CC BY
77
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Эмбриология ♦
УДК 636: 612.64
Морфобиохимическая характеристика скелетных мышц кур в эмбриогенезе на примере линий Б-56 и Б-79
Е.Н. Борхунова1, доктор биологических наук ([email protected]), Г.В. Кондратов1, соискатель,
В.Ю Титов2, доктор биологических наук ([email protected])
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (Москва).
2 ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства (МО, Сергиев Посад).
На основании гистологических, морфометрических и биохимических методов изучены общие закономерности и особенности гистогенеза скелетных мышц (грудные мышцы и четырехглавая мышца бедра) у эмбрионов линий Б-79 (мясо-яичная) и Б-56 (мясная). Выявлены структурные и морфометрические различия развивающихся мышц у изучаемых линий кур, а также определены корреляции между структурным состоянием и биохимическими показателями, отражающими особенности их дифференцировки.
Ключевые слова: скелетные мышцы, эмбриональный метаболизм оксида азота, эмбрионы кур Сокращения: ДНКЖ — динитрозильные комплексы железа
Введение
Птицеводство — одна из важных отраслей сельского хозяйства, обеспечивающая население продовольствием. В этой связи поиск способов повышения продуктивности, в частности, кур мясного направления, остается одной из актуальных проблем сельскохозяйственного производства. Этой цели, несомненно, служит селекционно-племенная работа, которая базируется на оценке продуктивности птицы, поддержании чистоты пород, линий и кроссов. Как известно, большинство методов оценки реализуют после вылупления птицы и в убойном возрасте [2, 11]. В настоящее время показано, что интенсивность метаболизма оксида азота в эмбрионе прямо коррелирует с мясной продуктивностью взрослых особей и может служить очень чувствительным критерием при определении направления продуктивности: у эмбрионов мясных и яичных форм содержание метаболитов оксида азота в амнионе и аллантоисе различается на два порядка [17]. Очевидно, что интенсивность эмбрионального метаболизма оксида азота — генетически обусловленный признак, поскольку внутри линии и кросса различия составляют не более 10 %. Указанный метод может найти применение в птицеводстве, так как позволяет в эмбриональном периоде развития, не причиняя ущерба зародышу, определить направление его продуктивных качеств [16]. Вместе с тем, для обоснования метода необходимо выявить взаимосвязь между биохимическими показателями, особенностями гистогенеза мышц эмбриона и мясной продуктивностью взрослых особей. Можно полагать, что эти различия связаны со спецификой развития скелетных мышц у кур различного направления продуктивности. Однако работы, посвященные изучению гистогенеза мышц кур единичны, а исследования в сравнительном аспекте не проводились [1, 3, 5, 8, 10, 12, 13].
Цель исследования
Выявить морфобиохимическую корреляцию между особенностями эмбриогенеза скелетных мышц кур мясного и яичного направлений продуктивности и интенсивностью эмбрионального метаболизма оксида азота посредством комплексных микроскопических и биохимических исследований.
Материалы и методы
Объектами исследования служили 6-, 12- и 19-дневные эмбрионы кур породы Плимутрок линия Б-79 (мясояичная) и Корниш Б-56 (мясная).
Для гистологических исследований материал фиксировали в 10%-м растворе формалина, заливали в парафин по общепринятой методике, готовили срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксин-фукселином. Изучение гистологической картины, микрофотосъемку и микроскопическую морфометрию со статистической обработкой выполняли с помощью микроскопа Jenamed, совмещенного с программой анализа микроскопического изображения ImageScope.
Содержание продуктов окисления NO определяли с помощью ферментного сенсора, основанного на свойстве нитрита (NO2'), S-нитрозотиолов (RSNO), ДНКЖ и нитропроизводных органических соединений (RNO2) ингибировать фермент каталазу в присутствии галои-дионов, и на утрате ими этого свойства под действием определенных факторов, различных для каждой группы соединений. Содержание нитрата (NOз') определяли посредством его восстановления до нитрита хлоридом ванадия с последующим определением как нитрита. Данный метод позволяет с высокой степенью чувствительности (до 50 нМ) определить весь спектр продуктов окисления NO без предварительной подготовки и очистки образца [18, 19, 24, 25]. Параллельно применяли классический метод Грисса для определения содержания нитрита [18].
В экспериментах использовали оплодотворенные яйца ряда пород, линий и кроссов кур, полученные в ООО «Генофонд». Было исследовано от 20 до 40 эмбрионов каждой породы, линии и кросса. Гомогенаты
Рис. 1. Линия Б-79.
Почка тазовой конечности
6-дневного эмбриона. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид, продольный срез:
1 — хрящевой зачаток кости,
2 — закладка мышц, об. 10, ок. 10;
Б — в закладке мышцы видны мышечные волокна (1), мышечные трубочки (2), кровеносные сосуды (3), об. 40, ок. 10
Рис. 2. Линия Б-56.
Почка тазовой конечности
6-дневного эмбриона. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид, продольный срез:
1 — хрящевой зачаток кости,
2 — закладка мышц, об. 10, ок. 10;
Б — в закладке мышцы видны мышечные волокна (1) и кровеносные сосуды (2), об. 20, ок. 10
Рис. 3. Линия Б-79.
Зачаток грудных мышц.
Продольный срез.
Гематоксилин и эозин.
А — в зачатке грудной мышцы видны мышечные трубочки (1), кровеносные сосуды (2), нервный стволик (3), об. 20, ок. 10;
Б — область зачатка мышцы с разрозненными мышечными волокнами (1), об. 40, ок. 10;
Рис. 4. Линия Б-56.
Зачаток грудной мышцы
6-дневного эмбриона. Продольный срез.
Гематоксилин и эозин, об. 10, ок. 10.
А — видны мышечные трубочки (1) в закладке мышцы и хрящевой зачаток грудной кости (2);
Б — видны мышечные волокна (1) в закладке мышцы и кровеносные сосуды (2)
эмбрионов на разных стадиях развития получали путем гомогенизации в стеклянном гомогенизаторе в течение 8 мин с частотой 40 фрикций/мин при температуре 6 °С. Для инкубации использовали инкубаторы ИПХ-10, температура в которых поддерживалась на уровне 37,6 °С в инкубационный период, и 37,2 °С в выводной период.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ BЮSTAT.
Результаты
Микроскопические исследования. Эмбрионы исследовали на 6-е, 12-е и 19-е сутки инкубации.
На 6-е сутки эмбриогенеза светооптически визуализируются почки тазовой и грудной конечностей. На
срезе почки тазовой конечности (рис. 1, 2) определяются зачатки костей и окружающие их зачатки скелетных мышц. В них можно различить миотубулы, содержащие в виде цепочек кубические клетки, а также тонкие мышечные волокна, представляющие собой эозинофильные тяжи с многочисленными ядрами, располагающиеся вдоль длинной оси закладки конечности. Мышечные трубочки и мышечные волокна вариабельны по длине и располагаются под разными углами друг к другу, что может отражать процесс закладки отдельных мышц.
Зачатки грудных мышц развиты еще слабые и образуют тонкий слой, в котором выделяются мышечные трубочки и мышечные волокна (рис. 3, 4). Между мышечными волокнами видны соединительнотканные
Рис. 5. Линия Б-79.
Область бедра 12-дневного эмбриона.
Продольный срез.
А — общий вид: 1 — модель бедренной кости с признаками оссификации,
2 — скелетные мышцы.
Гематоксилин и эозин, об. 4, ок. 10.
Б — модель бедренной кости с признаками оссификации (1), мышечные волокна (2) имеют четкое структурное оформление, располагаются в виде пучков; заметны кровеносные сосуды (3) в эмбриональной соединительной ткани. Гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10;
В — мышечная (1) и соединительная (2) ткани эмбриона еще не имеют типичных тинкториальных свойств и окрашиваются в коричневатый цвет. Пикрофуксин-фукселин, об. 40, ок. 10;
Г — область скелетной мышцы с рыхлой упаковкой мышечных волокон: между мышечными волокнами (1) разной толщины видны широкие прослойки соединительной ткани (2). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
Д — область скелетной мышцы с плотной упаковкой мышечных волокон: между мономорфными мышечными волокнами (1) видны тонкие прослойки соединительной ткани (2). Гематоксилин и эозин, об.40, ок.10
прослойки с кровеносными сосудами, а также нервными стволиками разного калибра. Кровеносные сосуды обнаружены не только в местах расположения волокон, но и в толще зачатка мышцы, где сосредоточены в основном мышечные трубочки. Картина отражает процесс формирования скелетных мышц, топографически и хронологически сопряженный с процессами их вас-куляризации и иннервации. На данном этапе развития мышечная и соединительная ткани не имеют типичных тинкториальных свойств и окрашиваются пик-
рофуксин-фукселином в коричневатый цвет, что соответствует состоянию развития и формирования соматических структур и отражает их морфологическую незрелость.
При сравнительном изучении зачатков мышц бедра и грудных мышц установлено, что образцы Б-79 превосходят Б-56 по количеству мышечных волокон и их толщине, а также по количеству кровеносных сосудов (табл. 1). Это свидетельствует о более ранней диф-ференцировке изучаемых мышц у эмбрионов Б-79.
1. Характеристика мышц бедра и грудных мышц у эмбрионов кур Плимутрок линия Б-79 и Корниш линия Б-56
Плимутрок линия Б-79 Корниш линия Б-56
Показатель Зачатки мышц почки тазовой конечности Зачатки грудных мышц Зачатки мышц почки тазовой конечности Зачатки грудных мышц
6-е сутки
Число миобластов в поле зрения* 67±2 68±2 70±1 67±2
Наличие мышечных волокон + + + + , единичные
Толщина мышечных волокон, мкм 5,89±1,27 5,76±0,71 5,26±0,64 4,1±1,1
Толщина пучков мышечных волокон, мкм 116±5,4 72,8±8 84,4±5,5 -
Число кровеносных сосудов в поле зрения** 13±1 9±1 11,5±1,5 8,5±0,5
12-е сутки
Показатель Мышцы бедра Грудные мышцы Мышцы бедра Грудные мышцы
Толщина мышечных волокон, мкм 6,65±1,06 и 11,0±1,4 8,2±1,5 и 11,7±2,4 7,25±1,6 7,5±1,4
Толщина пучков мышечных волокон, мкм 134±25и 78±12 77,3±9,5 135±38,8 Рыхло расположены 154±20,7 и 70,4±12,9
Число кровеносных сосудов в поле зрения** 7,5±0,5 6±1 4,5±0,5 8,5±0,5
Толщина прослоек соединительной ткани, мкм 75±19 54,7±11,4 84,8±8 64,3±8,8
19-е сутки
Толщина мышечных волокон, мкм 6,4±1,05 Появляется поперечная исчерченность 6,24±1,14 4,8±0,87 и 6,9±1,1 7,6±0,78
Толщина пучков мышечных волокон, мкм 60±11,7 50±10,5 Рыхло расположены 60,6±11,5 103±19,4
Число кровеносных сосудов в поле зрения** 5±0,5 4,5±0,5 4,5±0,5 5±1,0
Толщина эндомизия, мкм 5,8±1,5 5,7±2,4 21,2±3,2 21,4±4,6
Толщина перимизия, мкм 24,7±7,5 и 56,8±5,2 16,7±3,5 38,7±12,8 52,7±11
Толщина эпимизия, мкм 224±8,7 106±17,5 32±9 30±3,2
Рис. 6. Линия Б-56. Область бедра 12-дневного эмбриона. Продольный срез. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид: 1 — модель бедренной кости с признаками оссификации, 2 — скелетные мышцы, об. 4, ок. 10;
Б — продольный срез: мышечные волокна скелетной мышцы (1) тонкие, разделены прослойками рыхлой соединительной ткани (2), заметны кровеносные капилляры (3), об. 40, ок. 10;
В — поперечный срез: 1 — мышечные волокна, клетки-сателлиты (показаны красными стрелками), 2 — соединительная ткань, 3 — кровеносные капилляры, об. 40, ок. 10
Рис. 7. Линия Б-79. Область грудины 12-дневного эмбриона. Продольный срез. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид: 1 — хрящевая модель грудной кости с признаками оссификации, 2 — скелетные мышцы, об. 4, ок. 10;
Б — видны тонкие, многоядерные мышечные волокна (1); по периферии заметны клетки-сателлиты (показаны стрелками), соединительная ткань (2) между пучками мышечных волокон, об. 40, ок. 10;
В — поперечный срез. Мышечные волокна (1) окружены клетками-сателлитами (2), образуют пучки, между которыми расположена соединительная ткань (3), заметны нервный стволик (4), кровеносный капилляр (5), об.40, ок.10
На 12-е сутки эмбриогенеза на срезе тазовой конечности можно видеть хрящевую модель кости со сформированной диафизарной костной манжетой (рис. 5), окруженную скелетными мышцами. В их структуре отчетливо дифференцированы волокна, объединенные в пучки и разделенные прослойками тонковолокнистой соединительной ткани, в которой обнаружена и белая жировая ткань (рис. 6, 7). Мышечные волокна толще, чем в предыдущий срок (см. табл. 1). По периферии волокон отмечены многочисленные округлые клетки, которые, как известно, могут дифференцироваться в направлении миосимпластов или миосателлитов. Плотность упаковки мышечных волокон неодинакова. В одних регионах они неоднородны по толщине, расположены рыхло и разделены широкими прослойками соединительной ткани (см. рис. 6), в других — плотно упакованы, практически одинаковой толщины, а соединительнотканный компонент здесь представлен тонкими прослойками (см. рис. 7). Мозаичная картина с сочетанием в пределах мышцы регионов с разным структурным оформлением может отражать асинхронное формирование мышцы, что совпадает с данными литературы [9].
При сравнительной оценке структурного состояния четырехглавой мышцы бедра выявлено, что в образцах Б-79 волокна в пределах одного пучка неоднородны по толщине: более толстые характеризуются эксцент-
ричным расположением ядер, другие вдвое тоньше, с центральным расположением ядер. Волокна объединены в пучки вариабельной толщины (см. табл. 1). В образцах Б-56, напротив, мышечные волокна одной толщины (меньше, чем у образцов Б-79) и формируют практически одинаковые по толщине пучки. При этом более мощные соединительнотканные прослойки выявлены в образцах Б-56. В то же время по количеству кровеносных капилляров они уступают образцам Б-79 (см. табл. 1).
В грудных мышцах мышечные волокна толще, чем в предыдущий период, в обеих изучаемых сериях. При этом структурная организация грудных мышц отличается от таковой мышц бедра меньшей толщиной мышечных волокон, которые формируют тонкие, рыхло упакованные пучки с хорошо развитыми прослойками соединительной ткани (см. табл. 1, рис. 8).
В поверхностной и глубокой грудной мышцах в образцах Б-79 обнаружено чередование толстых и тонких волокон, тогда как в образцах Б-56 волокна мономорф-ны. В то же время пучки мышечных волокон в образцах Б-79 имеют монотонное оформление, а в образцах Б-56 отмечены более тонкие и более толстые пучки. В образцах Б-56 плотность упаковки пучков мышечных волокон уменьшается благодаря более выраженным, по сравнению с Б-79, прослойкам соединительной ткани. Кроме того, грудные мышцы образов Б-56 превосходят Б-79 по уровню кровоснабжения (см. табл. 1).
Рис. В. Линия Б-56. Область грудины 12-дневного эмбриона. Продольный срез. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид: 1 — хрящевая модель грудной кости с признаками оссификации, 2 — скелетные мышцы, 3 — кожный покров, об. 4, ок. 10;
Б — продольный срез: тонкие мышечные волокна (1) окружены клетками-сателлитами (стрелки), разделены широкими прослойками соединительной ткани, об. 40, ок. 10;
В — поперечный срез: 1 — мышечные волокна, 2 — прослойки соединительной ткани, об. 40, ок. 10
поперечная исчерченность. Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
В — в структуре скелетной мышцы видны мышечные волокна (1) и перимизий (2). Пикрофуксин-фукселин, об. 40, ок. 10;
Г — поперечный срез: пучки мышечных волокон плотно упакованы, разделены прослойками соединительной ткани (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
Д — область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
Е — область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
Ж — поперечный срез: область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
З — область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10
Рис. 10. Линия Б-56.
Мышцы бедра 19-дневного эмбриона. Продольный срез.
Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10.
А — область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон и большим количеством клеток-сателлитов;
Б — тонкие мышечные волокна рыхло упакованы, видны их разветвления и перераспределения
Рис. 11. Линия Б-79.
Грудные мышцы 19-дневного эмбриона. Поперечный срез.
А — видны рыхло упакованные пучки мышечных волокон (1) и соединительнотканные компоненты: эпимизий (2), перимизий (3). Пикрофуксин-фукселин, об. 4, ок. 10;
Б — видны пучки мышечных волокон (1), рыхло упакованные и окруженные соединительной тканью (2).
Гематоксилин и эозин, об. 10, ок. 10
Рис. 12. Линия Б-56.
Мышцы бедра 19-дневного эмбриона. Продольный срез. Пучки мышечных волокон (1) плотно упакованы, разделены прослойками эндо- и перимизия (2).
А — поперечный срез, пикрофуксин-фукселин, об. 40, ок. 10;
Б — продольный срез, гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10
На 19-е сутки эмбриогенеза в мышцах бедра
(рис. 9, 10) отчетливо идентифицируются мышечная и соединительная ткани, которые приобретают характерные тинкториальные свойства при окраске пикро-фуксин-фукселином (модификация метода Ван-Гизо-на): мышечная ткань приобретает коричневато-желтый цвет, соединительная — красный. Соединительная ткань по своей структурной организации приближается к дефинитивной, она формирует типичные эндомизий, пе-римизий и эпимизий. Это свидетельствует о том, что к 19-дневному сроку структура скелетных мышц эмбриона близка к постнатальной. Мышечные волокна и образуемые ими пучки тоньше, чем в предыдущий срок исследования (см. табл. 1); в то же время возрастает плотность их упаковки. Такая картина может отражать процесс дифференцировки мышечной ткани.
Примечательно, что в образцах Б-79 отчетливо видна поперечная исчерченность, которая в этот срок не выявляется в образцах Б-56. Можно полагать, что это связано с большей активностью процессов биосинтеза в мышечных волокнах эмбрионов Б-79, в связи с чем в них образуется больше миофибрилл, чем в серии Б-56.
При сравнительной оценке выявлено, что в четырехглавой мышце бедра в образцах Б-56 пучки различаются по толщине, тогда как в образцах Б-79 мышечные волокна однородны. В то же время пучки мышечных волокон в обеих сериях имеют одинаковую толщину.
По показателю толщины соединительнотканных прослоек образцы Б-56 несколько превосходят образцы Б-79. Различия по количеству кровеносных капилляров в образцах Б-79 и Б-56 нами не выявлены (см. табл. 1).
Грудные мышцы в этот срок имеют выраженное структурное оформление (рис. 11, 12). Мышечные волокна здесь существенно тоньше, чем в мышцах бедра (см. табл. 1), и формируют рыхло упакованные пучки с хорошо развитыми прослойками соединительной ткани.
В грудных мышцах в образцах Б-79 волокна более тонкие и формируют пучки, которые почти вдвое тоньше, чем таковые в образцах Б-56. Образцы Б-56 существенно превосходят образцы Б-79 по толщине эндо- и пе-римизия, в них же отмечено и большее количество кровеносных капилляров (см. табл. 1).
Исследование метаболизма эмбрионального оксида азота. При изучении эмбрионального метаболизма (рис. 13...15) оксида азота установлено, что в гомогенате неоплодотворенного куриного яйца содержатся различные нитро- и нитрозосоединения в концентрации до нескольких мкМоль. С 1-е по 3-и сутки развития их общая концентрация увеличивается до 150 мкМоль. В эмбрионах линий Б-56 и Б-79 пул соединений, накопившихся к 3-м суткам, представлен, главным образом, донорами N0: RSNO, ДНКЖ и RNO2, которые опосредуют физиологические эффекты N0 [21.23]. Содер-
Рис. 13. Зависимость общего содержания доноров N0 в эмбрионах кур линий Б-56 и Б-79 на разных сроках эмбриогенеза
жание доноров в гомогенате эмбриона у эмбрионов Б-56 и Б-79 на 3-и сутки одинаковое; на 4.5-е сутки в эмбрионах Б-56 оно резко снижается при пропорциональном увеличении содержания нитрата. В эмбрионах Б-79 такая трансформация не выявлена. Суммарное содержание нитро- и нитрозосоединений с 4-х по
11-е сутки оставалось стабильным. Это может свидетельствовать о практически одинаковой интенсивности синтеза N0 в сравниваемых группах, а также о различной интенсивности его трансформации, показателем которой служит интенсивность трансформации доноров N0.
После 11-х суток содержание нитро- и нитрозосое-динений в эмбрионе резко возрастает, что может быть связано с активизацией процессов роста и дифферен-цировки, которые сопровождаются активацией N0-^^ тетаз [20].
Содержание доноров N0 в амниотической жидкости оставалось постоянным с 7-х по 14-е сутки, содержание нитрата за пределами амниона также остается стабильным с 7-х по 11-е сутки и увеличивается после 12-х суток, причем между сравниваемыми нами образцами Б-56 и Б-79 выявлены существенные различия (табл. 2).
2. Содержание метаболитов NO, мкМоль, в амнионе и в аллантоисе эмбрионов кур Плимутрок линия Б-79 и Корниш линия Б-56 на 11-е и 14-е сутки инкубации Амнион Аллантоис
Породы,линии
Доноры N0 Доноры N0 NOз-
11-е сутки
Корниш линия Б-56 35±15 10±5 152±15
Плимутрок линия Б-79 5250±250 10±6 4±2
14-е сутки
Корниш линия Б-56 25±10 8,5±1,5 410±30
Плимутрок линия Б-79 5100±270 25±6 16±4
Содержание доноров N0 в тканях зародыша Б-79 и Б-56 на 6-е сутки инкубации было примерно одинаковым (табл. 3). В то же время содержание нитрата существенно различалась: в туловище образцов Б-56 нитрат обнаружен в значительном количестве, в то время как в образцах Б-79 отмечены его следы. На 10.13-е сутки нитрат концентрировался в конечностях, при этом по данному показателю образцы Б-56 достоверно превосходят образцы Б-79.
Полученные результаты соответствует приведенным выше морфологическим данным, согласно которым, на
Рис. 14. Зависимость общего содержания нитрата N0^ в эмбрионах кур линий Б-56 и Б-79 на разных сроках эмбриогенеза
Рис.15. Зависимость общего содержания всех метаболитов N0 в эмбрионах кур линий Б-56 и Б-79 на разных сроках эмбриогенеза
3. Содержание нитро- и нитрозосоединений, нМ/г, в тканях эмбрионов кур Плимутрок линия Б-79 и Корниш линия Б-56*
Туловище Голова Конечности
Доноры N0 N0з- Доноры N0 N0з- Доноры N0 N0з-
6-е сутки
Б79 30±15 0,2±0,1 10±5 2±1 - -
Б56 30±10 370±15 7±3 2±1 - -
10-е сутки
Б79 5,0±2,0 3,6±1,5 12±5 6±4 25±1,5 30±10
Б56 5,0±2,5 68±7,5 10±7 3±1 23±2,0 870±30
13-е сутки
Б79 4,5±2,0 5,8±1,5 50±15 3±1 13±5 19±8
Б56 7,5±2,5 58±8 40±15 5±2 11±4 880±25
Примечание. * В зародыше состав доноров N0 следующий: RSN0 — 20...40 %,
| ДНКЖ — 60...80 %, 1^02 — следы. і
12-е сутки отмечены выраженные признаки дифферен-цировки скелетных мышц, существенное утолщение мышечных волокон и их пучков, развитие соединительнотканного каркаса. В этот срок прогрессивное развитие мышц особенно заметно у эмбрионов Б-56.
Можно полагать, что синтез доноров N0 протекает в системе «амнион-зародыш», и в ней же доноры трансформируются до нитрата, который удаляется за пределы амниона. Вместе с тем, вопрос о продукции доноров N0 в амнионе остается открытым. Но их трансформация в нитрат, по-видимому, происходит в зародыше, поскольку только через него осуществляется выход из системы амнион-зародыш, в то время как в амниотической жидкости нитрат, как и нитрит, отсутствует (см. табл. 3, 4).
Таким образом, после 4.5-х суток N0-зависимые процессы в зародыше продолжаются, но уже исключи-
тельно за счет внутризародышевых источников оксида азота, интенсивность которых, судя по данным табл. 3, пропорциональна интенсивности метаболизма N0.
Имеют ли эти процессы ту же природу, что и процессы на 1.4-е сутки, или иную, пока не известно. Однако их взаимосвязь очевидна — содержание нитрата в мышцах на 18-е сутки прямо коррелирует с его содержанием в аллантоисе (г=0,81). Как видно из данных табл. 4, в образцах мясной линии Б-56 содержание нитрата в мышцах бедра и грудных мышцах, а также в аллантоисе существенно превышает таковые у яичной линии Б-79.
4. Содержание нитро- и нитрозосоединений, нМ/г, в мышцах 18-суточных зародышей у эмбрионов кур Плимутрок линия Б-79 и Корниш линия Б-56 в сравнении с содержанием этих соединений, мкМоль/л, в амнионе и аллантоисе эмбрионов на 12-е сутки*
Мышцы грудные Мышцы бедра и голени Аллантоис Амнион
Б-79
190±14
170±15
<0,1
5200±270
*Коэффициент корреляции между содержанием нитрата в амнионе и в мышцах, исходя из данных таблицы, равен 0,79.
Обсуждение
В результате проведенных исследований установлены как общие закономерности, так и особенности гистогенеза скелетных мышц у изучаемых линий кур, а также определены корреляции между структурным состоянием и биохимическими показателями, отражающими характер их дифференцировки и направление морфологических преобразований.
Так, у эмбрионов сравниваемых линий Б-56 и Б-79 темпы развития четырехглавой мышцы бедра опережают таковые грудных мышц, что подтверждается более ранней дифференцировкой в их структуре мышечных волокон и их пучков. По нашим данным, по показателям толщины мышечных волокон и их пучков мышцы бедра опережают грудные мышцы, а по показателям толщины соединительнотканных прослоек отстают от них. Эти закономерности ростовых процессов противоположны таковым в постна-тальном онтогенезе [1, 3, 4, 8, 12, 13], в ходе которого грудные мышцы по темпам утолщения мышечных волокон и их пучков превосходят мышцы бедра, а по развитию соединительной ткани уступают им. Морфогенез мышечных волокон проявляется, в частности, их утолщением и истончением или формированием волокон разной толщины в пределах одного пучка, что соответствует известной закономерности формирования мышц [9].
При сравнительной оценке изучаемых линий выявлено, что у яичной линии Б-79 к 6-м суткам зачатки мышц бедра и грудных мышц дифференцированы лучше, чем у мясной линии Б-56. Это проявляется формированием мышечных волокон и их пучков. У Б-56 процесс миогенеза, по-видимому, менее активен, при этом в зачатке мышц бедра мышечные волокна единичны, а в грудных мышцах они не визуализируются. Данной морфологической картине соответствует определенный биохимический статус, а именно близкие значения содержания доноров N0 в тканях зародышей Б-79 и Б-56 при наличии нитрата в туловище Б-56.
Линия
RN0+
RN02
1300±72
860±44
135±18
На 12-е сутки эмбриогенеза наблюдали утолщение мышечных волокон по сравнению с предыдущим сроком. На этом фоне у яичной линии, в отличие от мясной, отмечена дифференцировка мышечных волокон на толстые и тонкие. Мышечные волокна при этом образуют пучки, которые неоднородны в грудных мышцах и мышцах бедра. Так, у яичной линии Б-79 в мышцах бедра отчетливо видны более толстые и более тонкие пучки, тогда как грудные мышцы сформированы пучками, однородными по толщине. В образцах Б-56 наблюдали обратную картину: мышцы бедра сформированы пучками, однородными по толщине, в то время как в грудных мышцах пучки подразделяются на тонкие и толстые. Соединительная ткань в образцах обеих линий лучшего развития достигает в мышцах бедра. При этом более мощные соединительнотканные прослойки наблюдают у мясной линии Б-56. Морфологическая картина прогрессирующей дифференцировки мышечной ткани коррелирует с биохимическими данными, согласно которым, в период с 7-х по 11-е сутки содержание нитрата за пределами амниона также остается стабильным, существенно возрастая после 12-х суток. По этому показателю образцы Б-56 достоверно превосходят Б-79.
К 19-м суткам мышечная ткань приобретает характерные тинкториальные свойства. При этом в образцах Б-79 в мышцах бедра появляется поперечная ис-черченность, что свидетельствует об опережающих темпах формирования миофибрилл по сравнению с мышцами Б-56. Примечательно, что у Б-79 мышечные волокна становятся однородными по толщине независимо от топических особенностей. Образуемые ими пучки также однородны по толщине, но в бедренных мышцах они мощнее, чем в грудных. У эмбрионов Б-56 в мышцах бедра мышечные волокна дифференцированы на тонкие и толстые, что не выражено в грудных мышцах. Вместе с тем, пучки мышечных волокон толще почти вдвое в грудных мышцах, чем в бедренных и в изучаемых мышцах Б-79. Соединительнотканные прослойки также мощнее в мышцах мясной линии Б-56. Такая дифференцировка хорошо коррелирует с метаболическим статусом. Так, установлено, что содержание нитрата в мышцах на 18-е сутки находится в прямой зависимости от его содержания в аллантоисе и имеет специфические показатели для Б-79 и Б-56. При этом содержание нитрата в мышцах бедра и грудных мышцах Б-56 значительно выше, чем в аналогичных структурах Б-79.
Выводы
На основании полученных данных можно заключить, что на ранних этапах развития эмбрионы яичной линии Б-79 опережают аналогов мясной линии Б-56 по темпам дифференцировки зачатков мышц, а на финальных этапах пренатального развития — по появлению феномена поперечной исчерченности. Однако эмбрионы Б-56 не уступают возрастным аналогам Б-79 к 12-м суткам по показателям толщины мышечных волокон и их пучков, а к 19-м суткам эмбриогенеза превосходят их по этому показателю (грудные мышцы) и по развитию соединительнотканного каркаса (грудные и бедренные мышцы).
Установлено, что существует взаимосвязь между морфологическими характеристиками развивающейся мышцы и показателями эмбрионального метаболизма оксида азота. Так, на ранних этапах дифференци-ровки скелетных мышц, несмотря на некоторые их морфологические отличия (зачатки мышц лучше дифференцированы у Б-79) содержание оксида азота и его доноров в сравниваемых группах практически одинаково. К 12-м суткам содержание оксида азота вне амниона существенно увеличивается, а на 18-е сутки концентрация этого соединения в мышцах и аллантоисе имеет прямую корреляционную связь.
Очевидно, что морфологические признаки, отражающие процессы дифференцировки и роста скелетных мышц, у мясной линии Б-56 выражены не столь ярко, как у яичной Б-79. Можно полагать, что миогенез у Б-56 активизируется несколько позже, чем у Б-79.
Результаты проведенных комплексных морфологических исследований не только вносят дополнения в сведения об эмбриогенезе скелетных мышц птиц, но и являются базовыми для использования в практическом птицеводстве, поскольку служат научным обоснованием внедрения перспективного метода экспресс-оценки принадлежности эмбриона к мясному или яичному направлению по содержанию метаболитов оксида азота.
Библиография
1. Баданина, А.В. Возрастные изменения мышц кур кросса «Смена-4» при напольном содержании: дис. ... кандидата биологических наук: защищена 16.00.02. / А.В. Баданина — Иваново, 2006. - 126 с.: ил. РГБ ОД, 61 06-3/983
2. Боголюбский, С. И. Селекция сельскохозяйственной птицы / С.И. Боголюбский. — М.: Агропромиздат, 1991. — 285 с.
3. Бусева, Л.В. Возрастная морфология скелета и мышц плечевого пояса кур кросса «Хай-секс-браун»: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Л.В. Бусева — Брянск: Новозыбко-вская городская типография 2011. — 18 с.
4. Вракин, В.Ф. Анатомия и гистология домашней птицы / В.Ф. Вракин, М.В. Сидорова. — М.: КолосС, 2001. — 426 с.
5. Данилов, Р.К. Пролиферация и дифференцировка изолированных клеток и симплас-тов скелетной мышечной ткани куриных эмбрионов / Р.К. Данилов, З.Б. Ишмеева // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии, — 1988. — Т. 94. — № 1. — С. 79-83.
6. Данилов, Р.К. Миосателлитоциты как источник регенерации скелетной мышечной ткани / Р.К. Данилов, Х.Х. Мурзабаев, И.А. Одинцова, Э.А. Елагина // Успехи современной биологии. — 2002. — Т. 122. — № 3. — С. 272-280.
7. Данилов, Р.К. Раневой процесс: гистогенетические основы / Р.К. Данилов. — СПб.: ВМе-дА им. С.М.Кирова, 2008. — 380 с.
8. Жемухова, М.Ч. Мускулатура крыла домашних кур в постнатальном онтогенезе: автореф. дисс. канд. биол. наук, 2000 / М.Ч. Жемухова. — Ставрополь., 1999. — 20 с.
9. Клишов, A.A. Гистогенез соматической мускулатуры и ее нервных элементов: автореф. дис. ... канд. мед. наук / A.A. Клишов. — Л., 1960.
10. Клишов, A.A. Гистогенез и регенерация тканей / A.A. Клишов. — Л.: Медицина, 1984. — 232 с.
11. Кочиш, И.И. Совершенствование и разработка эффективных методов селекции мясной птицы: автореф. дис. ...докт. с/х. наук / И.И. Кочиш. — М., 1992. — 37 с.
12. Пануев, М.С. Анатомо-гистологические изменения мышц у мясных кур с возрастом: автореф. дис. ... канд. биол. наук, 2008 / М.С. Пануев. — Иваново: Ивановская ГСХА им. Академика Д.К. Беляева, 2007. — 21 с.
13. Перевозчикова, В.Н. Морфометрическая характеристика тушек и химический состав мышц цыплят-бройлеров кросса «Смена-7»: автореф. дис. ... канд. биол. наук. / В.Н. Перевозчикова. — М.: 11-ый формат. — 18 с.
14. Титов, В.Ю. Окись азота в эмбриогенезе / В.Ю. Титов, Э.З. Винникова, В.И. Фиси-нин, Г.Н. Близнецова, М.И. Рецкий // Доклады РАСХН. — 2008. — Т. 34. — №4. — С. 44-46.
15. Титов, В.Ю. Метаболизм окиси азота в эмбрионах быстро и медленнорастущих форм сельскохозяйственной птицы / В.Ю. Титов, Н.С. Акимова, Э.З. Винникова, В.И. Фиси-нин // Доклады РАСХН. — 2009. — Т. 35. — №4. — С. 47-48.
16. Титов, В.Ю. Метаболизм оксида азота в тканях зародыша птиц / В.Ю. Титов, О.В. Косенко, Н.С. Акимова, В.И. Фисинин // Доклады РАСХН. — 2013. - Т .39. — №4. — С. 44-47.
17. Титов, В.Ю. Определение нитрита и нитрозосоединений в биосистемах калориметрическим методом / В.Ю. Титов, Ю.М. Петренко, А.Ф. Ванин, И.И. Степуро // Биофизика. — 2010. — Т. 55. — №1. — С. 95-106.
18. Титов, В.Ю. Ферментативный сенсор для определения содержания нитро- и нитрозосоединений в биообъектах / В.Ю. Титов, Ю.М. Петренко, А.Ф. Ванин // Клиническая лабораторная диагностика. — 2009. — № 9. — С. 6-14.
19. Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Способ определения нитрозосоединений и нитрита в биообъектах. // Патент РФ №2395096, рег. 20 июля 2010 г.
20. Severina, I. Activation of soluble guanylate cyclase by NO donorsnitrosothiols, and dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands / I. Severina, O. Bussy-gina, N. Pyatakova, I. Malenkova and A. Vanin // Nitric Oxide. — 2003. — V. 8. — P.155-163.
21. Titov, V.Yu. The Enzymatic Technologies Open New Possibilities for Studying Nitric Oxide (NO) Metabolism in Living Systems / V.Yu. Titov // Current Enzyme Inhibition. — 2011. — V. 7. — N. 1. — P. 56-70.
22. Titov, V. Significance of Nitrogen Oxide and Its Metabolites in the Development of Embryos / V. Titov, E. Vinnikova, V. Fisinin, G. Bliznetsova and M. Retsky // Russian Agricultural Science. — 2008. — V. 34. — P. 264-265.
23. Vanin, A. Dinitrosyl iron complexes with thiolate ligands: physicochemistry, biochemistry and physiology / A. Vanin // Nitric Oxide. — 2009. — V. 21. — P. 1-13.
24. Lee, H. Nitric Oxide as a messenger molecule for myoblast fusion / H. Lee, M. Baek, K. Moon, W. Song, Ch. Chung, D. Ha, M-S. Kang // J. Biol. Chem. — 1994. — V. 269. — P.14371-14374.
25. Ignarro, L. Biological actions and properties of endothelium-derived nitric oxide formed and released from artery and vein / L. Ignarro // Circulation Research. — 1989. — V. 65. — P. 1-21.
SUMMARY
E.N. Borkhunova1, G.V. Kondratov1, V.Y. Titov2
1 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin (Moscow).
2 All-Russian Scientific Research and Technological Institute of the Poultry Raising (Sergiev Posad).
Morphobiochemical Characteristic of Skeleton Muscles of Hens in an Embryogenesis on an Example of Lines E-56 and E-79. On the basis of histological, morphological and biochemical methods the general patterns and features of a histogenesis of skeleton muscles (pectoral muscles and a hip muscle) in embryos of lines E-79 (meat-egg) and E-56 (meat) are studied. Are taped structural and morphological differences of developing muscles at studied lines of hens, and also correlations between a structural condition and the biochemical indicators reflecting features of their differentiation are defined transformations.
«Journal of Small Animal Practice/Российское издание» —
первое переводное научно-практическое издание для ветеринарных врачей, освещающее проблемы лечения и профилактики заболеваний мелких домашних животных.
Оригинальное издание «Journal of Small Animal Practice» —
официальный печатный орган Всемирной ассоциации ветеринарии мелких домашних животных (WSAVA) и Британской ассоциации ветеринарии мелких домашних животных (BSAVA)
Подписка на журнал осуществляется через редакцию и каталог Почта России.
Издательский дом «Логос Пресс», 127055, Москва, а/я 9.
Http://logospress.ru/, e-mail: [email protected].
Тел/факс: +7 (495) 220-48-16
