CC BY
39
УДК 578.322,347
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ РЕДКО ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ МОРФОТИПОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО И ПРОТЕЙНОГО ФАГОЛИЗАТОВ
© 2019 Е.О. Чугунова1, А.А. Зимин2, Н.Е. Сузина2
1 Пермский государственный аграрно-технологический университет им. академика Д.Н. Прянишникова 2 Институт биологии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино
Статья поступила в редакцию 04.03.2019
В статье представлен поиск бактериофагов редких морфотипов в фаговых лизатах, полученых внутри кишечника лабораторных животных. В сальмонеллезном и протейном фаголизатах, полученных таким методом обнаружены на ряду с хвостатыми фагами бактериофаги семейств Ino-viridae и Tectiviridae. Проведена морфологическая характеристика обнаруженных частиц. Частицы Inoviridae имели 600-1000 нм и толщиной около 35 нм. Частицы Tectiviridae имели 87,5 нм и ширину 80 нм. Частица имела толстую двойную оболочку толщиной - 12,5 нм. При этом толщина внешнего покрова составляла 7,5 нм, а толщина внутреннего покрова - 5 нм. Ключевые слова: Фаговый лизис внутри кишечника животных, Inoviridae, Tectiviridae нитчатые бактериофаги, фаголизат, бактерии рода Salmonella и Proteus.
ВВЕДЕНИЕ
По современной классификации фаги разделены на 3 отряда (порядка): Caudovirales, Mononegavirales, Nidovirales, 61 семейство, 214 родов и около 3600 видов. Около 96 % известных фагов принадлежит порядку Caudovirales - хвостатые фаги [1, 8].
В последние десятилетия появилось множество работ, посвященных обнаружению, выделению и изучению нитчатых фагов, принадлежащих к роду Inovirus семейства Inoviridae [3, 4]. Нитчатые фаги, широко распространенные среди бактерий, инфицируют широкий круг грамотрицательных бактерий разных родов - Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Xanthomonas, Vibrio, Thermus, Neisseria и др. [2, 11]. Наиболее изученные нитчатые фаги семейства Inoviridae - M13, f1 и fd, объединенные в группу Ff, поскольку инфицируют Escherichia coli, несущие F-пили а также вследствие зависимости процесса инфицирования от наличия F-плазмиды [4, 6, 15]. Нитчатые фаги сальмонелл уже нашли широкое применение в практике. На основе таких сальмонельных бактериофа-
Чугунова Елена Олеговна, доктор биологических наук, профессор кафедры внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства. E-mail: [email protected] Зимин Андрей Антонович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории моле-кулярноймикробиологии. E-mail: [email protected] Сузина Наталья Егоровна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории структурной адаптации микроорганизмов. E-mail: [email protected]
гов, например, сделан биосенсор для детекции патогенных сальмонелл в медицинских и санитарных пробах [1, 13, 16]. Такие бактериофаги имеют большую перспективу для получения живых вакцинных препаратов для вакцинации против различных инфекционных заболеваний как вирусной, так и бактериальной этиологии [2]. Нитчатые умеренные бактериофаги сальмонелл применяются и для конструирования интегративных векторов для эксперессии и клонирования целевых чужеродных генов в хромосому данной бактерии [3].
Нитчатые бактериофаги являются также тестерными биологическими объектами для испытания новых видов стерилизующих агентов, так как они могут являться переносчиками островков патогенности и, следовательно, необходимым объектом стерилизации [4]. В течение ряда десятилетий Г.- В. Аккерман из Канады проводил регулярное исследование фаголизатов сальмонелл и других бактерий для идентификации все новых морфологий этих вирусов [8]. В последнее время такие регулярные исследования не проводятся и заполнение этой бреши в мировых исследованиях кажется весьма интересным как с чисто научной, так и практической точек зрения.
Одним из наиболее редко обнаруживаемым семейством бактериофагов являются Tectiviridae. Эта группа содержит липиды в составе своей оболочки и обработка хлороформом, которую производят большинство исследователей фагов при выделении их из природы, исключает обнаружение липид-содержащих вирусов в таких пробах. Наиболее изученным объектом из
этой группы является бактериофаг PRD1 [10, 14]. Но и его достаточно редко обнаруживают в различных пробах из природы. Каких либо современных тест-систем для обнаружения этого бактериофага и родственных ему тетивирид по ДНК пока не разработано. Tectiviridae имеют достаточно характерную морфологию и их однозначно можно идентифицировать на снимках ТЭМ. С этой точки зрения описание новых морфологии представителей этой группы вирусов в различных пробах из природы также дает новые сведения исследователям о встречаемости этих бактериофагов, их взаимоотношениях с различными штаммами бактерий и другими подробностями их экологии.
Хотя в настоящее время для оценки степени родства между фагами используют анализ генома фага [5, 12] большую роль в понимании классификации и морфологии фагов играет трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Результаты ее лежат в основе морфологической (морфотипической) классификации бактериофагов. Данная классификация было предложена в 1960е годы А.Бредли [9] и А.С. Тихоненко [7] и используется в почти полной сохранности до настоящего времени.
Цель работы - получить и исследовать фа-голизаты различных сальмонелл и протея в кишечнике лабораторных животных; исследовать данные фаголизаты на наличие более редко встречающихся морфотипов бактериофагов и провести морфологическую классификацию частиц на фотографиях полученных с помощью негативного окрашивания на трансмиссионной электронной микроскопии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Среды. Для реализации поставленных задач использовали жидкие и твердые питательные среды. С целью получения сальмонеллезного фаголизата работали с забуференной пептон-ной водой (ЗПВ) и селенитовым бульоном (ООО «НПЦ «Биокомпас-С» » г. Углич Ярославской области (Россия)), средой для выделения протейных бактериофагов служил мясо-пептонный бульон (МПБ) (ФБУН «ГНЦ ПБМ», п. Оболенск Московской области (Россия)). Для работы с тест-штаммами микроорганизмов использовали висмут-сульфит агар (ВСА) и мясо-пептон-ный агар (МПА) (ФБУН «ГНЦ ПБМ», п. Оболенск Московской области (Россия)), биохимическую идентификацию штаммов бактерий осуществляли на микробиологическом анализаторе Multiskan FC (ThermoFisher Scientific Inc., Финляндия) с помощью тест-системы ЭНТЕРО-тест24Н, типизацию бактерий рода Salmonella проводили сыворотками сальмонеллезными О-комплексными и монорецепторными О- и
Н-агглютинирующими производства ФГУП «Курская биофабрика-«БИОК» (Россия).
Штаммы. При этом работали с типичными по культуральным, морфологическим, ферментативным и серологическим свойствам серотипами: S. Typhimurium, S. Infantis, S. Dublin, S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Virchow, S. Gallinarum-Pullorum, S. Hamburg и Proteus vulgaris, Proteus mirabilis.
Материалы. Для приготовления сред и буферов использовали российские реактивы квалификации хч и осх. Использовали фильтры Владипор марки МФАС-ОС-3 и МФАС-ОС-2 (Россия), для ультрафильтрации Millipore Millex-GP (США) и Corning (Германия).
Основная методика получения и ис-ледования фаголизатов. Методика. Для выделения изолятов фагов бактерий рода Salmonella и Proteus использовали белых лабораторных разнополых мышей массой 16-18 г (n = 22). Опыты, выполненные с использованием лабораторных животных, проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества - Европейской конвенции по защите животных (№86/609/ЕЕС, Страсбург, 1986) и Хельсинской декларации. Готовили суспензию суточной культуры соответствующих штаммов микроорганизмов в количестве 108МТ/мл и инокули-ровали белым мышам внутрибрюшинно по 0,5 см3. После гибели последних, отделяли тонкий и толстый кишечник и помещали его в жидкие питательные среды, соблюдая соотношение патологического материала и среды 1:10. Контрольной группе мышей внутрибрюшинно вводили по 0,5 см3 стерильного физиологического раствора. В качестве питательных сред использовали мясо-пептонный бульон (МПБ), забуференную пептонную воду (ЗПВ) и селенитовый бульон. При этом пользовались традиционными приемами обогащения по методу Адамса: пробы обогащали типичными по культуральным, морфологическим, ферментативным и серологическим свойствам бактериями родов Salmonella и Proteus в логарифмической фазе роста. Очистку фаголизатов от бактериальных клеток, эндотоксина и балластных веществ осуществляли осветляющей микрофильтрацией через мембраны Владипор марки МФАС-ОС-3 с размером пор 0,8 мкм, затем МФАС-ОС-2 с размером пор 0,45 мкм, которые представляют собой мелкопористый пленочный материал, изготовленный на основе смеси ацетатов целлюлозы. В итоге фаголизаты подвергали стерилизующей фильтрации с помощью фильтрующей насадки фирмы Millipore Millex-GP с поли-эфирсульфоновым наполнителем и диаметром пор 0,22 мкм.
Просвечивающая электронная микроскопия препаратов фагов. Морфологические особенности собственно фаговых частичек изучали в электронном микроскопе EM-1200EX (JEOL, Япония). Для подготовки образца лиза-та проводили дробное центрифугирование: на первом этапе осуществляли центрифугирование на центрифуге СМ-6 (ELMI Ltd, Латвия) в режиме 3000 об/мин в течение 15 минут, затем супернатант фильтровали с помощью мембранной насадки Corning (Германия) с диаметром пор 0,20 мкм. На заключительном этапе фаги осаждали центрифугированием со скоростью 15000 об/мин в течение 10 минут на центрифуге MiniSpin Eppendorf (Германия). 10 мкл подготовленного таким образом образца наносили на формваровую пленку-подложку, через 1 минуту жидкую фазу удаляли фильтровальной бумагой, не допуская полного высыхания поверхности подложки. Адсорбированные на пленке бактериофаги подвергали негативному контрастированию 1% незабуференным раствором урани-лацетата и микроскопировали при увеличении х50000. Полученные изображения использовали для морфометрического анализа выявленных морфотипов фагов. Для этого характеризовали форму и тип фага, измеряли его величину, а также размеры хвоста и диаметр головки.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По результатам ТЭМ нами была изучена морфология выделенных бактериофагов, фаго-подобных и вирусоподобных частиц. На основании полученных данных проанализированы семейства и морфотипы фагов по Бредли.
Известно, что вирионы нитчатых фагов представляют собой длинные тонкие спираль -но закрученные нити, внутри которых заключена циркулярно замкнутая однонитевая ДНК (ssDNA) [2]. Фагоподобные частицы, которые могут представлять собой бесхвостые бактериофаги, были обнаружены нами посредством ТЭМ в фаголизате, обогащенном сальмонеллами се-ротипа Choleraesuis. На снимке видны два объекта длиной 600-1000 нм и толщиной около 35 нм, по морфологии сходными с бактериофагами семейства Inoviridae морфотипа F1 (рис. 1).
По данным электронной микроскопии протейный фаголизат отличался неоднородностью и содержал фаги разных морфотипов и семейств. В частности были обнаружены фаги семейства Siphoviridae морфотипа В1 с и Podoviridae морфо-типа С3. Кроме вышеописанных и идентифицированных нами бактериофагов, в изучаемом лизате обнаружены вирусные частицы размером 100 х 110 нм, которые по своей морфологии могут быть отнесены к семейству Tectiviridae (рис. 2).
Рис. 1. Трансмиссионная электронная микроскопия фагового лизата Salmonella Choleraesuis. Частицы фагов семейства Inoviridae отмечены белыми стрелками. Увеличение х 30000. Масштабная линейка 200 нм. Контрастирование 1% уранилацетатом
100 нм
Рис. 2. Трансмиссионная электронная микроскопия фагового лизата Proteus spp. В центре снимка крупная вирусоподобная частица, сходная с фагами из семейства Tectiviridae. Увеличение Х 50000.
Масштабная линейка 100 нм. Контрастирование 1% уранилацетатом
Предполагаем, что на рисунке 2 изображен капсид фага из семейства Tectiviridae с хорошо визуализируемой внутренней мембраной, окруженной белковой оболочкой. Необходимо отметить, что определение семейства бактериофага,
изображенного на рисунке 2, опираясь лишь на анализ снимков ТЭМ, является сложной задачей. С одной стороны видно морфологическое сходство с представителями фагов семейства Tectiviridae, с другой стороны, диаметр капсида обнаруженных нами частиц ориентировочно в два раза больше, чем диаметр вириона бактериофагов данного семейства.
Кроме того, на одном из ТЭМ снимков была обнаружена округлая вирусоподобная частица довольно большого размера (рис. 3). Ее длина была 87,5 нм и ширина 80 нм. Частица имела толстую двойную оболочку толщиной - 12,5 нм. При этом толщина внешнего покрова составляла 7,5 нм, а толщина внутреннего покрова - 5 нм. Внешние покровы были разделены тонким промежутком. Можно однозначно сказать, что в форме частицы просматривается полигональ-ность. Можно предположить, что эта частица по форме представляет собой слегка вытянутый икосаэдр. Одна из вершин этого икосаэдра выглядит как отверстие, заткнутое подобием пробки, в форме усеченного конуса. Внутренняя камера частицы также имеет признаки полиго-нальности. Внутренняя камера содержит комок электронно- прозрачного вещества, занимающего примерно 2/3 камеры. Исходя из структуры
Рис. 3. Трансмиссионная электронная микроскопия фагового лизата бактерии Proteus spp. Округлая вирусоподобная частица бактериофаг из семейства Tectiviridae.
Обозначения на рисунке: ОВЧ - округлая вирусоподобная частица,; НО - наружная оболочка, ВО - внутренняя оболочка; ТП - тонкий промежуток между оболочками; ПВ - предполагаемая портальная вершина частицы, заткнутая белковой «пробкой»; КЭПВ - комок электронно- прозрачного вещества внутри камеры частицы
частицы можно предположить, что это частица вируса из семейства Tectiviridae. В этом случае отверстие в одной из вершин может служить для упаковки и выпуска ДНК из частицы. Вершина с отверстием у фагов семейства Tectiviridae при этом называется портальной вершиной. С достаточно большой долей уверенности можно говорить, что это бактериофаг родственный фагу энтеробактерий PRD1.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бактериофаги: биологическое и практическое применение / ред. : Э. Катер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир, 2012. - 640 с.
2. Ильина Т.С. Нитчатые бактериофаги и их роль в вирулентности и эволюции патогенных бактерий // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015. № 1. С. 3-10.
3. Использование нитчатого бактериофага М13 для целей белковой инженерии / А.А. Ильичев, О.О. Миненкова, С.И. Татьков и др. // Новые направления биотехнологии: Всесоюзная конференция: тезисы докладов. Пущино. 1988. С. 97-98.
4. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител / О.О. Миненкова, Н.В. Тикунова, В.В. Морозова // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2009. Т. 1. № 3. С. 22-31.
5. Молекулярное типирование (Rapid-анализ) ДНК-содержащих бактериофагов патогенных иерсиний / Л. В. Романова [и др.] // Бактериофаги. Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности: материалы международной научно-практической конференции / Ульяновская ГСХА им. П. А. Столыпина. Ульяновск, 2013. Т. 2. С. 60-63.
6. Фаговые пептидные библиотеки как источник адресующих лигандов / А.А. Немудрая, В.А. Рихтер, Е.В. Кулигина // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2016. - Т. 8. №1 (28). - С. 52-63.
7. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Наука, 1968. 90 с.
8. Ackermann H. W. Phages examined in the electron microscope // Arch. Virol. 2007. Vol. 152. P. 227-243.
9. Bradley D.E. The morphology and physiology of bacteriophages as revealed by the electron microscope // J. R. Microsc. Soc. 1965. Vol. 84. P. 257-316.
10. Lipid-containing viruses: bacteriophage PRD1 assembly / S.J. Butcher, V. Manole, N.J. Karhu// Adv Exp Med Biol. 2012. Vol. 726. Р. 365-377.
11. A novel, broad-range, СТХФ-derived stable integrative expression vector for functional studies/ B. Das, R. Kumari, A. Pant, S. Sen Gupta, S. Saxena, O. Mehta, G.B. Nair// J Bacteriol. 2014. Vol. 196 (23). Р. 4071-4080.
12. Jalasvuori M. Viruses are ancient parasites that have influenced the evolution of contemporary and archaic forms of life. Jyvaskula: University of Jyvaskula, 2010. 94 p.
13. Niyomdecha, S. Phage-based capacitive biosensor for Salmonella detection / S. Niyomdecha, W., Limbut, A. Numnuam, P. Kanatharana, R. Charlermroj, N. Karoonuthaisiri, P. Thavarungkul// Talanta. 2018.
Vol. 1(188). P. 658-664.
14. Characteristics of PRD1, a plasmid-dependent broad host range DNA bacteriophage / R.H. Olsen, J.S. Siak, R.H. Gray// J Virol. 1974. Vol. 14 (3). P. 689-699.
15. Oral Immunization of Rabbits with S. enterica Typhimurium Expressing Neisseria gonorrhoeae Filamentous Phage 06 Induces Bactericidal Antibodies Against N. gonorrhoeae Klyz / A.
Piekarowicz, M. Majchrzak, D.C.Stein// Sci Rep. - 2016. Vol. 4. P. 22546-22549. 16. Studies of inactivation of encephalomyocarditis virus, M13 bacteriophage, and Salmonella typhimurium by using a visible femtosecond laser: insight into the possible inactivation mechanisms / K.T. Tsen, S.W. Tsen, Q. Fu, S.M. Lindsay, Z. Li, S. Cope, S. Vaiana, J.G. Kiang// J Biomed Opt. 2011. Vol. 16 (7). P. 078003.
MORPHOLOGY OF BIOLOGY PARTICLES FROM SALMONELLA AND PROTEUS PHAGOLYSATIES
© 2019 E.O. Chugunova1, A.A. Zimin2, N.E. Suzina2
1 Perm State Agro-Technological University named after Academician D.N. Pryanishnikov 2 Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino
The article presents the search for bacteriophages of rare morphotypes in phage lysates obtained inside the intestines of laboratory animals. In the Salmonella and Proteus phagolysates obtained by this method, bacteriophages of the Inoviridae and Tectiviridae families were found along with the tailed phages. Conducted morphological characteristics of the detected particles. Particles of Inoviridae had 600-1000 nm and a thickness of about 35 nm. The Tectiviridae particles were 87.5 nm and 80 nm wide. The particle had a thick double shell with a thickness of 12.5 nm. The thickness of the outer cover was 7.5 nm, and the thickness of the inner cover was 5 nm.
Keywords: Filamentous bacteriophage, phagolysate, Salmonella spp., Proteus spp.
Elena Chugunova, Doct. Biol. Sci., Professor of Noninfectious Diseases, Surgery and Obstetrics Department. E-mail: [email protected]
Andrej Zimin, Cand. Biol. Sci., Senior Researcher of Molecular Microbiology Laboratory. E-mail: apollo66@ rambler.ru
Natalia Suzina, Cand. Biol. Sci., Senior Researcher of Structural Adaptation of Microorganisms Laboratory. E-mail: [email protected]
