CC BY
127. Evans M.J., Dekker N.P., Cabral-Anderson L.J. et al. Quantitation of damage to the alveolar epithelium by means of type 2 cell proliferation // Am Rev Respir Dis., 1978. - V 118. - № 4. - P. 787-790.
8. Isomura K., Chikahira M, Terannishi K. et al. Induction of mutations and chromosome aberrations in lung cells following in vivo exposure of rats to nitrogen oxides//Mutat. Res., 1984. - V. 136. - P. 119-125.
9. Jodinger S, Seth Y., Seth N. Effect of NOx on the somatic chromosomes goldsmiths // Environ Health Perspect, 1998. - V. 106. - № 10. - P. 643-647.
10. Luhr O.R., Frostell C.G., HeywoodR. et al. Induction of chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes after short time inhalation of nitric oxide // Muta^.Res, 1998. - V. 414. - № 1-3. - P. 107-15.
11. Walles S.A., Victorin K., Lundborg M. DNA damage in lung cells in vivo and in vitro by 1,3-buta-diene and nitrogen dioxide and their photochemical reaction products // Mutat. Res., 1995. — № 328. — P. 11-19.
Материал поступил в редакцию 28.10.05.
L.P.Sychyova, S.M.Sheremetyeva, M.A.Kovalenko, M.A.Pinigin, L.A.Tepikina, V.S.Zhurkov
STUDY OF CYTOGENETIC AND CYTOTOXIC ACTIONS OF NITROGEN DIOXIDE USING A POLYORGANIC MICRONUCLEAR METHOD
A.N.Sysin Research Institute for Human Ecology and Environmental Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Nitrogen dioxide in concentrations of 10.1, 21.1 and 44.93 mg/m3 did not produce any cytogenetic effects on medulla, lung, urinary bladder cells in rats at inhalation for 4,48 and 120 hours. A cytotoxic action displayed by the substance was revealed in all the test groups which was characterized by an increased part of polychromatophilic erythrocytes, formation frequency of two-nuclear cells and cells with central nuclear strangulation in rat urinary bladder and lungs.
УДК 615.111.014.2.014.46
Н.В.Рязанцева1, В.В.Новицкий1, И.А.Шперлинг2*, О.Н.Филиппова1, О.А.Рогов2, Э.В.Сапрыкина1
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ НАРУШЕНИЯ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ МЕТГЕМОГЛОБИНОБРАЗОВАТЕЛЕЙ
1ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» 2Томский военно-медицинский институт Министерства обороны Российской Федерации
У крыс линии Wistar после однократного внутрибрюшинного введения нитрита натрия и солянокислого фе-нилгидразина в дозах DL50 установлено, что нарушения структурного статуса эритроцитарной мембраны у крыс при токсическом действии метгемоглобинобразователей характеризуются возрастанием микровязкости как в области интегральной липидной фазы, так и в области анулярных липидов, а также угнетением активности АТФазы. При этом действие солянокислого фенилгидразина характеризуется более выраженным и длительным мембранодестабилизирующим эффектом. Признаки структурной модификации мембраны эритроцитов при введении нитрита натрия и солянокислого фенилгидразина (DL50) в эксперименте выражены в течение длительного времени (до 21 сут), сохраняясь в период ликвидации метгемоглобинемии.
Ключевые слова: метгемоглобинемия, эритроцит, мембрана, флуоресцентные зонды, активность Ш+,К+-АТФазы
Введение. В последние годы наметилась тенденция к увеличению случаев интоксикации соединениями, обладающими метгемоглобиноб-разующими свойствами [1, 4]. Отравления мет-
* Фрагмент диссертационной работы
гемоглобинобразователями характеризуются скоротечностью и высокой частотой смертельных исходов [9]. Современные сведения о токсикологии метгемоглобинобразователей позволяют говорить о большом многообразии патологических эффектов, вызываемых этими соеди-
нениями, включая метгемоглобинобразование, активацию свободно-радикального окисления, подавление активности антиоксидантных систем клеток, что приводит к изменению структурно-метаболического и функционального статуса эритроцитов [12, 13]. В основе действия метгемоглобинобразующих ксенобиотиков лежит окисление двухвалентного железа гемоглобина в трехвалентное с потерей возможности обратимой связи с кислородом. Основным патогенетическим звеном интоксикации метгемогло-бинобразователями является нарушение кисло-родтранспортирующей функции гемоглобина и блокирование тканевого дыхания вследствие угнетения активности ферментов дыхательной цепи. Вместе с тем, в механизмах формирования данной патологии немаловажное значение могут иметь нарушения структурной организации мембраны красных кровяных клеток. В связи с этим целью настоящего исследования явилось определение характера и динамики нарушений липид-липидных и липид-белковых взаимодействий, изменений активности Ма+,К+-АТФа-зы в эритроцитарной мембране у крыс при экспериментальных метгемоглобинемиях, вызванных однократным токсическим действием нитрита натрия и солянокислого фенилгидразина.
Материал и методы исследования. Эксперименты проведены на 157 крысах-самцах линии массой 190—250 г. Метгемоглобинемию моделировали однократным внутрибрюшинным введением 0,6% раствора нитрита натрия (НН) в дозе 90 мг/кг ^Ь50) (62 крысы) и 2% раствора солянокислого фенилгидразина (ФГ) в дозе 150 мг/кг массы животного ^Ь50) (74 крысы). Полученные результаты сравнивали с аналогичными показателями у 21 интактного животного (группа контроля).
Забор крови у экспериментальных животных осуществляли под эфирным наркозом из хвостовой вены через 1,5 ч, 1, 3, 5, 7, 13 и 21 сут. после введения НН и ФГ. Кровь стабилизировали гепарином (50 Ед/мл). Все вмешательства проводили с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными.
Уровень метгемоглобина (МШЪ) в крови определяли по методу [8].
Мембраны эритроцитов (МЭ) выделяли с помощью гипоосмотического гемолиза эритро-цитарной взвеси [14]. Содержание белка в мембранной суспензии определяли микробиурето-вым методом.
Измерение собственной флуоресценции теней эритроцитов, а также определение спек-
тральных характеристик взаимодействия МЭ с флуорофором пирен проводили на спектроф-луориметре «MPF-4» («Hitachi», Япония). Измерения проводили в среде следующего состава (мМ): NaCl - 145, трис-HCl - 10 (pH = 7,4). Раствор пирена (растворитель — этанол) добавляли в кювету с тенями эритроцитов (содержание белка — 0,3 мг/мл) до конечной концентрации 10 мкМ, инкубировали в течение 10 мин при постоянном помешивании. Для оценки микровязкостных свойств липидной фазы и гидрофобного объема МЭ рассчитывали коэффициент эк-симеризации пирена (I470/I370), равный отношению максимумов интенсивностей флуоресценции эксимерной формы зонда к мономерной при длинах волн возбуждающего света (А,в) 285 и 340 нм. Полярность окружения молекул пирена оценивали по соотношению I370/I390 при \ = 340 нм [3]. Процент индуктивно-резонансного переноса энергии с триптофановых остатков белков на пирен рассчитывали по формуле [5].
Определение активности №+,К+-АТФазы в МЭ проводили методом [7], основанном на накоплении неорганического фосфора (Pi) в инкубационной среде следующего состава (мМ): NaCl — 125, KCl — 25, MgCl2 — 3, ЭДТА — 0,5, АТФ — 2, трис-HCl — 50 (pH=7,4). Инкубацию проводили при 37°С в течение 1 ч. Реакцию останавливали добавлением 20% раствора трихлор-уксусной кислоты. Активность №+,К+-АТФазы рассчитывали как разницу между активностью АТФазы, измеренной в условиях, описанных выше, и активностью АТФазы, определенной в безнатриевой среде в присутствии 125 мМ KCl. Активность фермента выражали в мкмоль P/час-мг белка.
Достоверность различий значений показателей между сравниваемыми группами проводили с использованием t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. Проведенное исследование показало, что через 1,5 ч после однократного введения крысам НН в дозе 90 мг/кг существенно возрастало содержание MtHb в крови. В последующие сроки наблюдения (с 1-х сут и вплоть до окончания эксперимента — 21 сут) уровень MtHb в крови экспериментальных животных не отличался от такового у крыс контрольной группы. Однократное введение крысам ФГ в дозе 150 мг/кг приводило через 30 мин к резкому возрастанию концентрации MtHb в крови. Через 24 ч после введения ксенобиотика уровень MtHb в крови у подопытных животных сохранялся достоверно повышенным. В последующем величина изучаемого показателя по-
Таблица
Показатели флуоресценции зонда пирена в эритроцитарной мембране у крыс после однократного внутрибрюшинного введения нитрита натрия (НН) (90 мг/кг) и солянокислого фенилгидразина (ФГ)
(150 мг/кг) (X±m )
Группа животных Параметры флуоресценции, усл. ед. Величина миграции энергии с триптофана на пирен, %
I470/I370, ^в = 285 нм I470/I370, to = 340 нм I370/I390, to = 340 нм
Контрольная группа 0,402+0,011 0,560+0,014 0,955+0,007 41,4+1,0
Опытная группа
1,5 ч НН 0,237+0,015*** 0,273+0,011*** 0,224+0,006*** 32,0+0,5***
ФГ - - - -
1 НН 0,283+0,011*** 0,311+0,009*** 1,155+0,009*** 33,5+0,4***
ФГ 0,255+0,009*** 0,287+0,012*** 1,360+0,018** 27,9+0,5***
£ 3 НН 0,309+0,013*** 0,343+0,010*** 1,110+0,013*** 34,2+0,6***
о ФГ 0,274+0,012*** 0,311+0,013*** 1,421+0,010*** 28,4+0,4***
te ев И о s ч о о 5 НН 0,314+0,012*** 0,368+0,013*** 1,129+0,015*** 33,8+0,6***
ФГ 0,293+0,013*** 0,329+0,013*** 1,320+0,018*** 30,7+0,6***
К M о ft 7 НН 0,335+0,011** 0,401+0,016*** 1,118+0,008*** 35,2+0,6***
и ФГ 0,346+0,009** 0,373+0,011*** 1,276+0,019** 32,4+0,7***
13 НН 0,371+0,009* 0,472+0,009*** 0,998+0,017 37,6+0,5**
ФГ 0,3650,011* 0,433+0,010*** 1,124+0,013** 34,9+0,5***
21 НН 0,397+0,006 0,533+0,013 0,964+0,011 40,7+0,4
ФГ 0,385+0,011 0,463+0,016** 1,063+0,021* 37,7+0,3**
Примечание: * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,001 по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. X — среднее значение; т — ошибка средней
степенно снижалось и в период с 3-х по 21-е сут эксперимента достоверно не отличалась от нормы (рис. 1).
Определение степени эксимеризации флуоресцентного зонда пирен в МЭ у крыс после однократного воздействия НН позволило установить существенные изменения структуры мембраны в течение 13 сут эксперимента (таблица), характеризующиеся повышением упорядоченности молекул как интегрального липидного бислоя, оцениваемой при А,в = 340 нм (коэффициент 1470Л370), так и анулярной липидной фракции (коэффициент 1470/1370 при А,в = 285 нм). После однократного введения ФГ у животных были также выявлены признаки возрастания микровязкости липидного компонента эритроцитар-ной мембраны, в том числе в области белок-ли-пидных контактов, на протяжении всего периода наблюдения (до 21 сут). При этом наиболее выраженные изменения структурных свойств мем-
браны красных кровяных клеток соответствовали острому периоду метгемоглобинемии.
Наряду с этим, после токсического действия метгемоглобинобразователей было отмечено значительное увеличение значений показателя 1370/1390 при А,в = 340 нм, указывающее на возрастание полярности микроокружения зонда в интегральной липидной фазе МЭ, одной из причин которого может быть повышение содержания полярных молекул воды в условиях интенсификации липопероксидации. Исследование индуктивно-резонансного переноса энергии с трип-тофановых остатков мембранных белков на пирен, позволяющего судить о характере белково-липидных взаимодействий в мембране, показало пролонгированное статистически значимое снижение указанного параметра (табл.).
Известно, что структурная модификация липидного матрикса эритроцитарной мембраны закономерно приводит к изменениям кон-
60 50 40 g 30 20 10 0
Сроки исследования
Рис. 1. Динамика содержания метгемоглобина (MtHb) в крови у крыс после однократного введения нитрита натрия (НН) в дозе 90 мг/кг и солянокислого фенилгидразина (ФГ) в дозе 150 мг/кг
1 - контроль; 2 - после введения ФГ; 3 - после введения НН
0.35
Сроки исследования
Рис. 2. Активность Na+,K+-АТФазы в эритроцитарной мембране у крыс после однократного внутрибрюшинного введения нитрита натрия (НН) в дозе 90 мг/кг и солянокислого фенилгидразина (ФГ) в дозе 150 мг/кг
1 - контроль, 2 - после введения ФГ, 3 - после введения НН
формации встроенных в него белковых молекул [11], что, в свою очередь, влияет на их функциональную активность [10]. Как показало проведенное в нашей лаборатории исследование, в МЭ у животных после острого токсического воздействия метгемоглобинобразова-телей в течение 21 сут эксперимента имело место отчетливое угнетение активности мембран-но-ассоциированного ионтранспортирующего энзима №+,К+-АТФазы (рис. 2). При этом минимальный уровень активности №+,К+-АТФа-зы в МЭ у животных после введения НН был зафиксирован через 1,5 ч от начала эксперимента и составлял в среднем 15% от среднестатистической нормы (0,050+0,004 мкмоль Р1 /час-мг белка при контроле 0,326+0,005 мкмоль Р/час-мг белка, р < 0,001). После введения ФГ через 1 сут средний уровень активности №+,К+-АТФазы оказался равным 0,101+0,003 мкмоль Р/час-мг белка, что составило 31% от соответствующих значений у животных контрольной группы (р < 0,001). Еще более значимое угнетение активности этого ионтранспортирующего фермента было выявлено на 3-и сут наблюдения (в 6,7 раза ниже аналогичного показателя у животных контрольной группы) (рис. 2).
Важное значение в обеспечении функционирования ионтранспортирующих систем МЭ принадлежит липидному микроокружению. Регулирующая роль липидно-белковых взаимодействий для №+,К+-АТФазы сводится к обеспечению ее каталитических функций и переходов между различными конформационными состояниями посредством поддержания определенной микровязкости мембран, а также за счет взаимодействия заряженных боковых цепей этого фермента с полярными головками мембранных липидов. Снижение текучести в плазмати-
ческой мембране приводит к устранению кооперативных взаимодействий между АТФ-свя-зывающими центрами и предотвращает «сшивание» больших субъединиц фермента, что вызывает отрицательную кооперативность по субстрату и, в конечном счете, снижение активности АТФазы [10]. Кроме того, ингибирование №+,К+-АТФазы возможно путем прямого воздействия на фермент свободнорадикальных соединений, химической атаки SH-групп Na+,K+-АТФазы в условиях усиления липопероксида-ции, в результате чего происходит ее разобщение с активным транспортом ионов, а затем и инги-бирование гидролитической активности [2].
Не исключено, что столь длительное нарушение структуры МЭ может быть следствием необратимых изменений физико-химических свойств мембраны циркулирующих эритроцитов, а также результатом поступления в кровоток качественно неполноценных красных кровяных клеток, генерируемых в условиях напряженного эритропоэза в гипоксический период [6].
Заключение. Представленный фактический материал является достаточно веским доказательством молекулярных нарушений мембраны эритроцитов при токсическом действии метге-моглобинобразователей. Нарушения структурного статуса эритроцитарной мембраны у крыс, подвергшихся острому воздействию нитрита натрия (DL50) и солянокислого фенилгидразина (DL50), носят однотипный характер и проявляются возрастанием микровязкости как в области интегральной липидной фазы, так и в области анулярных липидов, а также угнетением активности №+,К+-АТФазы. При этом действие солянокислого фенилгидразина характеризуется более выраженным и продолжительным по времени мембранодестабилизирующим эффектом.
Признаки структурной модификации мембраны эритроцитов при введении нитрита натрия и солянокислого фенилгидразина (DL50) в эксперименте выражены в течение длительного времени (до 21 сут), сохраняясь в период ликвидации метгемоглобинемии.
Полученные результаты исследования, на наш взгляд, представляют интерес с точки зрения возможности разработки новых патогенетически обоснованных способов предупреждения и коррекции нарушений со стороны системы красной крови при токсических метгемо-глобинемиях. Успешное решение обозначенной проблемы позволит разработать адекватную терапевтическую стратегию коррекции развивающихся при отравлениях метгемоглобинобразо-вателями гипоксических расстройств и связанных с ними осложнений.
Список литературы
1. Артамонов Р.Г. Алиментарная метгемогло-бинемия // Медицинский научный и учебно-методический журнал, 2004. - № 18. - С. 70—73.
2. Болдырев А.А., Булыгина Е.Р., Крамаренко Г.Г. Является ли Na+,К+-АТФаза мишенью окислительного стресса? // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1996. -№ 3. - С. 275-278.
3. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980. - 320 с.
4. Головко АИ., Шилов В.В., Гребенюк АИ. и др. Токсикологические проблемы медицины катастроф. СПб.: Изд-во НИИХСПбГУ, 2000. - 110 с.
5. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеидов. М.: Наука, 1989. - 277с.
6. Зюзьков Г.Н., Абрамова Е.В., Дыгай А.М. и др. Механизмы регуляции эритропоэза при гемолитической анемии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004. -№ 10. - С. 378381.
7. Казеннов АМ., Маслова М.Н., Шалабодов АД. Исследование активности Na+,K+- АТФазы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия, 1984. - № 7. - С. 1089-1094.
8. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина. Ленинград: Медицина, 1968. - 324 с.
9. Лужников Е.А, Костомарова Л.Г. Острые отравления: руководство для врачей, 2-е изд., пе-рераб. и доп. М.: Медицина, 2000. - 434 с.
10. Мацкевич Ю.А, Казеннов, АМ. Маслова М.Н. Активность транспортных АТФаз и некоторые характеристики белково-липидного состава мембран безъядерных эритроцитов ряда млекопитающих // Эволюционная биохимия и физиология, 1994. - № 4. - С. 497-504.
11. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А Физиология и патофизиология эритроцита. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. - 202 с.
12. Новицкий В.В., Шперлинг ИА, Жаткин
0.А. и др. Изменения морфофункционального статуса эритроцитов при экспериментальных метге-моглобинемиях // Токсиколог. вестник, 2004. - №
1. -С. 7-12.
13. Штабский Б.М., Федоренко В.И. К токсикологии нитрита и нитрата натрия // Токсиколог. вестник, 1996. - № 5. - С. 22-25.
14. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghost of human erythrocytes // Archives of Biochemistry and Biophysics, 1963. - V. 100. - P. 119130.
Материал поступил в редакцию 29.09.05.
N.V.Ryazantseva1, V.V.Novitsky1, I.A.Shperling2, O.N.Filipova1, O.A.Rogov2, E.V.Saprykina1
MOLECULAR DISTURBANCES IN ERYTHROCYTE MEMBRANE AT TOXIC EFFECT PRODUCED BY
METHEMOGLOBIN FORMERS
1Siberian State Medical University, Federal Agency of Health and Social Development 2Military Medical Institute of Tomsk, RF Ministry of Defense
Molecular properties of the erythrocyte membrane in Wistar rats were investigated after a one-time intraperitoneal injection of sodium nitrite and phenil hydrazine chloride in LD50 doses. It was found out that disturbances of the structural status of the erythrocyte membrane in rats at toxic impact of methemoglobin formers are characterized by increasing microviscosity both in the integral lipid phase and anular lipids, as well as by activity inhibition of Na+, K+-AT Phase. Destabilizing action of phenil hydrazine chloride is characterized by more expressed and longer membrane-destabilizing effect. At administration of sodium nitrite and phenil hydrazine chloride in LD50 doses in experiment, signs of erythrocyte membrane structural modification are present for a long time (up to 21 days), even remaining during elimination of methemoglobinemia.
