CC BY
100
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2011 БИОЛОГИЯ Вып. 1
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.26.262
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ОЗЕРА СОЛЕНОЕ (РЕСПУБЛИКА БУРЯТИЯ)
Д. В. Егороваа, Л. Н. Ананьина6, Л. П. Козыреваа, А. Г. Захарюка, Е. Г. Плотникова6
а Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, г. Улан-Удэ, Сахьяновой, 6; гїа-ria_ego@mail.ru
ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, г. Пермь, Голева, 13; info@iegm.ru; (342)280-84-31
Исследованы морфометрические и физико-химические параметры оз. Соленое (Кяхтинский район, республика Бурятия). На основе полученных данных озеро отнесено к содовым озерам с гидрокарбонатно-хлоридным типом вод. Методом ПЦР-ДГГЭ фрагментов генов 16S рРНК показано, что таксономический состав микробоценозов матов и поверхностного слоя илистых песков, с которых были отобраны маты, имеет высокий уровень сходства, и в то же время отличается от такового поверхностного слоя воды и прибрежного ила.
Ключевые слова: содовые озера; микробное сообщество; денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ); ген Ш рРНК.
Введение
Содовые и содово-соленые озера являются уникальными водными экосистемами, характеризующимися высокой концентрацией солей и щелочными рН, ограничивающими развитие эукари-отных организмов, но являющихся благоприятными для развития прокариот (Заварзин, Жилина, Кевбрин, 1999). В Бурятии в степных и лесостепных районах с резко континентальным климатом распространены мелководные озера с минерализацией от нескольких грамм до нескольких десятков грамм на литр (Минеральные воды..., 1962). Исследование разнообразия микробных сообществ представляет значительный интерес для понимания функционирования содовых озер как отдельного типа экосистем (Намсараев, Бархутова, 1998; Заварзин, 2007). Применение классических микробиологических (культуральных) методов позволяет охарактеризовать лишь малую долю микробного разнообразия. Все более широкое использование молекулярно-генетических методов, в том числе и для решения задач микробной экологии, значительно расширяет знания о микробном разнообразии и позволяет проводить оценку функциональных возможностей микробных сообществ.
Цель данного исследования - изучение физикохимических свойств и микробных сообществ различных экотопов содового озера Соленое (Бурятия).
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлось содовое озеро Соленое (координаты 50о35'75.7" с. ш. 105° 44'22.8" в. д.), расположенное в Кяхтинском районе Республики Бурятия в долине реки Киран на высоте 612 м над уровнем моря, в 30 км восточнее г. Кяхты. Озеро относится к непересыхающим озерам Забайкалья и характеризуется как рапное, карбонатное, с большой примесью хлоридов, иловое. Площадь водного зеркала составляет 0.36-1 км2, глубина достигает 3 м (Минеральные воды..., 1962; Солоноватые и соленые., 2009).
Отбор проб проводили в июне 2010 г. Для исследований были взяты пробы воды и донных отложений (по горизонтам), ила и илистых песков с береговой линии, цианобактериальных и пурпурных матов. Схема отбора проб приведена на рис 1.
Изучение физико-химических свойств
образцов воды, донных отложений
В полевых условиях определение морфометрических характеристик и физико-химических параметров воды в местах отбора проб проводили с помощью портативных приборов и титрованием. Г лу-бину определяли эхолотом Connect Fisherman 120 (Китай). Кислотность среды (рН) измеряли рН-метром (HANNA instruments, Румыния), значения
© Егорова Д. В., Ананьина Л. Н., Козырева Л. П., Захарюк А. Г., Плотникова Е. Г., 2011
55
общей минерализации оценивали при использовании тестер-кондуктометра DIST 2 (Румыния), содержание кислорода - оксиметром Oxi 3151^ЕТ (Германия). Концентрацию карбонат- и гидрокарбонат ионов определяли титриметрическим методом (Резников, Муликовская, Соколов, 1970). Определение основного катионно-анионного состава воды выполнено в аналитическом подразделении ИОЭБ СО РАН, с использованием известных методов (Аринушкина, 1970). Сульфиды определяли фотометрически с ^№-диметил-иара-фенилендиа-мином (ДМП) (Тгарег, Schlegel, 1989). Содержание органического углерода в навеске донного осадка определяли методом мокрого сжигания по Тюрину И.В. в модификации Никитина Б.А. (Аринушкина, 1970). ’
Ю илистый песок 3
донные отложения Рис. 1. Схема отбора проб, озеро Соленое (Бурятия)
Методы выделения ДНК
Препараты суммарной ДНК из отобранных проб выделяли с помощью коммерческих наборов «ДНК-сорб» (AmpliSens biotechnologies, Россия) и «AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit» (Axygen Bioscinces, США) в соответствии с протоколами производителей.
Денатурирующий градиентный гель-
электрофорез (ДГГЭ)
Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали праймеры: 27F (5'-AGAGTTTGAT-CMTGGCTCAG-3’), включающий 40 п.н. GC-хвост
(5' -CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCC-GCCGCCCCCGCCCG-3) на 5 -конце, и 518R (5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3) (Tiirola et al., 2002). Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал по 0.25 мМ каждого из дНТФ, по 0.3 мкМ каждого праймера, 1.5 мМ MgCl2, 1х ПЦР буфер для 7ад-полимеразы («Силекс», Россия) и 2 ед. акт. 7ад-полимеразы («Силекс», Россия). Процедура ПЦР включала начальный денатурирующий шаг при 95оС в течение 5 мин. и 30 циклов - 30 с при 94оС, 1 мин. при 55оС и 3 мин. при 72оС; затем этап элонгации при 72оС в течение 10 мин. Амплификацию проводили в термоциклере My Cycler («Bio-Rad Laboratories», США).
Разделение ампликонов методом ДГГЭ выполняли в 6% (в/об) полиакриламидном геле, содержа-
щем линейный денатурирующий химический градиент от 40 до 60%, где 100% составляет 7М мочевина и 40% формамид согласно протоколу (Muyzer, de Waal, Uitterlinden, 1993). Электрофорез проводили в течение 13.5 ч. при 55 V и температуре 60оС на приборе DcodeTM Universal Mutation System («Bio-Rad Laboratories», США). Полученные гели окрашивали в растворе бромистого этидия (0.5 мкг/мл) в течение 15 мин., далее промывали в деионизированной воде на протяжении 10 мин. Затем гели визуализировали в проходящем УФ-свете и документировали при использовании системы Gel Doc XR («Bio-Rad Laboratories», США).
Расчет коэффициента сходства между образцами и построение дендрограммы методом невзвешенного парногруппового метода (UPGMA) осуществляли с помощью пакета программ TreeconW версия 1.3 (van der Peer, De Wachter, 1994).
Результаты и их обсуждение
Морфометрическая и гидрохимическая
характеристика оз. Соленое
В момент отбора проб температура воды на поверхности озера составляла 25.6°С. Вода на поверхности характеризовалась значениями рН 9.77 и минерализацией 9.27 г/дм3. С увеличением глубины рН и минерализация увеличивались (таблица). Максимальное содержание растворенного кислорода выявлено в поверхностных и подповерхностных слоях воды. Содержание карбонатов и гидрокарбонатов варьировало по глубине озера. Максимальные значения (1.8 г/дм3 СО32- и 1.22 г/дм3 НСО3-) зафиксированы в придонных слоях воды. Наивысшее содержание сульфат-ионов (315 мг/дм3) зарегистрировано на глубине 0.5 м (таблица). Содержание углерода органического вещества в прибрежных иловых осадках составило 7.5%. Определенные значения отличаются от измеренных в озере ранее (Солоноватые и соленые..., 2009). За последние 5 лет отмечено увеличение общей минерализации воды озера почти в два раза главным образом за счет увеличения концентрации хлоридов. В это же время произошло уменьшение площади и глубины озера. Так, максимальная глубина, измеренная в 2004 г., достигала 3 м. В июле 2008 г. она составила около 2 м. В момент наших исследований (июнь 2010 г.) максимальная глубина была 1.8 м. Изменения морфометрических характеристик озера вызваны наблюдающимся в регионе 34-летним циклом изменений годовой суммы атмосферных осадков, включающим «сухую» и «влажную» фазы. Начиная с 1999 г. в регионе наблюдается тенденция к снижению годовой суммы атмосферных осадков, сопровождающаяся к тому же более высокой температурой воздуха в теплый период, чем в аналогичный период предыдущего цикла (Обязов, 2007). Следст-
вием уменьшения площади и глубины озера явля- ется испарительное концентрирование солей.
Гидрохимическая характеристика воды оз. Соленое
Глубина, м рн ОМ, мг/дм3 SO42-, мг/дм3 Cl-, мг/дм3 Na+, мг/дм3 CO32-, мг/дм3 HCO3-, мг/дм3 О2, мг/дм3
0 9.77 9270.5 135.0 37б5.5 3380 1400 400 5.9
0.5 9.7б 9091.1 315.0 3524.5 3200 1200 б10 б.0
1.0 9.95 10б07.9 285.0 412б.9 3200 1б00 1200 5.7
1.5 9.88 11402.4 135.0 4428.2 3б00 1800 1220 4.1
1.8 9.81 10179.5 135.0 3524.5 3300 1800 1220 1.9
Примечание. «ОМ» - общая минерализация.
В колонке отбора проб донных отложений озера (глубина 14 см) определено вертикальное распределение сероводорода по горизонтам. Максимальное количество сульфид-ионов (250.74 мг/см3) зафиксировано на глубине 6 см. В нижних слоях донных осадков содержание сероводорода изменяется незначительно.
Микробоценоз оз. Соленое
Наличие органических и минеральных веществ в водной толще и осадках содового оз. Соленое благоприятствует развитию умеренно галоалкалофиль-ных бактерий различных таксономических и физиологических групп, в том числе фототрофных организмов, которые вносят значительный вклад в циклы основных биогенных элементов, поскольку являются главным источником органического вещества (Заварзин, 2007). Исследуемое озеро примечательно тем, что с юго-восточной стороны береговой зоны отмечено образование бентосных обрастаний (цианобактериальных матов) на поверхности илистых песков и иловых отложений. Формирование тонких эфемерных матов в содовых озерах Забайкалья встречается часто (Namsaraev et al., 2008). Как было показано ранее, организмами эдификато-рами в них являются цианобактерии родов Lepto-lyngbya, Phormidium и Oscilatoria (Цыренова, Нам-сараев, Брянская, 2009). В отобранных матах оз. Соленое доминирующими видами являлись нитчатая Oscillatoria brevis и одноклеточная Gloeocapsa minuta, кроме них выявлены Gl. lithophila, Gl. turgi-da, Gl. vacuolata, Ph. frigidum, Aphanothece elobens, Nodularia harviyana, Spirulina major. На поверхности черного сероводородного ила в береговой зоне наблюдается развитие матов пурпурного цвета, образованных пурпурными бактериями.
Несмотря на многолетние исследования микробного сообщества оз. Соленое, таксономический состав микроорганизмов, обитающих в озере, был описан далеко не полностью, поскольку ранее апеллировали данными, полученными с помощью методов классической микробиологии. Исследование морфологического разнообразия клеток в микрокосмах, применение культуральных методов на сегодняшний день позволило охарактеризовать лишь малую долю микробного разнообразия этого водного объекта (Митыпова, 2007, Цыренова, Намсараев,
Брянская, 2009; Колосов, Захарюк, Козырева, 2009). В настоящей работе для изучения микробоценозов различных экотопов (воды, илов, песка, матов) оз. Соленое впервые был применен ПЦР-ДГГЭ метод, основанный на разделении амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК в химическом денатурирующем градиенте и позволяющий охарактеризовать таксономический состав сообщества при условии, что количество полос на фореграмме соответствует числу таксонов бактерий (Muyzer, de Waal, Uitterlinden, 1993). Проведено исследование проб матов желтого, зеленого и пурпурного цветов, илистых песков и донных отложений, отобранных вблизи мест отбора матов, а также поверхностного слоя воды озера. При проведении ДГГЭ было установлено, что образцы отличались по числу таксономических групп бактерий, поскольку количество полос варьировало от 6 до 10 (рис. 2, А). Наибольшим значением этого критерия характеризовался образец поверхностного слоя воды, наименьшим -образец мата желтого цвета. Бентосные обрастания разного цвета (маты) отличались по данному параметру: желтый мат — 6 групп, зеленый и пурпурный — 7 групп. Исследуемые пробы отличались не только по количеству представленных в них таксонов, но и по составу. Так, в образцах илистого песка присутствовал один уникальный фрагмент 16S рДНК, который не был обнаружен в других образцах, в то время как в пробах поверхностного слоя воды и прибрежного ила таковых было выявлено три и два, соответственно.
Последующий анализ полученных характерных ДГГЭ-профилей полос проводили с помощью невзвешенного парногруппового метода кластерного анализа (рис. 2, Б). Как видно из рис. 2, Б, таксономический состав бактерий зеленого и пурпурного матов был идентичным, но отличался от такового желтого мата, уровень сходства составил 94.2%. На дендрограмме маты формировали отдельный субкластер. Выявлен высокий уровень сходства таксономического состава бактерий матов и поверхностного слоя илистого песка, который был равен 88.3%. Фингерпринты проб поверхностного слоя воды и прибрежного ила проявили низкий уровень сходства с пробами матов и илистого песка 53.0% и 58.9%, соответственно, и образовали отдельные ветви на дендрограмме. Полученные результаты указывают на высокое сходство таксо-
номического состава бактериальных сообществ матов и поверхностного слоя илистых песков, с которых были отобраны маты, и его отличие от поверхностного слоя воды и прибрежного ила.
что, вероятно, связано с физико-химическими характеристиками отобранных проб (насыщенность кислородом, рН, Н^ и т.д.).
0.4 -I—
0.3 —I—
0.2
—I—
0.1
-4—
12 3 4 5 6
А Б
Рис. 2. Схема электрофореграммы разделения фрагментов 168 рДНК (А) и дендрограмма сходства
ДГГЭ-профилей фрагментов 168 рДНК (Б):
1 - мат желтого цвета, 2 - мат пурпурного цвета, 3 - мат зеленого цвета, 4 - поверхностный слой илистого песка, 5 - прибрежный ил, 6 - поверхностный слой воды
Заключение
Содовые озера представляют собой уникальные экосистемы, в которых высокие значения рН сочетаются с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих. Исследование микробных сообществ содовых озер мира выявило таксономическое разнообразие функциональных групп, принципиально различающихся в отношении использования органического вещества (ОВ) и свободного кислорода: продуцентов ОВ (цианобактерий и пурпурных бактерий); деструкторов (консументов), включающих аэробных и анаэробных органотрофных бактерий; вторичных анаэробов, замыкающих циклы углерода и серы; бактерий «аэробного фильтра», окисляющих газы биогенного и абиогенного происхождения. В этом отношении содовые озера Забайкалья изучены в меньшей степени и требуют проведения дополнительных исследований.
Настоящая работа является продолжением многолетних исследований таксономического состава и функционирования микробных сообществ содовых озер Забайкалья. Объектом исследований служило озеро Соленое (Кяхтинский район, республика Бурятия), которое по физико-химическим параметрам было отнесено к содовым озерам с гидрокарбонатно-хлоридным типом вод. Настоящая работа явилась началом исследований микро-боценоза озера Соленое с применением молекулярно-биологических методов, в том числе ПЦР-ДГГЭ фрагментов генов 168 рРНК. На основе анализа ДГГЭ-фингепринтов оценен таксономический состав микробных сообществ разных экото-
пов озера Соленое. Планируется продолжение начатых исследований.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований №10-04-01185-а.
Библиографический список
Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Изд-во МГУ, 1961. 481 с. Заварзин Г.А. Алкалофильное микробное сообщество // Тр. ин-та микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. 2007. Вып. XIV. С. 58-87. Заварзин Г.А. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Алкало-фильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие // Микробиология. 1999. Т. 68, № 5. С. 579-599.
Колосов Р.В., Захарюк А.Г., Козырева Л.П. Морфологическое разнообразие алкалофильных микроорганизмов в содовом озере Соленое (Республика Бурятия) // Вестн. Бурят. гос. унта. Сер. Биология. 2009. Т. 4. С. 92-94. Минеральные воды южной части Восточной Сибири. М.: Изд-во АН СССР, 1962. 200 с. Митыпова Т.Н. Разнообразие аэробных и факультативно-анаэробных органотрофных бактерий содово-соленых озер Забайкалья и Монголии: дис. ... канд. биол. наук, Улан-Удэ, 2007. 128 с. Намсараев Б.Б., Бархутова Д.Д. Содовые озера Южного Забайкалья - уникальные экосистемы // Экосистемы Южного Забайкалья: история изучения, оценка и проблемы сохранения биоразнообразия: материалы науч.-практ. конф. Улан-Удэ, 1998. С. 73-77.
Обязов В.А. Изменения температуры воздуха и увлажненности территории Забайкалья и приграничных районов Китая // Природоохранное со-
трудничество Читинской области (Российская Федерация) и автономного района внутренняя Монголия (КНР) в трансграничных экологических районах: материалы конф. Чита, 2007. С. 247-250.
Резников А.А. Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. Методы анализа природных вод. М.: Недра, 1970. 488 с.
Солоноватые и соленые озера Забайкалья: гидрохимия, биология / отв. ред. Б.Б. Намсараев. Улан-Удэ: Изд-во Бурят. ун-та, 2009. 340 с.
Цыренова Д.Д., Намсараев Б.Б., Брянская А.В. Таксономический спектр цианобактерий солоноватых и соленых озер Южного Забайкалья // Вестн. Бурят. гос. ун-та. Сер. Биология. 2009. С. 105-108.
Muyzer G., de Waal E.C., Uitterlinden A.G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59. P. 695-700.
Namsaraev B.B. et al. Evolutionary Aspects of Geo-
chemical Activity of Microbial Mats in Lakes and hydrotherms of Baikal Rift Zones // Biosphere Origin and Evolution / Editors N. Dobretsov, N. Kolchanov, A. Rozanov, G. Zavarzin. Springer Science; Business Media, LLC, 2008. P. 189— 201.
Tiirola M.A. et al. Isolation and characterization of Novosphingobium sp. strain MT1, a dominant po-lychlorophenol-degrading strain in a groundwater bioremediation system // Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. P. 173-180.
Truper H., Shlegel H.G. Sulphur methabolism in Thi-orhodaceae. Qualitative measurements on going cells of Chromatium okenii // J. Microbiol. And Serol. 1964. Vol. 30. P. 225-238.
van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Appl. Biosci. 1994. Vol. 10. P. 569-570.
Поступила в редакцию 10.11.2010
Physical-chemical properties and microbial diversity of lake Solenoe (Republic of Buryatia)
D. V. Egorova, PhD-student
Institute of General and Experimental Biology, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanovoi str., 6; ioeb@biol.bscnet.ru; (3012)419948 L. N. Anan’ina, candidate of biology, research scientist
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081, Perm, Golev str, 13; info@iegm.ru; (342)2808431 L. P. Kozyreva, candidate of biology, scientific secretary A. G. Zakharyuk, candidate of biology, research scientist
Institute of General and Experimental Biology, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanovoi str., 6; ioeb@biol.bscnet.ru
E. G. Plotnikova, doctor of biology, senior scientist
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081, Perm, Golev str, 13; info@iegm.ru
Morphometric and physical-chemical conditions of lake Solenoe (Kyakhtinskii region, Republic of Buryatia) were analyzed. Based on data obtained the lake was attributed to the soda lakes with hydro-chloride type waters. PCR-DGGE method of 16S rDNA fragments showed that the microbiocenosis taxonomic composition of microbial mat and surface layer of silty sand, from which they were selected possessed high level of similarity, and at the same time differed from those of surface water and coastal mud.
Key words: soda lakes; microbial community; denaturing gradient gel electrophoresis; 16S rRNA gene.
Егорова Дарья Васильевна, аспирант
ГУ РАН «Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН»
Ананьина Людмила Николаевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Козырева Людмила Павловна, кандидат биологических наук, ученый секретарь
Захарюк Анастасия Г еннадьевна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник ГУ РАН «Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН»
Плотникова Елена Генриховна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
