологические аспекты исследования.
- Ставрополь, 2005. - С. 86-90.
10. Тотомян, А.А. Клетки иммунной системы / А.А. Тотомян, И.С. Фрейдлин. - СПб: Наука, 2000. - 231 с.
функциональные особенности нейтрофильных гранулоцитов при введении интактных липосом
А.А. БОРЗДОВ, О.В. лОГВИНЕНКО, И.Ю. БОРЗДОВА, В.И. ЕФРЕМЕНКО
Изучено влияние интактных липосом на факторы естественной резистентности организма, включающие фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов, миелопероксидазную активность (МПО) и содержание лизосомаль-ных катионных белков (КБ). Были использованы две группы белых мышей. Одной из них вводили однократно перорально взвесь интактных липосом. Иммунологические показатели определяли в крови на 7, 14, 21 и 28 сутки.
Выявлено, что интактные липосомы как неспецифические иммуномодуляторы влияют на изученные в эксперименте показатели естественной резистентности. Происходит увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов с одновременной (параллельной)активацией микроби-цидных систем клетки.
Ключевые слова: нейтрофильные грануло-циты, катионные белки, миелопероксидаза, фагоцитоз, липосомы, белые мыши
FUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF
NEUTROPHILIC GRANULOCYTES IN
THE CASES OF INTACT LIPOSOMES INJECTION BORZDOV A.A., LOGVINENKO O.V. IBORZDOVA I.Y., YEFREMENKO V.I.
The intact liposomes effect on the factors of natural resistance including phagocytic activity of neutrophilic granulocytes, mieloperoxidase activity and concentration of lysosomal cationic proteins was studied in white mice. Immunologic parameters were assessed on 6, 14, 21 and 28 day in the control group and after peroral application of intact liposomes suspension in the main group of mice.
The nonspecific immunomodulatory effect of intact liposomes was established. Increasing of neutrophils phagocytic activity with simultaneous activation of microbicidal cell systems was detected.
Key words: neutrophilic granulocytes, cationic proteins, mieloperoxidase, phagocytosis, liposomes, white mice
