CC BY
126
НОВОЕ В ПРИМЕНЕНИИ БАКТЕРИОФАГОВ
И.Г. Серегин1, А.Д. Флерова1, С.В. Линев2
'ФГУ Московский государственный университет прикладной биотехнологии ул. Талалихина, 33, Москва, Россия, 109316
^Всероссийской государственной научный контрольный институт Звенигородское ш., 5, Москва, Россия, 123022
В статье рассматривается процесс изучения возможности применения бактериофагов для предупреждения кантаминирования сальмонеллами фарша и готовых колбасных изделий.
Бактериофагами называют живые мельчайшие вирусоподобные частицы, способные изменять биологические свойства бактерий, в т.ч. такие, как наследственность и изменчивость. Честь открытия этого природного феномена принадлежит английскому бактериологу F.W. Twort, описавшему в 1915 году острую инфекционную болезнь стафилококков и возможность пассирования проходившего через бактериальные фильтры инфекционного агента.
Выделенные фаги могут быть охарактеризованы по морфологии вирионов и негативных колоний, антигенным свойствам, спектру литического действия, чувствительности к воздействию химических веществ и физических факторов, а также по характеристикам взаимодействия в системе «фаг — бактериальная клетка».
Первичная фаза взаимодействия бактериофага с бактерией — адсорбция — состоит из диффузии фаговых частиц в среде, их случайном столкновении с бактериями и специфическом прикреплении к поверхности бактериальной клетки.
На ход этого процесса влияют количественные соотношения между фагом и клеткой, физические и химические факторы среды, фагоустойчивость бактерий. Феномен бактериофаги протекает в нейтральной или слабощелочной среде (pH 7,4—7,6). Многие исследователи отмечают, что бактериофаги не адсорбируются на чувствительных бакклетках при pH ниже 5 или выше 12.
Фаг фиксируется и прикрепляется к бактериальной клетке в зависимости от своей природы, физиологического состояния и антигенной структуры самой клетки, их фаз роста и размножения. Для взаимодействия с рецепторами клеточной поверхности необходимо изменение конформации фибрилл.
Адсорбция фага состоит из обратимой и необратимой фаз. При необратимой ферментативной фазе закрепления фага наблюдается, что фаг не отделяется от клетки, не нейтрализуется антифаговой сывороткой. При этом его эффективность зависит от температуры, вязкости среды и других факторов.
Установлено также, что и микробы, и бактериофаги размножаются по времени логарифмически. Причем скорость накопления бактериофага значительно опережает скорость размножения микроба. Темп накопления остается постоянным для данного бактериофага. Скорость размножения фагов остается неизменной, их
концентрация будет увеличиваться с одинаковым постоянством при любых исходных его показателях. Конечная популяция фага в несколько раз выше максимальной численности популяции микробов. При инфицировании фагом в соотношении около 200 фагов на бактериальную клетку последняя лизируется и размножения фага не происходит. В таких случаях бактерии набухают, приобретают специфическую форму и постепенно исчезают под действием лизоцима фаговых отростков клеточной стенки бактерии. Так происходит другой тип литической реакции бактериофагами клетки-мишени (лизис извне). Бактериальная взвесь не всегда растворяется при очень высоких соотношениях между фагом и бактерией. Наиболее выраженную литическую активность отмечали при равных и меньших соотношениях бактериофага и бактериальной клетки-мишени. Литические ферменты фагов разнообразны — от одобных лизоциму до подобных гиалурони-дазе. Литические ферменты фага обуславливают растворение клеточной стенки, что обеспечивает гибель бактериальной клетки. Такая способность фагов определяет их большое практическое значение в борьбе с возбудителями различных болезней.
Установлено, что наиболее выраженная активность фага по отношению к бактериальной клетке отмечается при температуре 22—37 °C. При такой температуре за 60 минут количество живых бактерий кишечной палочки уменьшается на 91%, а через 90 минут все погибают. Лизис бактериальных клеток под действием фагов прекращается при температуре 70 °С и выше. Низкие температуры только снижают лизирующую активность фагов, но не прекращают их деятельность полностью.
Учитывая высокую лизирующую активность бактериофагов, многие исследователи применяли их для типирования возбудителя болезни в очагах сложной эпидемической и эпизоотической обстановки, для лечения и профилактики инфекционных болезней, для возбудителя которых были получены эти фаги.
В медицинской и ветеринарной практике применяют фаги, выделенные от переболевших сальмонеллезом животных и птиц, а также из сточных вод хозяйств, не благополучных в отношении этой болезни.
Бактериофаги для лечения животных и птиц а также для идентификации микроорганизмов, должны иметь титр не менее 10-7—10-8, и лизировать бактериальные культуры следует в течение 6—10 часов. Для производства бактериофагов обычно используют по несколько родов микроорганизмов соответствующих типов.
Фаги широко распространены в природе: в естественных условиях они находятся в тех природных субстратах, в которых обитают гомологичные бактерии. Особую социальную значимость в ветеринарной практике имеют патогенные сальмонеллы (Salmonella typhimurium, S.enteritidis и другие), с которыми связано возникновение более 80% случаев пищевых токсикоинфекций человека. Для борьбы с ними широко применяются сальманеллезные бактериофаги, выделить которые можно из сточных вод животноводческих ферм и боенских предприятий. Для выделения фагов мы использовали метод обогащения.
Исследуемый материал засевали в МПБ совместно со штаммами Б. 1урЫши-пиш и Б.е^егШ^, находящимися в логарифмической фазе роста, инкубировали 18—24 часа при температуре 37 °С. Пробы фильтровали через фильтры с пористостью 0,22 мк, затем определяли наличие фагов в безмикробных фильтратах, высевали их на жидкие и плотные питательные среды, предварительно засеянные индикаторными штаммами Б. 1урЫшипиш и Б. е^егШ^.
Поиск бактериофагов мы проводили в сточных водах различных мясоперерабатывающих предприятий. В результате анализа образцов 32 проб сточных вод выделено 11 бактериофагов сальмонелл. Состав изолятов фагов был гетерогенным и представлен несколькими типами негативных колоний. Для получения фагов в чистых линиях проведено их клонирование по типу негативных колоний до получения однородной популяции. Из клонированных бактериофагов было отобрано 6 наиболее активных в отношении Б. 1урЫшипиш и Б. е^егШ^ (по 3 фага каждого серовара). После пяти пассажей на гомологичных штаммах сальмонелл селекционированные фаги имели высокую активность. В их фаголизатах в течение 4—6 часов культивирования в МПБ, при температуре 37 °С, в стационарных условиях накапливалась от 5,2 х 108 и до 2,8 х 1010 жизнеспособных фаговых частиц.
Результаты определения активности сальмонеллезных фагов представлены в таблице.
Таблица
Результаты определения активности сальмонеллезных фагов
Фаг 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 о 'о 10-11
S. enteritidis + + + + + + + + ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ + + —
S. typhimurium + + + + + + + + ++++ ++++ ++++ ++++ ++ ++ + — —
S. choleraesuis + + + +
Полученные данные свидетельствуют о том, что производственные фаги обладают по отношению к гомологичным культурам хорошо выраженной активностью, но не в одинаковой степени.
Для определения сектора специфичности выделенных фагов использовали штаммы, принадлежащие к различным родам энтеробактерий: Yersinia, Citrobac-ter, Morganella, Klebsiella, Proteus, Escherichia, а также гетерологичным сероваром сальмонелл.
В результате установлено, что спектр специфичности выделенных фагов ограничен пределами подвида Salmonella enterica subsp. enterica. По отношению к гетерологичным сероварам сальмонелл установлена способность изучаемых фагов лизировать штаммы сальмонелл серогруппы В, серогрупп Д, С и Е.
Таким образом, из сточных вод мясоперерабатывающих предприятий выделены и селекционированы бактериофаги S. typhimurium и S. enteritidis, обладающие высокой активностью и широким спектром литического действия.
На их основе, по нашему мнению, могут быть созданы эффективные препараты для санации оборудования против сальмонелл, сырья и продуктов животного происхождения.
Мы изучили возможность применения бактериофагов с целью предупреждения кантаминирования сальмонеллами фарша и готовых колбасных изделий. Для этого применяли бактериофаги к S. typhimurium и S. enteritidis активностью 1 х 10-7—1 х 10-8. Фаги добавляли в фарш вместе с водой. При этом не допускали каких-либо изменений технологического процесса изготовления колбас; в экспериментальные образцы фарша вносили определенное количество сальмонеллез-ных клеток, гомологичных вносимым сальмонеллезным фагам. За период кутеро-вания фарша, шприцевания и осаждения батонов, а также период варки и после охлаждения проводили микробиологические исследования опытных образцов фарша с целью выявления сальмонелл. Оказалось, что период подготовки колбасных батонов к термической обработке количество сальмонелл не увеличивается, снижение происходит на 27—69% от исходных. В случаях нарушения температурных режимов кутерования фарша и осаждения батонов количество сальмонелл снижается на 59—87%. В готовых вареных колбасных изделиях сальмонеллы не обнаружены.
Эти данные свидетельствуют, что с целью предупреждения кантаминиро-вания фарша сальмонеллами в производственных условиях можно использовать бактериофаги активностью не ниже 1 х 10-7.
NEW IN BACTERIOPHAGES USAGE
I.G. Seregin1, A.D. Flerova1, S.V. Linev2
lFSI Moscow state university of engineering biotechnology Talalihina str., 33, Moscow, Russia, 1G9316
2Russian national state scientific monitoring institute
hwy Zvenigorodskoe, З, Moscow, Russia, 117198
There were held studies on possibility of bacteriophage’s usage for prevention of salmonella contamination of farce and fabricated sausage goods. Bacteriophage Salmonella typhimurium and S. enteri-tidis with l x lO-7—l x 0-S activity were used. They were added in farce through water.
