CC BY
62
УДК 631.95:579.864.1.663.12.
молочнокислые бактерии разных природно-климатических зон*
О.Д. СИДОРЕНКО, доктор сельскохозяйственных наук, профессор
РГАУ-МСХА имениК.А. Тимирязева, ул. Тимирязевская, 50, г. Москва, 127550, Россия Е-таИ: soleg39@mail.ru
Резюме. Рассматриваются физиолого-биохимические особенности лактобактерий, выделенных из молочных продуктов разных географических зон. Формирование функциональных групп и специфических сообществ микроорганизмов зависит от климатических условий. Основная цель исследований - детекция приобретенной устойчивости к антибактериальным препаратам у природно-чувствительных к ним лактобактерий молочных продуктов. Появление у микроорганизмов новых механизмов резистентности к антибиотикам разных классов потребовало четкой оценки микрофлоры молочных продуктов. Для характеристики биохимических особенностей лактобак-терий использовали современный анализатор Easy-Xyty, ИК-спектроскопию, ион-селективные электроды, физиологическую активность молочнокислых бактерий определяли по чувствительности их к антибиотикам (аминогликозидам, макролидам и В-лактамных классов) диско-диффузным методом. Установлена приобретенная устойчивость микроорганизмов молочных продуктов южной зоны. Географический и экологический факторы изменяют качественный состав, биохимическую активность и резистентность бактерий в природе, а также формируют функциональные группы микроорганизмов. впервые на примере лактобактерий и дрожжей молочных продуктов разных географических зон установлена зависимость физиологических особенностей микроорганизмов от их местообитания. Лактобактерии и дрожжи южной зоны можно с успехом использовать при создании продуктов питания для населения с ослабленным иммунитетом.
Ключевые слова: эпифиты, геобиофизика, филлосфера, тест-организм, резистентность, микроклимат, пигментация, иммунитет, ферменты.
Для цитирования: Сидоренко О.Д. Молочнокислые бактерии разных природно-климатических зон // Достижения науки и техники АПК. 2014. №12. С. 63-66.
Распределение элементов климата, радиационного баланса, растительности подчинено закону географической зональности, а всю систему биогеохимических циклов контролируют бактерии. Географическая среда вызывает к жизни разнообразные ассоциации микроорганизмов филлосферы, ризосферы и педосферы, то есть формирует специфические сообщества, сопряженные трофическими связями, процессами превращения и миграции веществ. Транспорт веществ, в свою очередь, обусловлен внешней энергией, источником которой для поверхности Земли служит поглощаемая радиация Солнца. При этом существует определенная закономерность распространения физиологических групп микроорганизмов по местообитанию, а физические условия среды во многом определяют их функциональные особенности.
Известно, что состояние здоровья человека и продолжительность его жизни во многом зависят от характера экологической среды и качества питания. Анализ заболеваемости населения выявляет высокий уровень патологий, связанных с дисбактерио-зом. Нормальная кишечная микрофлора принимает участие в водно-солевом обмене, способствует
правильному функционированию пищеварительной, сердечно-сосудистой, иммунной и других систем нашего организма.
Один из основных компонентов микрофлоры кишечника человека - молочнокислые бактерии (лактобактерии), положительное влияние которых на организм многогранно. Однако напряженность экологических условий, прием антибиотиков и других антимикробных препаратов, широкое использование консервантов при производстве продуктов питания приводят к их угнетению. Поэтому одно из направлений решения проблемы антибиотикотерапии - поиск устойчивых природных штаммов лактобактерий.
Для прокариот геобиофизические факторы имеют принципиальное значение [1-6]. Специальные исследования широтно-зонального распределения микроорганизмов начал в середине ХХ века Е.Н. Мишустин. На примере спорообразующей почвенной бактерии рода Bacillus удалось вполне убедительно показать закономерное изменение таксономической структуры вдоль широтно-зонального градиента. Изучение особенностей распространения бацилл в различных типах почв привело к возникновению особого эколого-географического направления почвенной микробиологии и формированию убеждения о том, что закон широтной зональности распространяется на все микроорганизмы. Действительно, физические условия обитания во многом определяют поведение организма, зависящее прежде всего от его морфологии.
Однако подобные исследования лактобактерий и дрожжей молочных продуктов в литературе практически отсутствуют. Хотя их результаты должны заинтересовать специалистов-технологов. Особенно это необходимо при подборе высокотехнологичных штаммов для производства низкоаллергенной продукции профилактической направленности, основу которой составляют продукты частичного протеолиза молока.
В определенной экосистеме на поверхности растения поглощение лучистой энергии и биохимическая активность микрофлоры филлосферы взаимосвязаны. Филлосфера - это гетерогенное и достаточно экстремальное местообитание микроорганизмов. Она характеризуется сложной пространственной структурой, разнообразием микроклиматических условий на листьях разных ярусов и на поверхности отдельного листа [7], создавая специфические эко-ниши. Граница раздела внешней среды, с которой взаимодействует поверхность (кутикула), проявляет необычные свойства и определяет специфику формирования микроорганизмов с высокой биохимической активностью, пигментацией и др. Наши наблюдения позволяют высказать, уже не новое предположение [8], об адаптивном значении образования каротиноидных пигментов и протекторной их функции от солнечной радиации [9]. Кроме того, кутикула как защитный гидрофобный слой листа, участвует в разнообразных процессах, обеспечивая селективность поглощения и выделения из растения
*Автор глубоко благодарен всем за предоставленные для эксперимента образцы молочных продуктов. Достижения науки и техники АПК. 2014. Т 28. № 12 _
различных продуктов. Особенность листа состоит не только в поглощении света и его рассеивании, но и в привлечении разнообразных микроорганизмов. Интенсивная солнечная инсоляция определяет степень колонизации филлосферы микроорганизмами, выживаемость которых в большей степени зависит от влажности и способности метаболизировать антимикробные вещества [7, 10].
Ультрафиолетовое (УФ) излучение - важный экологический фактор, влияющий на растения. Это часть электромагнитного излучения Солнца, которая составляет около 7% общей солнечной радиации, достигающей поверхности Земли [8]. На листе растения бактерии защищены от облучения УФ складками и выступами кутикулы и индифферентны к действию солнечного света. Микроклимат на поверхности листьев определяет физиологические особенности самих растений и эпифитных микроорганизмов. Особенно в высокогорье, где интенсивность естественного УФ высока. Здесь растения характеризуются ксероморфной структурой: наличием толстой кутикулы, увеличением числа клеток и устьиц на единицу поверхности листа, а также количества гран в хлоропластах и тилакоидов в гране [8], что может определять трофический потенциал поверхности листа.
Микробное сообщество листа представляет собой совокупность взаимодействующих организмов. Значение кооперативных трофических взаимоотношений в таком ценозе установить не просто, поскольку трофический потенциал, по-видимому, сильно варьирует по микролокусам и соответственно различные микробные биопленки (возможно и одиночные клетки) развиваются в разных условиях [11].
Кроме того, на микробиоту активно влияет радиационный баланс географических систем. Поэтому для микробиолога важнее площадное распределение физико-географических условий, которые определяются температурами и другими геофизическими полями, включая магнитные, электрические, радиационные и гравитационные, а также распределениями их активностей. Можно предположить, что селективным рычагом в формировании определенных групп эпифитных микроорганизмов служат абиотические факторы местонахождения растения.
Взаимодействие микроорганизмов с растительным покровом не может рассматриваться вне связи с климатом. Микробные консорциумы тесно связаны единством пространства местообитания и характеризуются «мини-циклами», не допускающими выхода промежуточных продуктов вовне сообщества. Они имеют общие трофические связи и взаимодействуют, несмотря на филогенетическую удаленность групп организмов [12].
По-видимому, разнообразие экологических условий определяет географическое распространение лактобактерий и дрожжей, их морфо-биологические особенности и иммунозначимость. Последнее лежит в основе системы требований при селекции и отборе культур лактобактерий по степени устойчивости к антибиотическим, химиотерапевтическим, химическим препаратам, обладающим широким антимикробным спектром действия. Ряд международных организаций (ВОЗ, МЭБ, EFSA) уже предложили рекомендации по рациональному применению антибиотиков и надзору за резистентностью с целью ограничения распространения устойчивых патогенных штаммов микроорганизмов.
Имеются сведения о выраженной противоопухолевой активности LactobacШusacidophilus, обусловленной уменьшением концентрации нитрозаминов до родственных вторичных аминов, нитрит-ионов и других летучих метаболитов [13]. Получены данные о том, что на фоне приема лактобактерий происходит снижение артериального давления у больных гипертензией [5], а бактериоцины, синтезируемые упомянутыми микроорганизмами, снижают нагрузку на печень путем уменьшения образования аминов, энтеротоксинов и других метаболитов микробного происхождения. Большое значение имеет способность лактобактерий синтезировать антибиотические вещества [6], обладающие иммуномодуляторными свойствами [14].
Возможность конструирования новых бактерио-цинов путем создания разнообразных композиций лечебно-профилактических молочных продуктов питания и препаратов - перспективное направление в специфической профилактике и замене некоторых антибиотиков при лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта человека и животных.
В связи с этим необходимо использовать потенциальные возможности природных штаммов, среди которых существуют бактерии устойчивые к антибиотикам. Это природное свойство обусловлено видовыми особенностями микроорганизмов, которые могут иметь несколько генов резистентности, кодирующих устойчивость к нескольким препаратам одного класса (перекрестная резистентность) или группу генов, обусловливающую устойчивость к нескольким классам антимикробных препаратов (ассоциированная резистентность). Такие штаммы имеют большое значение в биотехнологии производства новых функциональных молочных продуктов питания для людей, страдающих непереносимостью белков молока.
Наши исследования посвящены сравнительной характеристике дрожжей и лактобактерий молочных продуктов разных географических зон.
Условия, материалы и методы. Мезофильные и термофильные лактобактерии и дрожжи выделяли из кисломолочных лечебно-профилактических национальных продуктов, производимых традиционными способами в различных географических зонах: Адыгея, Башкирия, Белоруссия, Болгария, Дагестан, Карачаево-Черкесия, Литва, Московская обл. (Волоколамск). В работе использовали принятые в микробиологии и биохимии методы. Резистентность к аминогликозидам, макролидам и В-лактамным классам антибиотиков определяли на плотных питательных средах [15]; ОВП и концентрацию растворенных соединений (О2, Н^, NH3, Мд, Са и др.) в биологической пробе супер-натанта кисломолочных продуктов, полученных на основе выделенных штаммов, измеряли с помощью ион-селективных электродов ^Е) на анализаторе Easy-Xyty; супернатант анализировали методом ИК-спектроскопии в средней области длин волн (400-4000 см-1), содержание общего белка и общей амилазы определяли на биохимическом анализаторе открытого типа Labio-200.
Физиологическую активность лактобактерий и дрожжей определяли по их отношению к антибиотикам диско-диффузным методом. Штаммы лактобактерий и дрожжей, выделенные из кисломолочных продуктов и заквасок семи географических зон, те-
Таблица. действие антибиотиков на развитие географических рас дрожжей*
Образец Пенициллин Ампицилин Оксациллин Неомицин Стрептомицин Эритромицин Олеандомицин
Москва +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ +++ +++
Беларусь ++ ++ ++ ++++ ++++ ++++ ++++
Башкирия ++ +++ +++ +++ +++ ++ ++
Адыгея + + + +++ +++ ++ +++
Болгария ++ ++ ++ ++ ++ + +
Дагестан + + + + + + +
*степень чувствительности штаммов дрожжей к антибиотику: +++++ - максимальная; +++ - средняя; + - минимальная.
стировали на резистентность к антибиотикам разных групп (табл. 1). Чувствительность тест-организмов определяли с помощью линейки-лекало (рис. 1), измеряя расстояние от «блочка», пропитанного антибиотиком, до точки начала роста тест-организма. На некоторых штаммах отмечали минимальную ингиби-рующую концентрацию (МИК) химиотерапевтиче-ского препарата (ХТП), подавляющую развитие или задерживающую рост испытуемого штамма микроорганизма в единице объема питательной среды. Тест-организмы, нечувствительные к антибиотику, развивались по всей поверхности чашки (сплошной «газон»), включая площадь «блочка».
результаты и обсуждение. В наших исследованиях штаммы, выделенные из белорусских молочных продуктов, относились к среднечувстви-тельным (размер зоны подавления роста составлял 10-14 мм), а дагестанские штаммы - к слабочувствительным (размер ингибирующей зоны -8-9 мм). Результаты ИК-спектроскопии продукта, полученного из белорусских штаммов, показали полосы поглощения в области 1075-1098 см-1, что может свидетельствовать об ассиметричных колебаниях кольца ароматических соединений. Отмечена также интенсивная полоса поглощения кольцевых колебаний алкилциклобутана при 910 см-1 с коэффициентом пропускания 11%, что было ниже концентрации этого вещества в продукте из дагестанских штаммов в 2 раза. Содержание общего белка и общей амилазы также оказалось выше у дагестанских штаммов лактобактерий (в 4 и 1,5 раза соответственно).
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о неодинаковой чувствительности лактобактерий и дрожжей к антибиотикам, ин-гибирующим синтез белка и клеточной стенки
x
1-пенициллин
2-неомицин
3-ампициллин
4-оксациллин
5-эритромицин
6-стрептомицин
7- олеандомицин
рисунок. Резистентность дрожжей рода Saccharomycessp (Дагестан).
(пептидогликана), нарушающим функции мембран и метаболизм клетки в целом. Антибиотики подавляют белковый синтез бактерий вследствие обратимого связывания с 50S субединицей рибосом, что нарушает образование пептидных связей. Как известно, при биосинтезе пептидогликана задействовано много ферментов, которые работают в разных местах микробной клетки. Он образуется в боковых стенках клетки, округленных полюсах и перегородках микроба, все эти образования синтезируют ферменты, на которые могут действовать В-лактамные антибиотики. Молекулы пеницил-линов способны блокировать центры фермента и ингибировать синтез пептидогликанов, разрушение которых вызывает лизис клетки. Подобное явление наблюдается при выращивании микроорганизмов без лизина или его предшественника - дипиколи-новой кислоты [14]. Для лактококков чувствительность к пенициллину - видовой признак. Штамм Lactococcussp., выделенный из дагестанских продуктов, оказался устойчив к этому антибиотику, что можно использовать при изготовлении лечебного молочного препарата.
В целом молочнокислые бактерии, резистентные к испытуемым антибиотикам разных групп, чаще наблюдаются среди южных изолятов, в белорусских молочных продуктах встречаются, как правило средне- и, очень редко, слабочувствительные штаммы лактобактерий. Наименьшая резистентность отмечена у микроорганизмов, выделенных из молочных продуктов Московской обл. (Волоколамск). Они оказались самыми чувствительными к испытуемым антибиотикам. При этом более кислотоустойчивые штаммы (болгарская и ацидофильная палочки) слабее реагировали на некоторые антибиотики. Особенно четкая зависимость антибактериального действия просматривается при изучении аминогликозидных соединений, синтезируемых актиномицетами.
При использовании микролидных антибиотиков (эритромицин, олеандомицин), обладающих высокой активностью, но узким спектром действия, установлена довольно отчетливая географическая связь отзывчивости штаммов лактобактерий и дрожжей. Их устойчивость к лекарственным препаратам, по-видимому, имеет природное происхождение, то есть обусловлена видовыми свойствами микроорганизма. Контроль устойчивости клетки у них либо в хромосоме, либо в плазмиде (R-плазмиде). Кроме того, факторами резистентности могут выступать непроницаемость клеточной стенки, снижение концентрации антибиотика внутри клетки в результате его разрушения конститутивными или индуцибельными ферментами, активного выведения и др.
Резистентность дрожжей более выражена у штаммов, полученных из дагестанских продуктов. Практически все штаммы дрожжей (рода Saccharo-myces, Candida) южной зоны устойчивы к пеницил-
лину и другим шести антибиотикам разных групп (см. рисунок). Приведенные примеры указывают на наличие защитной функции определенных ферментов, которые превращают молекулу антибиотика в биологически неактивный аналог, что служит биохимической защитой клетки в процессе развития микроорганизма.
выводы. Штаммы лактобактерий и дрожжей, выделенные из молочных продуктов контрастных типов экосистем, по-разному противостоят антибиотикам, способным вызывать нарушения жизненно важных реакций клетки. Аминогликозидные, В-лактамные и макролидные группы антибиотиков проявляют неодинаковую активность в подавлении роста отдельных видов молочнокислых бактерий и дрожжей разных эколого-географических зон.
При отборе ценных форм лактобактерий, кроме активности протеолиза, кислото- и ароматообразования, необходимо учитывать устойчивость к лекарственным препаратам. Индифферентность микроорганизмов к антибиотикам можно использовать в практических целях (здравоохранении, пищевой промышленности и сельском хозяйстве).
Сравнительный анализ резистентности лактобактерий и дрожжей различных местообитаний может быть целесообразен для характеристики физиологических свойств и оценки уровня потенциальных возможностей лакто-дрожжевого сообщества при изготовлении национальных лечебно-профилактических продуктов питания.
Чувствительность штаммов лактобактерий и дрожжей к антибиотикам соответствует условиям обитания микроорганизмов, имеет природное происхождение и, по-видимому, может служить не только феноти-пическим, но и обязательным признаком. Плазмиды клеток, несущие гены лекарственной устойчивости, могут передаваться с продуктом макроорганизму и патогенным бактериям.
Представленные результаты можно рассматривать не только как пример реакции биологической системы на специфическое воздействие лекарственных препаратов определенной химической структуры. Установленная географическая зависимость распространения конкретных резистентных лактобактерий и дрожжей позволит глубже анализировать концептуальные связи в сложных природных системах.
Литература.
1. Бутова С.Н., Типисева И.А., Эль-Регистан Г.И. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. М.: «Элевар», 2003. 553 с.
2. Ганина В.И., Королева Н.С., Фильчакова С.А. Техническая микробиология продуктов животного происхождения: уч. пособие. М.: ДеЛи принт, 2008. 352 с.
3. Глушакова А.М. Экология эпифитныхдрожжей: дисс. канд.биол.наук. М.:МГУ, 2006. 145 с.
4. Красильников Н.А. Микроорганизмы почвы и высшие растения. М.: Изд. АН СССР, 1958. 464 с.
5. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. М.: «Дрофа», 2010. С. 639.
6. Влияние пробиотического сердечного сыра «Harmony», содержащего бактерии L.plantarum TENSIADSM21380, на артериальное давление и метаболические показатели здоровья / М. Микельсаар, П. Хютт, Е. Щепетова, И. Смидт, Е. Шкут, М. Рятсеп, М. Зильмер, Э. Сонгисэпп//Вопросы питания. 2012. Т 81. №3. (Эстония).
7. Глушакова А.М., Чернов И.Ю. Сезонная динамика структуры сообществ эпифитных дрожжей //Микробиология. 2010. Т.79. №6. C. 832-842.
8. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука, 2004. 347с.
9. Мишустин Е.Н. Закон зональности и учение о микробных ассоциациях почвы.// Успехи соврем. биол. 1954. Т.37. №1. С. 1-27.
10. Стоянова Л.Г. Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование: автореф. докт.биол.наук. М.: МГУ, 2008. 47 с.
11. Сидоренко О.Д., Харькова А.П. Влияние географического фактора на лактобактерии и дрожжи молочных продуктов. // Известия ТСХА. 2014. № 2. С.148-153.
12. Джунипер Б.Э., Джеффри К.Э. Морфология поверхности растений (пер. с англ.). М.:«Агропромиздат», 1987. 159 с.
13. Возняковская Ю.М. Эпифитные дрожжевые организмы. //Микробиология. 1962. Т. 31. №4. С. 616-620.
14. Бибикова М.В., Блинкова Л.П., Егоров А.М. Бактериальные пептиды с антимикробным и иммуномоделирующим действием //Матер. 3 междун. биотехнол. конгресса. М., 2007. С. 65.
15. Некоторые физиологические свойства и каратиносинтезирующая способность дрожжей эпифитной микрофлоры высокогорных районов Кавказа / Е.И. Квасников, Т.А. Гринберг, И.Ф. Щелокова, В.Т. Васкивнюк// Микробиол. 1974. Т.36. №4. С. 429-434.
lactic acid bacteria from different climatic zones
o. D. Sidorenko
Russian State Agrarian University-Moscow Timiryazev Agricultural Academy, Timiryazevskaya st., 49, Moscow, 127550, Russia Summary. Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria isolated from dairy products from various geographic zones were examined. Formation of functional groups and specific colonies of microorganisms depends on climatic conditions. The main purpose of the research was the detection of acquired resistance to antimicrobial agents of natural sensitive lactic bacteria from dairy products. The appearance of new mechanisms of resistance to antibiotics of different classes in microorganisms demanded a clear assessment of microflora in dairy products. To characterize the biochemical features of lactic bacteria modern analyzer Easy-Xyty, infrared spectroscopy, ion-selective electrodes were used; physiological activity of lactic acid bacteria was determined by their sensitivity to antibiotics (aminoglycosides, macrolides and B-lactam classes) by disco-diffusion method. The acquired resistance of microorganisms from dairy products from southern zone was revealed. Geographical and environmental factors change the qualitative composition, biochemical activity and resistance of bacteria in nature, and also form the functional groups of microorganisms. For the first time by the example of lactic bacteria and yeasts from dairy products of different geographical zones the dependence of the physiological characteristics of microorganisms from their habitat was determined. Lactic acid bacteria and yeast from southern zone can be successfully used for creating food for people with weakened immune systems.
Keywords: epiphytes, geobiophysics, fillosphere, test organism, resistance, microclimate, pigmentation, immunity, enzymes. Author Details: O.D. Sidorenko, Dr. Agricultural Sci., Prof. (e-mail: soleg39@mail.ru).
For citation: Sidorenko O.D. Lactic acid bacteria of different natural-climatic zones. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2014. T. 28. №12. pp. 63-66 (In Russ)
