CC BY
37
© Коллектив авторов, 2008 УДК 576.8.097.3-577.125
ОЦЕНКА иммуногенности интактных липосом по показателям гуморального и клеточного ИММУНИТЕТА
А.А. Борздов, О.В. Логвиненко, И.Ю. Борздова, В.И. Ефременко Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Способность липосом обеспечивать доставку лекарств внутрь клетки предопределяет их успешное использование при лечении многих заболеваний, в том числе и инфекционных. Высокая эффективность действия биологически активных веществ на уровне клетки и всего организма определяется их стабильностью при введении в организм, избирательной направленностью на клетки-мишени, способностью взаимодействовать и проникать через клеточные мембраны, отсутствием побочных действий [1]. Широкое использование липосом в качестве носителей лекарств обеспечивается уникальностью их совокупных свойств (отсутствие токсичности, иммуногенности, аллергических свойств и др.) и способностью пролонгировать действие заключенных в них веществ с доставкой последних внутрь клеток [7].
Липосомы сходны по составу и структуре с мембранами эукаритических клеток и практически не вызывают иммунный ответ против себя. В структуру их мембран или во внутреннюю полость удается инкапсулировать без химической модификации большинство лекарственных препаратов независимо от их молекулярной массы, природы и свойств.
Липосомальная форма лекарственных препаратов позволяет снизить их токсичность и продлить действие внутри организма, предохраняя лекарственные вещества от воздействия агрессивной физиологической среды.
Способность липосом определенным образом взаимодействовать с клеточными мембранами различных органов и тканей организма обеспечивает возможность внутриклеточной доставки заключенных в них лекарственных веществ, которые при традиционном применении практически не могут преодолеть клеточный барьер. В зависимости от состава мембраны липосом процесс их биодеградации в организме с высвобождением иммобилизованных в них лекарств может продолжаться длительное время, что обеспечивает пролонгированное биологическое действие этих медикаментов. Для липосомальных лекарственных форм характерно резкое снижение токсичных свойств, в связи с чем становится возможным эффективное использование многих препаратов, имеющих ограниченное применение из-за высокой токсичности.
Все это предопределяет значительный интерес к получению новых липосомальных лекарственных средств, к изучению их биологического и фармакологического действия.
Существует много путей введения лекарств в организм животных и человека и все они приемлемы для липосомальных форм. Липосомы довольно быстро поглощаются клетками ретикулоэндотелиальной системы, что делает эти клетки и содержащие их внутренние органы возможными мишенями для направленной терапии с помощью липосомальных лекарственных препаратов [2].
Введенные в организм липосомы, нагруженные лекарственным средством, взаимодействуют с мембранами клеток мононуклеарной фагоцитарной системы и, связываясь с ними, передают клетке лекарственный препарат.
Вступая в различные взаимоотношения с клетками макроорганизма, подвергаясь биодеградации, компоненты бислойной мембраны липосом активно включаются в метаболические процессы, вызывая определн-ные изменения иммунологических, биохимических показателей и функционального состояния отдельных органов и систем организма в ответ на введение липидных везикул.
При оценке действия различных липосомальных лекарственных препаратов важно учитывать способность интактных липосом активно влиять на клеточные и гуморальные факторы иммунитета. Однако многие механизмы их влияния на иммунную систему до конца еще не изучены. В специальной литературе практически не освещен вопрос об изменении показателей естественного иммунитета макроорганизма при влиянии интактных липосом.
Клетки приобретенного иммунитета представлены главным образом лимфоцитами. Главная особенность лимфоцитов как клеток иммунной системы состоит в том, что они являются носителями рецепторов и маркеров, расположенных на клеточной мембране. Рецепторы предназначены для специфического распознавания всего разнообразия антигенных раздражителей, встречаемых макроорганизмом. Они имеют различный нуклеотидный состав и разную молекулярную конфигурацию.
Лимфоциты при световой микроскопии выглядят
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА, № 3, 2008
ед. комплемента
300
250 -200 -150 -100 -
7сут — контроль
14 сут
интактные липосомы
21 сут
28сут
Рис. 1. Изменение общего комплемента в сыворотке крови белых мышей при введении интактных липосом.
однородно, но они гетерогенны по плотности, способности к электрофоретической подвижности, продолжительности жизни и т.д., представляют собой две большие популяции - Т-лимфоцитов и В-лимфо-цитов. Т- и В-лимфоциты различают при помощи моноклональных антител, направленных к антигенным маркерам этих клеток. Маркеры, характеризующие различные субпопуляции клеток иммунной системы, обозначаются символом CD. CD-маркеров на сегодняшний день обнаружено более 160.
Популяция Т-лимфоцитов несет на поверхностной мембране маркер cDз, который ассоциирован с ан-тиген-распознающим рецептором Т-клеток. Маркер CD4 находится на поверхности Т-хелперов, является корецептором для связи антиген-распознающего рецептора с мононуклеарной системой. Т-клетки с цитотоксической активностью несут на поверхности маркер CD8 с функцией корецептора для связи анти-ген-распознающего рецептора с мононуклеарами. Маркер CD19 локализован на В-клетках, является компонентом их корецепторного комплекса [3, 8, 9]. Комплемент относится к наиболее древней форме иммунитета - врожденной системе взаимосвязанных белков, действующих по принципу «ферментного каскада», принимающих участие в том числе в процессах приобретенного иммунитета [3].
Целью исследования явилась оценка влияния интактных липосом на показатели клеточного (субпопуляции Т-лимфоцитов) и гуморального (комплемент, В-лимфоциты) иммунитета.
Материал и методы. Липосомы, состоящие из фосфатидилхолина и холестерина в весовом соотношении 9:1, получали методом «ручного встряхивания». Полученные липидные везикулы имели размер 300-
количество клеток
50 •
45 ■
40 ■
35 •
30 ■
25 30 15 ■
10 •
5 -
14 сут
----интактные липосомы
7сут --- контроль
21 от
28суг
800 нм с удельным внутренним объемом 5 л/моль липидов. В опыте использовали беспородных белых мышей массой 18-20 г каждая, выращенных в питомнике ФГУЗ «СтавНИПЧИ». Животным вводили однократно перорально 1,0 мл взвеси интактных липосом с суммарным количеством липидов “35 мг и исследовали иммунологические показатели путем забора крови на 7, 14, 21 и 28 сутки. Контролем служили интактные белые мыши.
Реакцию комплемента проводили в 1% агарозном геле с использованием коммерческого комплемента, нативных эритроцитов барана и коммерческой гемолитической сыворотки [6]. Диаметр кольца лизиса эритроцитов барана учитывали при помощи линейки для серологических реакций.
Лимфоциты выделяли в градиенте плотности фиколл-верографин [4]. При определении клеток, экспрессирующих CD+ антиген, использовали Fits conjugate производства Coltag laboratories.
Полученные данные обрабатывались статистически по И.А. Ойвину [5].
Результаты и обсуждение. В эксперименте изучали уровень общего комплемента в крови беспородных белых мышей при введении интактных липосом. Интактные липидные везикулы вызывали повышение уровня комплемента в сыворотке крови эксперимен-
количество клеток
27 *
26 -25 -24 -23 -22 -21 •
Рис. 2. Изменение количества 0D3+ клеток при введении интактных липосом.
7 сут 14 сут 21 сут 28сут
--- контроль
--- интактные липосомы
Рис. 3. Изменение количества 0D4+ клеток при введении интактных липосом.
тальных животных во все сроки наблюдения. Максимальные числовые значения общего комплемента определялись на 7 сутки после введения липосом (246,5±25,6) по сравнению с контрольной группой (175±20,4).
В последующие сроки прослеживалась тенденция к постепенному снижению показателя, однако в экспериментальной группе уровень общего комплемента превышал значения контроля.
Введение интактных липосом также сопровождалось увеличением количества клеток, экспрессирующих CD3+ антиген, на 7 сутки до 38-41%, на 14 сутки - 46,4-47,6% по сравнению с контролем (38%). Через 28 суток от начала введения интактных липосом количество CD3+ клеток достоверно не отличалось от данных в контрольной группе животных (34-37%).
На 7 сутки отмечалось увеличение количества CD4+ клеток (25-27%) по сравнению с данными контроля (21,3-24,3%). К 14 дню после введения липидных везикул происходило уменьшение количества CD4+ клеток до 22,4-23,7%, однако к 21 суткам количество CD4+ клеток снова незначительно увеличивалось (до 24%) и в последующие сроки наблюдения оставалось в пределах контрольных величин.
Одновременно отмечалось недостоверное снижение количества CD8+ лимфоцитов по сравнению с контролем и CD19+ клеток (В-лимфоциты) по сравнению с результатами, полученными в контрольной группе
животных.
Заключение. Показано, что интактные липидные везикулы при однократном пероральном введении повышали уровень некоторых клеточных (CD3+ и CD4+), и гуморальных (комплемент) факторов иммунитета, однако не оказывали заметного влияния на уровень CD8+ клеток (клеточный иммунитет) и CD19+ клеток (гуморальный иммунитет).
Литература
1. Абрамов, К.С. Некоторые аспекты направленного транспорта лекарств в организме с помощью полимерных нано- 8. частиц / К.С. Абрамов, И.Н. Скидан, А.Е. Гуляев // Клинич. исслед. лекар. средств в России. - 2001. - №2. - С. 18-21.
2. Ефременко, В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине) / В.И. Ефре- 9. менко. - Ставрополь, 1999. - 263 с.
3. Зарецкая, Ю.М. Иммунология и иммуногенетика чело-
века /Ю.М. Зарецкая, Е.Г Хамаганова, М.И. Губарев.
- Москва, 2002. - 135 с.
Иммунология // Пер. с англ. Под ред. У Пола. - М.: Мир, 1987. - Т1. - 476 с.
Ойвин, И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований / И.А. Ойвин // Патологическая физиология. - 1960. - №4. - С. 76-85.
Пастер, Е.У. Иммунология, практикум / Е.У. Пастер, В.В. Овод, В.К. Позур, Н.Е. Вихоть. - Киев: Высшая школа, 1989. - 302 с.
Хворостов И.Н. Экспериментальное фармакологическое и токсикологическое изучение липосомальных форм антибиотиков группы аминогликозидов. - Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Волгоград, 2001. - 18 с.
Чередеев, А.Н. СD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий / А.Н. Чередеев, Н.К. Горина, И.Г. Козлов // Клиническая и лабораторная диагностика.
- 1999. - №6. - С. 25-32.
Яришин, А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой ответа / А.А. Яришин // Иммунология. - 1999. - №1. - С. 17-24.
ОЦЕНКА ИММУНОГЕННОСТИ ИНТАКТНЫХ
ЛИПОСОМ по показателям гуморального
И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА
А.А. БОРЗДОВ, О.В. ЛОГВИНЕНКО,
И.Ю. БОРЗДОВА, В.И. ЕФРЕМЕНКО
Проведена оценка влияния интактных липосом на показатели клеточного (субпопуляции Т-лимфоцитов) и гуморального (комплемент, В-лимфоциты) иммунитета. Реакцию комплемента проводили в 1% агарозном геле с использованием коммерческого комплемента, нативных эритроцитов барана и коммерческой гемолитической сыворотки. При определении клеток, экспрессирующих CD+ антиген, использовали Fits conjugate производства Coltag laboratories.
Показано, что интактные липосомы способствовали повышению уровня общего комплемента в сыворотке крови экспериментальных животных во все сроки наблюдения с максимальными значениями показателей на 7 сутки после введения. Одновременно отмечалось увеличение количества определяемых Т-лифоцитов и, прежде всего, клеток экспрессирующих CD3+ и CD4+ антигены. Изменение количества CD8+ и CD19+ клеток было недостоверным.
Ключевые слова: липосомы, комплемент, Т- и В-лимфо-циты
INTACT LIPOSOMES IMUNNOGENITY ESTIMATION ACCORDIG TO PARAMETERS OF HUMORAL AND CELLULAR IMMUNITY
BORZDOV A.A., LOGVINENKO O.V.,
BORZDOVA I.YU., EFREMENKO V.I.
The influence estimation of intact liposomes on parameters of cellular (T-lymphocytes subpopulations) and humoral (complement, B-lymphocytes) immunity is carried out. Complement reaction is carried out in 1 % agarous gel with use of commercial complement, of the ram’s native erythrocytes and commercial hemolytic serum. At definition of expressing CD+ antigen cells, Fits conjugate of Coltag laboratories manufacture is used.
It is shown, that intact liposomes promoted increase of the general compliment level in experimental animals’ blood serum in all terms of supervision with maximal values of parameters for 7 day after introduction. The increase in quantity of determined T-lymphocytes and, first of all, of expressing cD3 + and CD4 + antigenes cells was simultaneously marked. Change in quantity of CD8 + and CD19 + cells was doubtful.
Key words: liposomes, complement, T-and B-lymphocytes
