CC BY
41
выявило ее увеличение относительно актуальной. Значения азотфиксирующей активности находились в пределах от 0,49+0,01 нМ N2/1- ч (по ручью) до 2,64+0,03 нМ Ы2/г ч (в пруду). Изучение процесса потенциальной денитрифицирующей активности исследуемых проб показало, что максимальная эмиссия закиси азота была зафиксирована в пробе на выходе термальных вод 340,8+2,0 нМ Ы20/ г сут. Минимальная денитрифицирующая активность наблюдалась в осадках ручья, вниз
по изливу - 50,4+1,0 нМ К30/г сут.'
Результаты, полученные по потенциальным скоростям изучаемых процессов, показывают, что азотфиксация и денитрификация в источнике Горячинск протекают параллельно, т.е. в одних и тех же точках наблюдалось либо повышение, либо снижение скоростей этих процессов. На основании этих данных можно предположить, что в данной экосистеме поддерживается баланс азотсодержащих соединений.
ЮОО 100 10 1
o.t 0.01
- —---
ГОР-1 Гор-З ГОр-4- гор-s [
♦ - - ........ - ■ "
■-лф.нмигч —ддо.нммготч
-с02. им сог/ г*
Рис, 2. Потенциальные скорости эмиссии С02, азотфиксации н денитрификации
Таким образом, полученные данные по численности микроорганизмов цикла азота, по определению интенсивности азотфиксации и денитрификации свидетельствуют об активно протекающих процессах круговорота азота в исследуемой экстремальной экосистеме щелочного термального источника Горячинск.
Литература
1. Кузнецов С.И,, Саралов А.И., Назина Т.Н. Микробиологические процессы круговорот углерода к азота в озерах. - М.: Наука, 1985. -213 с,
2, Степанов А.Л., Лысак Л,В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии: учеб,-метод. пособие. - М.: МАКС Пресс, 2002. - 88 с.
ДД. Балданова, А.В.Брянская
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИАНОБАКТЕРИЙ СОДОВО-СОЛЕНЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ
Из содово-соленых озер Забайкалья была выделены пять культур цианобактерий, изучена их морфология и таксономия. Полученные результаты наказали, что цианобактерии являются одной из доминирующих групп планктона и бентоса большинства озер Забайкалья. В изученных озерах были обнаружены ранее не отмеченные виды и мор-фотипы цианобактерий. На основе морфологических и филогенетических данных культуры Суа1 и Суа2 отнесены к роду ОзсШаюг^а.
D.D. Baldanova, A. V. Bryanskaya
MORPHOLOGYCAL AND TAXONOMYCAL CARACTERIZATION OF CYANOBACTERIA SODA-SALT LAKES OF TRANSBAIKALIA
Five cultures of cyanobacieria from soda-salt takes of the Transbaikalia were isolated The morphology and taxonomy of its cultures were investigated. The received results have shown that cyanobacieria are one of dominating groups of a plankton and benthic the majority of lakes of Transbaikalia. New species and morphotypes of cyanobacieria was found. On the basis of morphological and phylogenetic data the cultures CyaI and Cya2 are carried to genera Oscillatoria.
62
Бапданова Д.Д., Брянская A.B. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИАЛО-БАКТЕРИЙ СОДОВО-СОЛЕНЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ
Содово-соленые озера широко распространены в аридных зонах нашей планеты. Они представляют собой уникальные экосистемы, в которых экстремально высокие значения рН сочетаются с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих (Sadler et al., 1980; Vreeland et al, 1980). Такие озера являются местом активной деятельности алкало-фильных микроорганизмов, в том числе цианобактерий (Заварзин 1993), которые выступают основными продуцентами органического (Андреюк и др., 1990; Дубинин и др., 1995; Заварзин, Жилина, 2000),
До недавнего времени работа с цианобак-териями проводилась только с использованием классических методов, однако к настоящему моменту уже сделано немало работ по изучению цианобактерий с использованием молекулярно-генетических методов. Основная проблема, затрудняющая исследование цианобактерий более подробно, - это выделения аксеничных культур. Первым этапом, без которого не возможно выделение чистых культур цианобактерий, является изучение их экологии и видового разнообразия в природных условиях.
В ряде озер Байкальского региона ранее были изучены видовое разнообразие и экофи-зиология цианобактерий (Содовые озера..., 1991, Бочка, 1995, Брянская, 2002), вместе с тем ряд особенностей их экологии, физиологии и разнообразия изучен не полностью.
Целью настоящей работы было определение видового состава, экологии и экофизиоло-гии цианобактерий содово-соленых озер Забайкалья.
Методы исследования
Физико-химические параметры воды озер были определены стандартными методами (Намсараев и др., 2005). В момент исследования озера Хилганта и Горбунка были пересохшими. Химический анализ воды проводили из прикопок глубиной до 60 см, в которых со временем появлялась вода. Накопительные культуры выращивали на модифицированной минеральной среде Кастенхольца (Балданова, Брянская, 2006). Определение видового состава цианобактерий проводили по морфологическим признакам с использованием отечественных определителей (Еленкин, 1949; Гол-лербах и др., 1953). Выделение чистых культур проводили методом повторных пересевов с жидких сред на агаризованные.
Культивирование цианобактерий проводи-
ли в условиях лабораторного люминостата в непрерывном режиме при температуре 20-25°С. Рост культур отмечали визуально и по изменению оптической плотности клеточных суспензий. Биомасса (прирост) измерялась в относительных единицах на спектрофотометре Cecil 1021 при длине волны 540 нм. Удельную скорость роста бактериальных культур рассчитывали в соответствии с моделью Рос-со (Rosso et. all, 1995).
На молекулярно-генетическом этапе работы был разработан модифицированный протокол по выделению и очистке ДНК цианобактерий, который показал наибольшую эффективность по сравнению с имеющимися протоколами (Ausubel et. al., 1994; Coombs, Franco, 2003).
Для установления филогенетического положения штаммов анализированы нуклеотид-ные последовательности фрагментов генов 16S рРНК длиной примерно от 350 до 1500 нуклеотвдов.
Гея 16S рРНК амплифицировали со специфичным цианобактериальным праймером CYA359f (GGGGAATTTTCCGCAATGGG) и универсальным эубактериальным праймером I492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT). ПЦР проводили на приборе GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, США). Продукты ПЦР разделялись в 1% агарозном геле с добавлением этидиум бромида в камере для электрофореза в 0,5 кратном буфере TBE.
Определение нуклеотндной последовательности генов 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckraan Coulter, США) в соответствии с предлагаемой фирмой инструкцией.
Филогенетический анализ. Для нахождения близкородственных организмов нуклео-тидные последовательности генов 16S рРНК сравнивали с последовательностями типовых штаммов по рибосомальной базе данных (RÜBII - http://rdp.cme.msu.edu) и банка генов национального центра биологической информации [NCB1 - http://www.ncbi.nlm.nih.gov]. Последовательности генов 16S рРНК выравнивали с помощью программы CLUSTALX [Thompson et al., 1994]. Построения филогенетических деревьев производили с помощью пакета программ TREECON [Van de Peer and De Wächter, 1994].
Результаты и обсуждепие Физико-химические характеристики озер Исследованные озера являлись мелковод-
63
ными водоемами, максимальная глубина которых не превышала 10 м. Озера имели относительно малую площадь (2,1-12 км2). Температура воды озер в летнее время находилась в пределах от 17 до 34°С. Диапазон значений минерализации воды в озерах находился в широких пределах от 7,5 (оз. Сульфатное) до 128 г/л (оз. Хилганта). Озера Горбунка и Хил-ганта характеризовались нейтральными значениями рН (7,5), озера Ехэ Тором и Сульфатное - щелочными (8,4 и 9,1 соответственно). Содержание карбонатов в исследованных озерах не превышало 30,6 г/л (оз. Тором), минимальное - 1,02 г/л (оз. Сульфатное). Наибольшее количество гидрокарбонатов (3,70 г/л) выявлено в озере Горбунка, наименьшее (0,09 г/л) - в оз. Сульфатное.
Видовой состав цианобактерий Всего в исследованных экосистемах обнаружено 37 видов, разновидностей и форм цианобактерий, наибольшее их количество зарегистрировано в озерах с низкой минерализацией: Сульфатное (8 вид), наименьшее - в озере с высокой минерализацией Горбунка (1) (табл. 1).
Ведущим является класс
Ноггг^опюрЬусеае, включающий большинство видов (16), одним видом представлен класс С11гоососсорЬусеае. По разнообразию видового состава следует выделить роды РНоптсИит (6 видов), ОясШшопа (2 вида) и АпаЬаепа (2 вида). Другие роды были представлены одним видом.
Таблица 1
Таксономический спектр цианобактерий исследованных содово-соленых озер Забайкалья
Таксоны Водоемы
1 2 3 4
АпаЬаепа variabilus f. ternis Popova +
A. sibirica (Popova et Degt) Elenk, + +
Gloeocapsa minuta {Kûtz.)Hollerb.Ampl. +
Microcoleus chthonoplastes (FI. Dan.) Thur. +
Nos toc sp. +
Oscillatoria brevis (Kilts.) Gom. + +
Os. iacustris (Kleb.) Geitl. -r
Phormidium frigidum Fritsch. + +
Ph. komarovii Anissima sp.now. +
Ph. tenue (Menegh.) Gom +
Ph. molle (Kutz.) Gom. + +
Ph. tenxissimum Woronich. +
Ph. sp. +
Всего 8 4 4 1
Примечание: 3 - оз. Сульфатное, 2 - оз. Хилганта, 3 - оз. Тором, 4 - оз. Горбунка
По литературным данным, для Забайкалья описано 276 видов и разновидностей Cyanophyta, Наши исследования позволяют дополнить списки цианобактерий еще 8 широко распространенными, но ранее не отмеченными видами. Таким образом, с учетом наших данных в водоемах Байкальского региона описано 284 таксона цианобактерий.
В результате подробного изучения данной группы организмов были выявлены некоторые особенности их морфологии и экологии. Виды рода Gloeocapsa не являются широко распространенными и, хотя чаще развиваются в почвах и минеральных источниках, Gloeocapsa minuta впервые была обнаружена в щелочном озере Тором. Oscillatoria brevis и Os. lacusîris также были выявлены впервые.
Отмеченные виды РЬоптсИит широко распространены в содово-соленых водоемах. Однако РНогт1в.\ит /^¡Ыит, часто встречавшийся в исследуемых водоемах, предыдущими исследователями выявлен не был, Мгсгосо1еш сЫ\юпор1а$Хе8 широко распространен в содовых водоемах, поэтому его нахождение в оз. Хилганта не удивительно.
Очевидно, что минерализация и активная реакция среды влияют на видовой состав цианобактерий, обусловливая преимущественное развитие тех или иных форм. Так, в озерах с высокой минерализацией нитчатые формы преобладали над одноклеточными. Следует отметить, что такое соотношение форм закономерно, так как нитчатые формы обладают большим количеством защитных свойств, та-
64
Богданова ДЛ, брянская A.B. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИАНОБАКТЕРИЙ СОДОВО-СОЛЕНЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ
ких как прочная клеточная стенка, дополнительные чехлы и т.д. Цианобактерии способны выдерживать широкий интервал солености, однако более интенсивно они развиваются в водоемах с невысокими значениями этого параметра.
Полученные нами данные расширяют представление о видовом разнообразии цианобактерий в содово-соленых водоемах Забайкалья и позволяют внести некоторые дополнения к морфологическому и экологиче-
скому описанию видов.
Морфологическая характеристика выделенных культур цианобактерий
В результате проведенных экспериментальных работ по выделению культур цианобактерий из матов содово-соленых озер Забайкалья (озера Сульфатное, Хилганта, Горбунка, Тором) было получено пять чистых культур (табл. 2)
Таблица 2
Список культур цианобактерий, выделенных нз содово-соленых озер Забайкалья
Штамм Культура Водоем
Суа) Oscillatoria brevis Оз, Сульфатное
Суа 2 О. brevis Оз. Тором
Суа 4 Phormidium frigidum Оз, Сульфатное
Суа5 Anabaena variabilis Оз. Хилганта
Суаб A. variabilis Оз. Горбунка
Культуры (штаммы) Суа1 и Суа2 были выделены из разных озер и по морфологическим характеристикам соответствовали ОзсПШопа Ьге\>и (К.й1з.) вот. Однако имелись некоторые отличия между штаммами: Суа1 не имел грануляций или грануляция появлялась со временем, длина клеток меньше ширины до 4-х раз (1,25 мкм), тогда как у Суа2 длина клеток меньше ширины до 2-х раз (2,5 мкм); у Суа1 часто наблюдались двояковогнутые клетки более темного цвета, чем основные; конечные клетки у Суа2 удлиненные и закругленные. Возможно, эти два штамма представляли собой разные формы этого вида.
Культура (штамм) Суа4, выделенная из низкоминерализованного и щелочного озера Сульфатное, по морфологии была идентична РкоггтШит /п§1с1ит РгЬзсЬ. Но имелись некоторые расхождения от стандартного вида: размеры клеток варьировали от боченкооб-разных до удлиненных, длина которых немного превышала ширину.
Культуры (штаммы) Суа5 н Суаб были выделены соответственно из оз. Хилганта и Горбунка. В результате микроскопирования штаммы были отнесены к виду АпаЬаепа тпаЫШ. Клетки Суа5 в большинстве случаев суженные, конечная клетка закругленная, ге-тероцисты одиночные, расположены в сере-
дине трихомов. Суаб характеризовался наличием спор, которые встречались очень редко, шаровидные, 6,25 мкм в диаметре, с гладкой бесцветной оболочкой, расположены вне связи от гетероцистами.
Таким образом, из изученных содово-соленых озер Забайкалья были обнаружены и выделены в культуры ранее не отмеченные виды и морфотипы цианобактерий.
Таксономическая характеристика выделенных культур цианобактерий
Филогенетический анализ выделенных культур проведен на основе генов 16S рРНК. Рестрикционные профили генов I6S рРНК показали близость культур Cyal и Суа2 на видовом / родовом уровне (рис. 1). Для определения их филогенетического положения была выбрана культура Суа 2.
Амплификация и секвенирование гена 16S рРНК проводилась с помощью специфичных цианобактериальных праймеров. В результате анализа было установлено, что культура Суа 2 имела 99,2% сходства no 16S рРНК с Phormidium sp. NIVA-CYA 202 и 98,6-98,9% сходства с Oscillatoria sp. Ant-G27, Oscillatoria sp. Ant-Salt, Phormidium lumbricale UTCC 476, Phormidium' sp. Ant-Brack-3, Phormidium pseudopristleyi ANT.ACEV5.3 (табл. 3).
65
На основе морфологических признаков и филогенетических данных культуры Суа1 и Суа2 отнесены к роду ОзсШаЮпа. Обнаруженный кластер, включающий около 10 фи-
логенетически близких культур (рис. 2), может явиться перспективной моделью для изучения вопросов таксономии рода ОзсШаЮш,
Рис. 1. Реетрикционные профили штаммовСуа! н Суа2
Таблица 3
Наиболее близкие организмы штамму Суа2 (иа основе анализа генов 16в рРНК)
Штамм Ближайшие родственники (% по 16S рРНК сходства) Номер в GenBank Публикации
СуаЗ Phormidium sp. N1VA-CYA 202 (99.2%) Oscillatoria sp. Ant-Gl7 (98.9%) Oscillatoria sp. Ant-Salt (98.9%) Phormidium sp.Ant-Brack-3 (98.9%) Phormidium lumbricale UTCC 476 (98.6%) Phormidium pseudopristleyi ANT.ACEV5.3 (98.9%) CyalO* (89.0%) Z82794 AF263334 AF263334 AF263332AF21 8375 AY4°3600 Rudi et al. (1997) Madeau et al. (2001) Nadeauetal. (2001) Nadeau et al. (2001) Casamatta et al. (2005) Taton et al. (2006); Nadeau et al. (2001)
Примечание: * - штамм СуаЮ не рассматривадся в данной работе.
Из таблицы 3 видно, что уровень сходства Суа2 с СуаЮ находятся на межродовом уровне (~89.0%) или же входят в один род, чо далекие друг от друга виды (межвидовой уровень). Т.к. представители семейства Рзеис1апаЬаепасеае им=ют с Суа2 и СуаЮ сходства - 86%. при лом входит в другое семейство, можно предположить, что Суа2 и СуаЮ представляют разные роды ОвсШаОпа и РЬоппоёшт соответственно.
В «езультате филогенетического анализа выделенных культур было установлено, что штаичы Суз1 и Суа2 на 98,9% являются
представителями рода ОБсПЫопа, что подтверждает принадлежность этого штамма к роду ОзсПЫопа на основе морфологических данных.
Полученные результаты показали, что цианобактерии являются одной из доминирующих групп планктона и бентоса большинства озер Забайкалья. В изученных озерах были обнаружены ранее не отмеченные виды и морфотипы цианобактерии. На основе морфологических признаков и филогенетических данных культуры Суа! и Суа2 отнесены к роду ОзсИШог1а.
66
БаддановаДЛ, Брянская A.B. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИАНО-ЕАКТЕРИЙ СОДОВО-СОЛЕНЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ
0Л2
Ö3_
100
Phorrniditm эр.АА-Виск-З - Phirmktsjm ktmbncalt UTCC476 Osciliacna sp. Ant-Silt Oicitbfariasp. Art-Gl7 Fharrmäumpiojdcprisfíeyi ANT AC EV 5.3 i i- Phcrmidium ¡p. HIVA-CVA 2D2
^ as [
Cy*2
^j^r' Oíd 11 atoria acuminata
Phcrmidium ef. tertbnfcrmis KR2003/23
-О sei liatoría utneta PCC 751J
PharmiAun murrey i АНТ. ACH Vi. 2
-MíTOíJoJteie cWfBMqpTiasto PCC7420
г— PhsrmSdiim jp. UTCC 4g7 Ö3U— Oidttcfvria cf. laetevimus Baja-Osc-l CyalO
Ii
■ QloedbacSer vidaceic, РСС8Ш
' Qtcillateria maneta - Leptdyr&ya frigtta ANT .MANNING.!
-Leptoiyngya ayícrchca ANT.LHiS.I
lfm r LqXtfyngbya Hnenima UTCC 77 L Leptofyngiya on&otata UTCC 473
Рис. 2. Филогенетическое дерево, сконструированное на основе 16S рРНК, показывает положение культур Суа2 и СуаЮ, полученных из матов содово-соленых озер Байкальского региона в составе семейства Oscillatoriales. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые ЮОнуклеотидов. В качестве «внешней группы» использована нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК Gloebacter sp. PCC 8105
Литература
1. Еленкин А.А. Сииезеленые водоросли СССР. Специальная часть. - М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1949. -Вып.2. -С.990-1907.
2. Голлербах М.М., Косинская Е.К., Полянский В.И. Определитель пресноводных водорослей СССР, - М.: Советская наука, 1953. - Вып. 2, - 398 с.
3. Андреюк Е.И., Коптева Ж.П., Занина В.В. Цианобактерии. - Киев: Наук, думка. -1990. - 200 с.
4. Локоть Л,И, и др. Содовые озера Забайкалья. Экология и продуктивность / отв. ред. А.Ф. Алимов. - Новосибирск: Наука, 1991. - 214 с.
5. Заварзин Г.А. Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формиро-«аиия наземной биоты // Микробиология. - 1993. - Т.62. - С. 789-800.
6. Бочка А.Б. Водоросли водоемов Баргузинского биосферного государственного природного заповедника (Россия): автореф. дис,,, канд. биол. наук, - Киев, 1995. - 18 с.
7. Дубинин А.В., Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. Экофизиология и видовое разнообразие цианобактерии содового озера Магади// Микробиология. - 1995. - Т.64. - С. 845-849.
8. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н. Содовые озера - модель древней биосферы континентов // Природа. - 2000. -JK.-C.45-53.
9. Брянская А,В. Влияние экологических условий на видовое разнообразие и функциональную активность иианобактерий водоемов Южного Забайкалья: автореф. ... канд. биол. наук. - Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2002. - 22 с.
10. Нам сарае в Б.Б. Полевой практикум по водной микробиологии и гидрохимии: метод, пособие / Намсараев Е.Б., Горленко В,М„ Намсараев З.Б., Дагурова О.П., Бархутова Д.Д., Бурюхаев С.П., Хахинов В.В. / отв. ред. М.В, Вайншейн. - М.-Улан-Удэ: Изд-во Бурят, госун-та, 2005, - 68 с,
П. Балданова Д.Д., Брянская А.В. Экофизиология цианобактерий содовых озер Сульфатное и Тором (Южное Забайкалье) // Вестник БГУ. - 2006. - Сер. 2. - Вып. 8. - С. 73-78.
12. Sadler, М„ McAninch, М., Alico, R., Hochstein, L.I. The intracellular Na+ and K+ composition of the moderately halophilic bacterium, Paracoccus halodenttrificans //Can. J, Microbiol. -1980. - V.26.
13. Vreeland, R.H., Litchfield C.D., Martin E.L., Elliot E. Halomonas elongate, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria, It Int. J. Syst. Bacieriol, - 1980.- V.30. -P.485-495.
14. Ausubei F. H„ Brent R., Kingston R. E., Moore D. D„ Seidman J. G., Smith J. A. and Struhl K.. Current protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc. N.Y. - 1994.
15. Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. CLUSTIJL W: improving the sensitivity of progressive multiple
16. sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. - 1994. - V. 22. - P. 4673-4680.
17. Van de Peer Y and De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment //Comput Appl Biosci. - 1994. - V. 10. - P. 569-570,
18. Coombs J.T. and Franco C.M.M. Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat roots, // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - V. 69. - P. 5603-5608.
19. NCBI BLAST http:// www.ncbi.nim.nih.gov/blasl
67
