Морфофункциональная характеристика макрофагов эмбрионального и моноцитарного происхождения Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

DOI: 10.23868/201808020

морфофункциональная характеристика макрофагов эмбрионального и моноцитАрного происхождения

А.В. Лохонина1, 3, А.В. Ельчанинов1, 3, И.В. Арутюнян1, 2, А.С. Покусаев2, А.В. Макаров1, 4, И.З. Еремина3, В.В. Суровцев3, Г.Б. Большакова2, Д.В. Гольдштейн5, Т.Х. Фатхудинов1, 3

1 Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова, Москва, Россия

2 Научно-исследовательский институт морфологии человека, Москва, Россия

3 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия

4 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия

5 Медико-генетический научный центр, Москва, Россия

MoRpHoFUNdioNAL cHARAcTERisTic oF Macrophages oF EMBRYoNIc AND Monocytic origin

A.V. Lokhonina1, 3, A.V. Elchaninov1, 3, I.V. Arutyunyan1, 2, A.S. Pokusaev2, A.V. Makarov1, 4, I.Z. Eremina3, V.V. Surovtsev3, G.B. Bolshakova2, D.V. Goldshtein5, T.Kh. Fatkhudinov1 3

1 V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow, Russia

2 Scientific Research Institute of Human Morphology, Moscow, Russia

3 Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, Russia

4 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

5 Research Centre of Medical Genetics, Moscow, Russia

e-mail: fatkhudinov@gmail.com

Макрофаги млекопитающих представляют собой гетерогенную популяцию клеток, различия касаются как источников их происхождения, так и функциональных показателей. В работе проведена сравнительная характеристика макрофагов эмбрионального происхождения на примере клеток Купфера и макрофагов костномозгового происхождения на примере макрофагов — производных моноцитов.

Из печени крыс была получена культура клеток Купфера, из крови крыс — макрофаги моноцитарного происхождения. Оценивали фенотип и профиль экспрессии генов нативных и активированных в направлении М1- и М2-макрофагов. Фенотип выделенных культур был охарактеризован с помощью методов иммуноцитохимии и проточной цитофлуориметрии. Экспрессию генов изучали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Под влиянием индуцирующих факторов фенотип двух популяций макрофагов изменяется сходным образом: под влиянием М1 факторов в клетках активизируется синтез CD86 и iNOs, под влиянием М2 — CD163 и Arg1. В клетках Купфера более выражена экспрессия генов противовоспалительных цитокинов — il4, il13, а в макрофагах моноцитарного происхождения экспрессия генов провоспалительных цитокинов — illb, tnfa, il12a. Индукция генов провоспалительных цитокинов в клетках Купфера происходит медленнее по сравнению с макрофагами моноцитарного происхождения.

ключевые слова: макрофаги, моноциты, клетки Купфера, активация.

введение

Макрофаги являются ключевыми участниками, регулирующими разнообразные морфогенетические процессы в организме млекопитающих, в том числе воспаление и регенерацию тканей [1-4].

В ходе онтогенеза макрофаги млекопитающих образуются из гемопоэтических клеток трех локализаций: желточного мешка, печени зародыша и красного костного мозга. В постнатальном периоде макрофаги большинства органов представляют собой гетерогенную популяцию, состоящую из потомков гемопоэтических клеток печени зародыша и красного костного мозга. Однако существуют исключения: печень содержит макрофаги,

Macrophages of mammals are a heterogeneous population of cells. This applies both to the functional parameters of macrophages and to the sources of their development. The comparative characteristics of macrophages of embryonic origin on the example of Kupffer cells and macrophages of bone marrow origin on the example of macrophages of monocyte derivatives were carried out.

Cultures of Kupffer cells and macrophages of monocytic origin were obtained. The phenotype, profile of gene expression of native macrophages activated in direction M1 and M2 was studied. The phenotype of isolated cultures is characterized by methods of im-munocytochemistry, flow cytometry. Gene expression was studied by real-time polymerase chain reaction.

Under the influence of inducing factors, the phenotype of two populations of macrophages changes in a similar way: under the influence of Mi-factors, the synthesis of CD86 and iNOs is activated in cells, under the influence of M2 — CD163 and Argl. In Kupffer cells, expression of anti-inflammatory cytokines — il4, il13, is more pronounced, and in macrophages of monocytic origin of pro-inflammatory cytokines — illb, tnfa, il12a. The induction of the genes of proinflammatory cytokines in Kupffer cells is slower compared to macrophages of monocytic origin.

Keywords: macrophages, monocytes, Kupffer cells, activation.

ведущие свое происхождение из гемопоэтических клеток печени зародыша, а макрофаги дермы кожи и слизистой оболочки кишечника представлены в основном клетками костномозгового происхождения [3].

Более 95 % всех макрофагов организма локализовано в печени; другое название этих макрофагов — клетки Купфера, по имени Карла Вильгельма Купфера, впервые описавшего их в 1876 г. [5]. Существует две гипотезы о механизмах самоподдержания такого огромного пула клеток. В соответствии с одним представлением, высказанным в 80-х годах прошлого века, популяция макрофагов печени постоянно пополняется за счет мигрирующих гемопоэтических клеток красного

костного мозга [6], согласно другому, более позднему, клетки Купфера способны к самообновлению за счет пролиферации зрелых клеток или предшественников, локализованных также в печени [7].

Источник происхождения органных макрофагов, вероятно, отражается на их свойствах, а также на закономерностях протекания физиологических и патологических процессов. На существующие различия в физиологии двух типов макрофагов указывает тот факт, что после острого повреждения парацетамолом или CCl4 в печень активно мигрируют моноциты [8, 9]. Однако заселившие печень макрофаги костномозгового происхождения остаются доминирующей популяцией только в течение 72 ч. и уже через 96 ч. полностью исчезают, а их место занимают клетки Купфера, восстановившие свою численность за счет пролиферации [10]. Искусственное истощение популяции резидентных макрофагов, как и предотвращение миграции в печень моноцитов крови, вызывает замедление регенераторного процесса [10, 11]. Очевидно, что оба типа макрофагов: и резидентные макрофаги печени, имеющие эмбриональное происхождение, и мигрировавшие из крови макрофаги костномозгового происхождения — участвуют в восстановлении печени, при этом моноцитарные макрофаги являются, своего рода, «скорой помощью», призванной запустить процесс репарации до момента восстановления популяции клеток Купфера. Таким образом, макрофаги моноцитарного происхождения и клетки Купфера отличаются не только по своему происхождению, но и по функциональной нагрузке.

Цель работы — сравнить фенотип и профиль экспрессии генов цитокинов нативных и активированных макрофагов костномозгового и эмбрионального происхождения на примере производных моноцитов крови и клеток Купфера.

Материал и методы

Самцы крыс аутбредного стока Вистар массой тела 250-300 г были получены из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Содержание и уход за лабораторными животными осуществляли в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985 г.), правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999 г.

Выделение моноцитов

из периферической крови крысы

У самцов крыс производили забор периферической крови. Полученную кровь в соотношении 1:1 смешивали с раствором Хенкса, содержащим 1000 МЕ/ мл гепарина (Синтез, Россия). Методом градиентного центрифугирования (400g, 30 мин., 20 °С) на препарате Фиколл (ПанЭко, Россия) получали фракцию монону-клеарных клеток. Клетки дважды отмывали раствором Хенкса, после каждой промывки клетки центрифугировали (300g, 20 мин., 20 °С). Количество и жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализатора TC20 (Bio-Rad, США).

Выделение клеток Купфера из печени крысы

Крысам под эфирным наркозом проводили перфузию печени раствором фосфатно-солевого буфера (40-50 мл) через воротную вену. Печень извлекали, дважды промывали раствором Хенкса, удаляли

оболочки и крупные сосуды, измельчали и инкубировали в 0,05 % растворе коллагеназ 1 и 4 типов (ПанЭко, Россия) 20 мин. при 37 °С на орбитальном шейке-ре. Полученную суспензию клеток пропускали через 100 мкм нейлоновый фильтр (SPL LifeScience, Южная Корея) и дважды отмывали от ферментов в растворе Хенкса (центрифугирование при 300g, 10 мин., 20 °С). Осадок ресуспендировали в 30 мл фосфатно-солево-го буфера, осаждали паренхиматозные клетки печени (центрифугирование при 50g, 3 мин., 20 °С) и отбирали непаренхиматозные клетки, оставшиеся в суперна-танте. После градиентного центрифугирования (400g, 30 мин., 20 °С) на препарате Фиколл (ПанЭко, Россия) получали фракцию клеток Купфера [12, 13]. Количество и жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализатора TC20 (Bio-Rad, США).

Культивирование макрофагов

Клетки Купфера и моноциты из периферической крови крысы переносили в ростовую среду RPMI (ПанЭко, Россия), содержащую 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (PAA Lab., Австрия) и 1 % пенициллина-стрептомицина (ПанЭко, Россия). На 2 сут. культивирования удаляли не прикрепившиеся к пластику клетки. Замену половины объема культуральной среды на свежую производили на 4 и 7 сут.

Активация макрофагов

в направлении М1-фенотипа

Клетки Купфера и макрофаги из периферической крови крысы культивировали в ростовой среде с добавлением 50 нг/мл GM-CSF (Cloud-Clone, КНР). На 2 сут. культивирования удаляли не прикрепившиеся к пластику клетки. Замену половины объема культуральной среды на свежую производили на 4 и 7 сут. Для активации М1-макрофагов на 7 сут. в среду вносили LPS (Sigma, США) и IFN-y (Cloud-Clone, КНР) до конечной концентрации 10 нг/мл и 40 нг/мл соответственно (М1 среда).

Активация макрофагов

в направлении М2-фенотипа

Клетки Купфера и макрофаги из периферической крови крысы культивировали в ростовой среде с добавлением 100 нг/мл M-CSF (Cloud-Clone, КНР). На 2 сут. культивирования удаляли не прикрепившиеся к пластику клетки. Замену половины объема культуральной среды на свежую производили на 4 и 7 сут. Для активации М2-макрофагов на 7 сут. в среду вносили IL4, IL10 и IL13 (Cloud-Clone, КНР) до конечной концентрации 20 нг/мл (М2 среда).

Иммуноцитохимическое исследование

Исследование проводили через 24 ч. после активации макрофагов. Для оценки экспрессии маркеров активированных макрофагов использовали антитела к CD68 (1:100, Abcam, Великобритания), iNOs (1:100, Abcam, Великобритания), Arg1 (1:100, Abcam, Великобритания), CD206 (1:100, Santa Cruz, США). Вторые антитела были конъюгированы с FITC (1:200, Abcam, Великобритания). Ядра клеток докрашивали DAPI (Sigma-Aldrich, США). Окрашенные макрофаги изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000 B (Германия) и программного обеспечения LAS AF v.3.1.0 build 8587 (Leica Microsystems, Германия).

Проточная цитофлуориметрия

Через 24 ч. после активации макрофаги открепляли от подложки раствором трипсина-Версена и дважды

отмывали от культуральной среды в растворе Хенкса. Пермеабилизацию и фиксацию клеток для последующего окрашивания на внутриклеточные маркеры осуществляли с помощью набора InsideStainKit (Miltenyi Biotec, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки для окрашивания на поверхностные маркеры ресуспендировали в фосфатно-соле-вом буфере до концентрации 1х105 клеток в 100 мкл. Использовали антитела к CD45-PerCPVio700, CD68-PEVio770, CD11 b-PE, CD86-VioBright FITC (Miltenyi Biotec, Германия) и CD163-PE (Thermo Fisher, США). Анализ проводили на цитофлуориметре Cytomics FC 500 (BeckmanCoulter, США) с помощью программы CXP (Beckman Coulter, США).

Полимеразная цепная реакция

в реальном времени

Экспрессию генов изучали через 24 и 72 ч. после активации макрофагов. Суспензию клеток помещали в РНК-лейтер (QIAGEN, Германия), инкубировали в течение 1 сут. при +4 °С, переносили в низкотемпературный

Таблица. Праймеры для проведения ПЦР

морозильник и хранили при -80 °С. Из полученных образцов выделяли тотальную РНК с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Германия). Синтез кДНК с матрицы полученной тотальной РНК осуществляли с использованием готового набора реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия). С полученными кДНК ставили ПЦР с помощью готовых наборов реактивов qPCRmix-HS SYBR, содержащих флуоресцентный интеркали-рующий краситель Sybr Green I (Евроген, Россия). Праймеры для ПЦР подбирали с применением программы Primer-BLAST в соответствии с общепринятыми требованиями. Выбранные праймеры (табл.) были синтезированы фирмой Евроген (Россия). Для анализа экспрессии генов использовали метод определения порогового цикла (Ct) и вычисления относительной экспрессии гена по методу M. Pfaffl (2001) [14] с учетом рекомендаций J. Vandesompele (2002) [15]. В качестве эндогенного контроля был выбран ген домашнего хозяйства gapdh. Уровень экспрессии гена в активированных макрофагах нормировали на соответствующий показатель в неактивированных клетках.

Ген

Последовательность

Ген

Последовательность

illb il4 il6 il10 il12a il13

CTG TCT GAC CCA TGT GAG CT ACT CCA CTT TGG TCT TGA CTT

ATG TAA CGA CAG CCC TCT GA AGC ACG GAG GTA CAT CAC G TAC ATA TGT TCT CAG GGA GAT GGT AGA AAC GGA ACT CCA G

GCC CAG AAA TCA AGG AGC AT TGA GTG TCA CGT AGG CTT CTA

CTG CCA AGT GTC TTA ACC AGT GCA GGC CTC CAG TGT GCT

CCA GAA GAC TTC CCT GTG CA CCC TCA GTG GCC ATA GCG

il18 tnfa iNOs argl gapdh

GAC AAA AGA AAC CCG CCT G ACA TCC TTC CAT CCT TCA CAG CCA CCA CGC TCT TCT GTC TA GCT ACG GGC TTG TCA CTC G CGC TGG TTT GAA ACT TCT CAG GGC AAG CCA TGT CTG TGA C GGA TGA GCA TGA GCT CCA AG GCC AGC TGT TCA TTG GCT T

GCGAGATCCCGCTAACATCA CCCTTCCACGATGCCAAAGT

Статистический анализ

Полученные данные анализировали с помощью программы SigmaStat 3.5 (Systat Software Inc, США), относительные экспрессии сравнивали с использованием рангового однофакторного дисперсионного анализа ANOVA on Ranks. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Фенотип макрофагов моноцитарного

происхождения и клеток Купфера

Полученные культуры макрофагов моноцитарного происхождения и клеток Купфера содержали примерно одинаковое количество С068+-клеток, около 90 %, что свидетельствует о высокой чистоте выделения. Более 90 % моноцитарных макрофагов экспресси-ровали интегрин CD11b, в то время как на поверхности клеток Купфера данный маркер отсутствовал. Макрофаги моноцитарного происхождения не экс-прессировали маркер М1-макрофагов CD86, но около 40 % клеток несли маркер М2-макрофагов CD163. В культуре неактивированных клеток Купфера доли CD86+ и CD163+-клеток составили приблизительно 30 и 70 % соответственно (рис. 1).

Под влиянием М1 среды в макрофагах обоих типов изменялась экспрессия 0086: в культуре клеток Купфера доля СЮ86+-клеток возрастала приблизительно в 2 раза, в то время как в культуре макрофагов моноцитарного происхождения увеличение было более выраженным, с 0 до 73,1 % (рис. 1)

При воздействии М2 среды макрофаги обоих типов также реагировали сходным образом, доля СЮ163+-клеток была выше, чем СЮ86+-клеток, в 2,0-2,2 раза (рис. 1).

При изучении фенотипа макрофагов моноцитарно-го происхождения и клеток Купфера методом иммуно-цитохимии было обнаружено, что оба вида макрофагов реагируют на активацию одинаково. При воздействии факторов М1 среды макрофаги моноцитарного происхождения и клетки Купфера становились отростчатыми, неравномерно экспрессировали индуцируемую N0-синтазу (¡N03), не экспрессировали СЮ206 и аргиназу. Влияние факторов, индуцирующих М2-фенотип, приводило к тому, что макрофаги оставались округлыми, экспрессировали СЮ206 и аргиназу, не экспрессировали индуцируемую N0-синтазу (рис. 2), что согласуется с полученными в данной работе результатами по экспрессии соответствующих генов (рис. 3). Воздействие

рис. 1. Фенотип неактивированных и активированных в направлении М1- и М2-фенотипов клеток Купфера и макрофагов моноцитарного происхождения. Проточная цитофлуориметрия.

М1 и М2 сред не приводило к изменению уровня экспрессии общего маркера макрофагов С068 (рис. 2).

Экспрессия генов

Анализ профиля экспрессии изучаемых генов в культурах клеток (рис. 3) позволил выявить отличия в ответе моноцитарных макрофагов и клеток Купфера на действие М1 и М2 индукторов.

В макрофагах моноцитарного происхождения отмечалась более быстрая и длительная индукция генов провоспалительных цитокинов по сравнению с клетками Купфера. Так, для моноцитарных макрофагов индукция генов ¡¡1Ь и №(а наблюдалась как в культуре с М1, так и М2 средой, хотя в случае М1 активации высокий уровень экспрессии сохранялся дольше, чем при использовании М2 среды. Экспрессия ьп^а в клетках Купфера возрастала только на 3 сут. под действием М1 среды, при этом значимого изменения уровня ¡¡1Ь обнаружено не было ни через 1 сут., ни через 3 сут.

Экспрессия гена ¡¡6 в макрофагах моноцитарного происхождения и клетках Купфера имела сходную динамику: уровень экспрессии возрастал уже через 1 сут. после М1 или М2 активации, однако оставался повышенным в течение 3 сут. только при воздействии М1 среды. Экспрессия гена ¡¡12а в моноцитарных макрофагах возрастала при индукции как в М1,

так и в М2 направлениях уже через 1 сут., а в клетках Купфера только через 3 сут. в условиях М1 среды. Стоит отметить, что неактивированные макрофаги моноцитарного происхождения отличались достоверно более высокой экспрессией генов ¡¡6 и ¡¡12а по сравнению с неактивированными клетками Купфера.

Экспрессия гена ¡¡18 в моноцитарных макрофагах повышалась достоверно только под влиянием М1 среды, в то время как в клетках Купфера экспрессию гена стимулировали оба типа индуцирующих сред.

При рассмотрении экспрессии генов противовоспалительных цитокинов было обнаружено, что в клетках Купфера повышение экспрессии происходило быстрее и на более продолжительный период, чем в макрофагах моноцитарного происхождения. Так, статистически значимое повышение экспрессии гена противовоспалительного цитокина ¡¡4 было выявлено только в клетках Купфера. Экспрессия гена ¡¡4 через 1 сут. активации повышалась при воздействии М1 среды, через 3 сут. — в М1 и М2 средах. Экспрессия гена ¡¡13 в клетках Купфера была повышена и через 1, и через 3 сут. после индуцирующего влияния в направлении как М1-, так и М2-фенотипов, в макрофагах моноцитарного происхождения экспрессия гена ¡¡13 краткосрочно возрастала только под влиянием М2 индуцирующих факторов.

КК М1

* 9

» г ♦ # 1 К

t

CD68, DÄPI

-

КК М2

• i

4 " • CD68, DAPI

Мон ,М1

• \ "V

. , *

г *

CD6$, DAPf

\

Мон М2

» *

* *

* •

CD68, DAPI *

%

CD206 DAPI

КК М2

iNOs, DAPI

КК М2

* г'

<4ft Arg! DAPI

Мон M1

<

iNOs, DAPI --4 *

Мон M1

Arg1, DAPI

_ ■ CD2Ü6 DAPI _

Мон M2

iNOs, DAPI

Мон M2

•

/ # £

4

Arg! ЙА,Р1 _

Рис. 2. Клетки Купфера (КК) и макрофаги моноцитарного происхождения (Мон) под влиянием индукторов: М1 — М1-фенотипа, М2 — М2-фенотипа; флуоресцентная микроскопия, масштабный отрезок — 50 мкм.

Воздействие индуцирующих сред приводило к повышению экспрессии гена il10 в макрофагах обоих типов. При этом в клетках Купфера достоверное повышение экспрессии гена il10 отмечалось через 1 сут. при культивировании в М2 среде, а через 3 сут. — в М1 среде. В макрофагах моноцитарного происхождения повышение экспрессии гена il10 было выявлено только через 1 сут. после инкубации в М1 среде.

Влияние индуцирующих сред вызывало более длительную повышенную экспрессию iNOs в макрофагах моноцитарного происхождения (через 1 и 3 сут. после активации), при этом ген экспрессировался только при культивировании в М1 среде. В клетках Купфера возрастание уровня экспрессии гена iNOs выявляли только через 3 сут. после воздействия активирующей среды, при этом статистически значимое повышение экспрессии отмечалось как в М1, так и в М2 среде.

Уровень экспрессии arg был статистически значимо выше в неактивированной культуре клеток Купфера по сравнению с моноцитарными макрофагами. Через 1 сут. экспрессия arg в культуре клеток Купфера с М2 средой была достоверно выше, чем в культуре с М1 средой.

Обсуждение

Макрофагам отводится значительная роль в регуляции репаративных процессов, а также в развитии патологических состояний различных органов, в том числе

печени [5, 8]. Однако крайне редко отмечается особенность резидентных макрофагов печени — их эмбриональное происхождение [3, 8]. Вероятно, источник происхождения макрофагов печени определяет особенности функционирования данных клеток, как при физиологических, так и при патологических состояниях. В настоящее время остается непонятным, чем, помимо поверхностных маркеров, различаются макрофаги эмбрионального и костномозгового происхождения [2, 3].

Проведя сравнительный анализ свойств макрофагов эмбрионального происхождения на примере клеток Купфера и макрофагов моноцитарного происхождения, мы выявили ряд особенностей.

Выделенные из печени макрофаги не экспрессиро-вали интегрин ССМЬ, а большая часть неактивированных макрофагов моноцитарного происхождения имела фенотип С011Ь+ (рис. 1). С011Ь некоторыми авторами рассматривается как маркер макрофагов моноцитар-ного происхождения, в соответствии с литературными данными доля таких клеток в печени колеблется от 5 до 30 % [16]. При этом есть сообщения, что резидентные макрофаги центральной нервной системы, происходящие из гемопоэтических клеток желточного мешка, также экспрессируют С011Ь [3].

В ходе изучения влияния факторов активации на экспрессию фенотипических маркеров было обнаружено, что макрофаги моноцитарного и эмбрионального

рис. 3. Профиль экспрессируемых генов клетками Купфера и макрофагами моноцитарного происхождения: в нативных и индуцированных в направлении М1- и М2-фенотипов через 1 сут. и 3 сут. после индукции. *различия статистически значимы по сравнению с нативными макрофагами, р<0,05.

происхождения реагируют сходным образом. Наиболее заметным было изменение экспрессии рецепторного белка 0086, который необходим для активации, пролиферации, продукции цитокинов, дифференциации Т-лимфоцитов [17]. Наибольшее увеличение количества С086+-клеток происходило под влиянием факторов М2 активации.

Выделенные резидентные макрофаги печени имели ряд особенностей в наборе экспрессируемых генов ци-токинов. Установлено, что под влиянием факторов активации (как М1, так и М2 индукторов) в резидентных макрофагах печени увеличивалась экспрессия генов в основном противовоспалительных цитокинов, таких как ¡¡4, ¡¡10, ¡¡13. Экспрессия провоспалительных цитокинов либо отсутствовала (например, ¡¡1Ь), либо возрастала значительно позже (Ша, ¡¡12а) по сравнению с макрофагами моноцитарного происхождения. Эти данные согласуются с результатами фенотипирования нативных макрофагов печени, большинство которых экспрессиро-вали на своей поверхности С0163, маркер противовоспалительных макрофагов. Ранее нами также было выявлено, что в ходе репаративной регенерации печени после субтотальной резекции у крыс популяция макрофагов регенерирующей печени представлена в основном клетками, несущими маркер М2-макрофагов С0206 [18].

В настоящее время роль 11_4 и 11_13 в регенерации печени мало изучена. Имеются единичные сообщения, что

IL4 играет ключевую роль в инициации пролиферации гепатоцитов в регенерирующей печени [19], в то время как IL13 регулирует пролиферацию холангиоцитов и активность фибробластов в печени [20].

Позднее начало экспрессии гена tnfa возможно лежит в основе сниженного содержания TNFa в печени крыс после субтотальной резекции, что приводит к нарушению пролиферации гепатоцитов [21, 22]. При остром токсическом повреждении в печени наблюдается выраженная фаза альтерации воспалительной реакции, для течения которой необходимы провоспалительные цито-кины IL1, TNFa [9, 10]. Отсутствие или позднее начало экспрессии генов il1, tnfa резидентными макрофагами в условиях острого токсического повреждения печени, вероятно, приводит к миграции в печень макрофагов костномозгового происхождения.

Результаты нашего исследования согласуются с гипотезой о существовании фенотипического континуума (спектра) макрофагов, крайними точками которого являются «идеальные» М1- и М2-макрофаги. Однако важно отметить, что даже в условиях in vitro при воздействии специфических индукторов невозможно получить гомогенную популяцию М1- или М2-макрофагов, поскольку клетки взаимодействуют с ксеногенными белками куль-туральной среды и полимерным материалом подложки [23, 24]. Мы можем говорить только о сдвиге основного пула макрофагов в направлении классической или

альтернативной активации. Наш эксперимент показал, что макрофаги костномозгового происхождения быстрее и интенсивнее реагируют на классическую активацию, изменяя фенотип в М1 направлении, в то время как клетки Купфера, имеющие эмбриональное происхождение, коммитированы в М2 направлении.

заключение

При изучении фенотипа и профиля экспрессиру-емых генов мы обнаружили ряд особенностей клеток Купфера по сравнению с макрофагами костномозгового происхождения. Резидентные макрофаги печени и моноцитарные макрофаги имели сходный фенотип, за исключением экспрессии CD11b, которая отсутствовала у клеток Купфера. После активации

ЛИТЕРАТУРА:

1. Arutyunyan I., Elchaninov A., Fatkhudinov T. et al. Elimination of allogeneic multipotent stromal cells by host macrophages in different models of regeneration. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015; 8(5): 4469-80.

2. Chazaud B. Macrophages: supportive cells for tissue repair and regeneration. Immunobiology 2014; 219(3): 172-8.

3. Epelman S., Lavine K.J., Randolph G.J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity 2014; 41(1): 21-35.

4. Martinez F.O., Gordon S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 2014; 6: 1-13.

5. Bilzer M., Roggel F., Gerbes A.L. Role of Kupffer cells in host defense and liver disease Role of Kupffer cells in host defense and liver disease. Liver International. 2006; 26: 1175-86.

6. van Furth R. Monocyte origin of Kupffer cells. Blood Cells 1980; 6(1): 87-92.

7. Nguyen-Lefebvre A.T., Horuzsko A. Kupffer Cell Metabolism and Function. J. Enzymol. Metab. 2015; 1(1): 101-27.

8. Li P., He K., Li J. et al. The role of Kupffer cells in hepatic diseases. Mol. Immunol. 2017; 85: 222-9.

9. Michalopoulos G.K. Advances in liver regeneration. Expert. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2014; 8(8): 897-907.

10. You Q., Holt M., Yin H. et al. Role of hepatic resident and infiltrating macrophages in liver repair after acute injury. Biochem. Pharmacol. 2013; 86(6): 836-43.

11.11 Zigmond E., Samia-Grinberg S., Pasmanik-Chor M. et al. Infiltrating monocyte-derived macrophages and resident Kupffer cells display different ontogeny and functions in acute liver injury. J. Immunol. 2014; 193(1): 344-53.

12. Zeng W.Q., Zhang J.Q., Li Y. et al. A new method to isolate and culture rat Kupffer cells. PLoS One 2013; 8(8): 1-10.

13. Zhang Q., Qu Y., Li Z. et al. Isolation and Culture of Single Cell Types from Rat Liver. Cells Tissues Organs 2016; 201(4): 253-67.

М1 и М2 индукторами у резидентных макрофагов печени повышалась экспрессия в основном противовоспалительных цитокинов, а у моноцитарных — провос-палительных цитокинов. Макрофаги костномозгового происхождения быстрее и интенсивнее реагировали на классическую активацию, а клетки Купфера — на альтернативную активацию.

конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

Исследование выполнено за счет гранта Российского Научного Фонда (Соглашение № 17-15-01419).

14. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001; 29(9): e45.

15. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F. et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002; 3(7): research0034.1-research0034.11.

16. Nishiyama K., Nakashima H., Ikarashi M. et al. Mouse CD11b+Kupffer Cells Recruited from Bone Marrow Accelerate Liver Regeneration after Partial Hepatectomy. PLoS One 2015; 10(9): e0136774.

17. Chen L., Flies D.B. Molecular mechanisms of T cell co-stimulation and co-inhibition. Nat. Rev. Immunol. 2013; 13(4): 227-42.

18. Ельчанинов А.В., Фатхудинов Т.Х., Усман Н.Ю. и соавт. Динамика количества М2-макрофагов при регенерации печени крыс. Молекулярная медицина 2017; 1: 45-50.

19. Goh Y.P., Henderson N.C., Heredia J.E. et al. Eosinophils secrete IL-4 to facilitate liver regeneration. PNAS USA 2013; 110(24): 9914-9.

20. Gieseck R.L. 3rd., Ramalingam T.R., Hart K.M. et al. Interleukin-13 Activates Distinct Cellular Pathways Leading to Ductular Reaction, Steatosis, and Fibrosis. Immunity 2016; 45(1): 145-58.

21. Elchaninov A., Fatkhudinov T., Usman N. et al Molecular Survey of Cell Source Usage during Subtotal Hepatectomy-Induced Liver Regeneration in Rats. PLoS One 2016; 11(9): e0162613.

22. Ельчанинов А.В., Фатхудинов Т.Х., Арутюнян И.В. и др. Пролиферация и клеточная гибель гепатоцитов после субтотальной резекции печени крыс. Клиническая и экспериментальная морфология 2016; 3: 22-30.

23. Jablonski K.A., Amici S.A., Webb L.M. et al. Novel Markers to Delineate Murine M1 and M2 Macrophages. PLoS One 2015; 10(12): e0145342.

24. Сарбаева Н.Н., Пономарева Ю.В., Милякова М.Н. Макрофаги. Разнообразие фенотипов и функций, взаимодействие с чужеродными материалами. Гены и Клетки 2016; 11(1): 9-17

Поступила: 30.012018