CC BY
16УДК 634.11:631.524.86
О.Ю. Урбанович1, А.А. Хацкевич1, З.А. Козловская2, Н.А. Картель1
молекулярные методы паспортизации сортов груши
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072 г. Минск, Академическая, 27. 2РУП «Институт плодоводства» Республика Беларусь, 223013, Минская обл., Минский р-н, пос. Самохваловичи, ул. Ковалева, 2.
Введение
Груша является важной плодовой культурой в Беларуси. Она выращивается на территории страны на протяжении многих веков. В последние десятилетия наблюдается значительное увеличение сортового разнообразия этой культуры. По мере создания новых сортов груши возникает необходимость разработки более удобных и надежных методов их идентификации. Используемые в настоящее время морфологические признаки не всегда отвечают возрастающим требованиям селекционеров. Кроме того, они могут быть не достаточно стабильны под влиянием окружающей среды и проявляются чаще всего на поздних стадиях онтогенеза.
В настоящее время появилась возможность паспортизации генетических ресурсов плодовых культур и их сортовой идентификации на основе молекулярных маркеров. Молекулярные маркеры отличаются большим разнообразием и могут фланкировать различные по функциональной нагрузке участки генома. Молекулярные маркеры позволяют обнаружить различия между сортами на уровне ДНК, не требуя фенотипического проявления признака. Они могут быть применены на разных стадиях развития и роста растений, начиная с первого года жизни. Немаловажно, что идентификацию генотипов с помощью молекулярных маркеров можно осуществлять на любых тканях растения. В настоящее время наиболее эффективным молекулярным методом идентификации генома растений является метод SSR-анализа. Он основан на определении длины фрагментов локусов микросателлитных последовательностей с помощью фланкирующих их маркеров, выявляемых в результате полимеразной цепной реакции. SSR-локусы генома растений являются высокополиморф-
ными. Они деспергированы по всему геному и наследуются как кодоминантные признаки. Эти свойства позволяют успешно применять их для идентификации и паспортизации сортов сельскохозяйственных растений [1].
При разработке молекулярных методов идентификации сортов груши необходимо учитывать особенности строения и организации генома этого вида. Род груша (Pyrus), также как и яблоня (Malus), входит в семейство Rosaceae, подсемейство Maloideae. Для представителей этих родов характерно базовое число хромосом 17 (2n=34). Предполагалось, что груши, как и яблони, являются амфидиплоидами, которые произошли от двух предковых видов Rosaceae [2]. Исследования, проведенные с помощью анализа ДНК, показали, что полиплоидным происхождением представители родов Pyrus и Malus обязаны предковой форме с 9 хромосомами [3]. Геном этих видов сформировался в результате анеуплоидии от общего предкового вида. Вполне закономерно, что геномы яблони и груши имеют много общего как в организации, так и в структуре.
В первых исследованиях для идентификации генотипов груши были использованы изо-зимные маркеры [4, 5]. Вслед за ними RFLP, RAPD, ISSR, AFLP маркеры были привлечены для того, чтобы охарактеризовать различные генотипы и установить родственные связи среди видов и сортов груши [6, 7, 8, 9, 10, 11]. SSR-маркеры к геному груши специально не разрабатывались. В экспериментальных работах было показано, что часть SSR-маркеров к геному яблони можно с высокой эффективностью использовать для идентификации сортов груши, чему способствует общее происхождение этих видов [12]. В частности, характе-
ристика генотипов европейских и азиатских груш успешно была осуществлена с помощью микросателлитных маркеров яблони, сливы и японской груши [13].
В представленном исследовании для иден-
тификации сортов груши были применены SSR-маркеры генома яблони. Исследование проводилось с целью разработки универсального для обоих видов молекулярного метода паспортизации сортов.
Материалы и методы
Объекты исследования: Исследования проводились на коллекции сортов груши. Сорта взяты из сада РУП "Институт плодоводства". В общей сложности в работе было использовано 34 сорта груши, среди них и сорта белорусской селекции. В коллекции были представлены 15 сортов, включенных в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород Республики Беларусь.
Выделение ДНК: Препараты ДНК выделяли с помощью Genomic DNA Purification Kit фирмы Fermentas. Выделение проводили из листового материала яблони согласно рекомендованному протоколу. Пробы растворяли в 100 мкл бидистилированной воды и хранили при -20 °С. Для проведения ПЦР образцы разводили до концентрации 20 мкг/мкл.
Условия амплификации: Реакцию амплификации проводили с помощью SSR-маркеров CH01c06, CH02b12, CH02c02b, CH03d12, CH04h02, SdSSR [14, 15]. Реакционная смесь для проведения ПЦР объемом 20 мкл имела следующий состав: 67 мМ Трис-HCl рН 8,8, 16 мМ (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 250 нМ прямого и обратного праймеров, 50 мкг ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы. Условия проведения реакции: 94 °С - 3 мин; 40 циклов 94 °С - 40 сек, 600С - 1 мин, 72 °С - 1 мин; 1 цикл: 72 °С - 10 мин. Для проведения реакции использовали амплификатор MyCicler (BIO-RAD).
Идентификация фрагментов амплификации: Продукты амплификации разделяли ме-
тодом электрофореза в секвенирующем акри-ламидном геле. Для проведения электрофореза использовали ДНК-секвенатор ALFexpress II (Amersham Biosciences). Разделение продуктов амплификации осуществляли в 6% акрила-мидном геле толщиной 0,3 мм. Электрофорез проводили в 1 х ТВЕ-буфере (0.089 М Трис, 0.089 М борная кислота, 0.002 М EDTA рН 8.о) при следующих условиях: 400-600 B, 40 мА, 50 Вт, 55°С, интервал детекции 0,5 сек, время проведения 1-2 часа. Результаты электрофо-ретического разделения документировались автоматически с помощью программного обеспечения секвенатора.
Анализ уровня полиморфизма: Для оценки уровня полиморфизма использовали значение коэффициента полиморфизма. Коэффициент полиморфизма - PIC (polymorphic information content) был рассчитан отдельно для каждого локуса микросателлитных последовательностей генома груши. Значение коэффициента вычисляли по формуле:
PIC= 1 - E(Pi)2
где P. - частота встречаемости i-ого аллеля [16]. i
Уровень гетерозиготности Ho был рассчитан как отношение гетерозиготных генотипов к общему количеству генотипов.
Дендрограмма генетического сходства сортов была получена с помощь программы Treecon, основываясь на коэффициенте генетического сходства Nei и Li [17].
Результаты и обсуждение
Для проведения исследования была сформирована коллекция сортов груши. Коллекция представлена 34 образцами, среди которых 15 сортов груши, включенных в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород Республики Беларусь.
Выбранные для анализа маркеры ограничивают локусы микросателлитных повторяющихся последовательностей. Для разделения продук-
тов амплификации с указанными маркерами необходимо применять метод электрофореза в высокоточном акриламидном геле. В представленном исследовании фрагменты амплификации разделяли с помощью автоматического секвенатора. Экспериментальные исследования показывают, что точный размер аллелей локу-сов микросателлитных последовательностей методом электрофореза определить сложно
[14, 18]. Расчетные значения длин фрагментов могут колебаться в пределах 1-4 нуклеотида. Точность расчета зависит от используемого для исследования оборудования и реагентов (системы мечения праймеров, обычного аппарата для электрофореза, автоматического сек-венатора и др.) [19]. В связи с этим возникает необходимость выбора стандарта, относительно которого будут проведены расчеты длины фрагментов амплификации. В представленном исследовании для расчета длины аллелей SSR локусов генома груши был использован сорт яблони Discovery. Сорт Discovery выбран как стандарт, рекомендованный для расчета длин аллелей при SSR-анализе сортов и видов яблони, так как он был включен во многие генетические исследования и являлся одним из родителей при создании картирующих популяций [14, 18]. Этот сорт служил также стандартом при разработке молекулярных методов идентификации сортов яблони [20].
Так как геном груши и яблони близок в генетическом отношении, для идентификации генотипов груши были использованы SSR-маркеры к геному яблони. При проведении исследования использована комбинация прай-меров, разработанная для ДНК-паспортизации сортов яблони [20]. Результаты амплификации показали, что все взятые для анализа SSR-маркеры, созданные на основе генома яблони, имеют сайты связывания в геноме груши. В геноме груши выбранные локусы отличают-
ся высоким уровнем полиморфизма. Пример идентификации сортов груши с помощью SSR-маркера СН02С02Ь представлен на рисунке 1. Как видно из рисунка, каждому сорту соответствует свой набор аллелей SSR-локусов.
С помощью шести SSR-маркеров в геноме сортов груши, подвергнутых тестированию, выявлено от 7 до 17 полиморфных аллеля на локус (Табл. 1). Среднее значение аллелей на локус составляет 11,2. Пять маркеров являются монолокусными и выявляют не более двух аллелей на локус. Маркер СН02Ь12 выявляет до 4 аллелей и, следовательно, имеет более одного сайта связывания в геноме груши. Количество полиморфных аллелей в геноме груши несколько ниже, чем у яблони. Среднее количество аллелей этих же локусов в геноме яблони составляет 17,2. Следует отметить, что результаты приведены для 34 генотипов груши и 108 генотипов яблони. Выявление большего количества аллелей среди генотипов яблони связано с большей исследованной выборкой, а также с тем, что в анализе были использованы виды яблони, в составе генома которых были представлены дополнительные аллели [20]. Однако не исключено, что сорта груши характеризуются меньшим генетическим разнообразием по сравнению с яблоней. Так, Вунш и Хормаза отметили более низкое генетическое разнообразие среди 63 европейских сортов груши, исследованных с помощью семи микросателлитных маркеров, по сравнению с яблоней [21].
Рис. 1. Результаты разделения методом электрофореза в полиакриламидном геле продуктов амплификации ДНК сортов груши с праймером СН02С02Ь. Цифры 70, 195, 226 обозначают длину стандарта молекулярного веса в п.н. Номера над пиками - длины фрагментов в п.н., номера справа - порядковые номера образцов согласно таблице 4.
О.Ю. Урбанович и др. Молекулярные методы паспортизации сортов груши | 163
Таблица 1
Аллели, идентифицированные в геноме 34 сортов груши с помощью SSR-анализа
Название праймера Детектируемые SSR аллели в геноме груши. Длина в н.п.
1 CH01c06 150, 152, 154, 156, 158, 160, 164
2 CH02b12 101, 103, 112, 114, 116, 120, 124, 132, 134, 136, 138, 140, 144, 148, 152, 154, 160
3 CH02c02b 109, 111, 117, 119, 121, 125, 129, 133
4 CH03d12 89, 93, 95, 101, 111, 113, 115, 117, 123, 127
5 CH04h02 162, 164, 166, 168, 176, 182, 184, 186, 188, 190, 194, 202
6 SdSSR 140, 154, 158, 162, 164, 168, 170, 172, 174, 176, 1809, 186, 206
Размер аллелей локусов микросателлитных последовательностей в геноме груши незначительно отличается от размеров аллелей этих локусов в геноме яблони (Табл. 2). Наблюдаемые различия могут быть вызваны делеция-ми или инсерциями отдельных нуклеотидов, которые возможны как в области микросателлитных последовательностей, так и во фланкирующих их областях.
Наблюдаемый уровень гетерозиготности (Но) сортов груши имеет минимальное значение в локусе СН01с06, равное 0,41 (Табл. 3). Наибольшее значение уровня гетерозигот-ности отмечено для локуса SdSSR - 0,74. В среднем для рассмотренных генотипов Но равно 0,54. Среди 108 образцов яблони уровень гетерозиготности в тех же локусах в среднем составляет 0,56.
Таблица 2
Название праймеров, длина и количество аллелей SSR-локусов в геноме сортов яблони и груши.
№ Название праймера Хромосома Длина аллелей в геноме яблони в н.п. Кол-во детектируемых аллелей в геноме яблони Длина аллелей в геноме груши в н.п. Кол-во детектируемых аллелей в геноме груши
1 CH01c06 8 150-186 13 150-164 7
2 CH02b12 5 114-148 11 101-160 17
3 CH02c02b 4 76-125 8 109-133 8
4 CH03d12 6 97-151 14 89-127 10
5 CH04h02 11 150-274 40 162-202 12
6 SdSSR 7 159-211 17 140-206 13
Коэффициент полиморфизма и уровень гетерозиготности (Н) сортов груши, рассчитанный на основе SSR-анализа
№ Название праймера PIC сортов яблони Ho сортов яблони PIC сортов груши H o сортов груши
1 CH01c06 0,80 0,47 0,73 0,41
2 CH02b12 0,83 0,73 0,80 0,53
3 CH02c02b 0,75 0,60 0,83 0,59
4 CH03d12 0,80 0,55 0,80 0,47
5 CH04h02 0,94 0,71 0,69 0,50
6 SdSSR 0,89 0,45 0,88 0,74
Среднее 0,84 0,56 0,79 0,54
Таблица 3
Самый высокий коэффициент полиморфизма и, следовательно, уровень информативности маркера наблюдается в локусе SdSSR. Наименьшее значение коэффициента полиморфизма имеет локус CH04h02 - 0,69. В целом рассмотренные локусы имеют высокий PIC, что свидетельствует как о хорошей информативности маркеров, так и о высоком уровне полиморфизма локусов микросател-литных последовательностей в геноме исследованных сортов груши. При сравнении коэффициента полиморфизма яблони и груши видно, что оба вида характеризуются высоким генетическим разнообразием аллелей локусов
микросателлитных последовательностей. Для рассмотренных локусов у груши среднее значение PIC равно 0,79, у яблони - 0,84. Таким образом, наблюдаемое разнообразие аллелей и уровень полиморфизма позволяет использовать данные маркеры для идентификации генотипов груши. По данным SSR-анализа для каждого сорта бал составлен генетический паспорт, в котором сорта представлены в виде набора аллелей в шести SSR-локусах (Табл. 4). Как видно из таблицы, среди протестированных сортов нет одинаковых по составу аллелей, выявляемых предложенной комбинацией SSR-маркеров.
Таблица 4
Молекулярно-генетические паспорта сортов груши, созданные на основе SSR-анализа.
Длина аллелей обозначена в п.н.
№ Название сорта CH03d12 SdSSR CH04h02 CH02b12 CH02c02b CH01c06
1 Августовская роса 127 168,170 184,190 101,114,134,152 117,129 152,158
2 Белорусская поздняя 101,113 168,170 184,190 101,114,134,152 117,129 152,158
3 Бере лошицкая 113,127 154,172 184 101,114,124,134 119,125 152,158
4 Бере Люка 111,115 164 184 101,114,124, 134 125,129 150
5 Большая летняя 111,115 162,164 184 101,138,144 119,125 150
6 Велеса 115,127 158,164 162,202 101,114,134 133 152,158
7 Верная 115,127 158,164 176,184 114,134 133 150,158
8 Видная 89,111 154,174 184 101,138,152 119 150
9 Вродлыва 89,117 164,184 164 120,138 119,125 152,160
10 Десертная россошанская 127 170 164,184 101,114,134, 152 125,133 152
11 Духмяная 111 164 184 103,138,160 117,133 152
12 Дюшес летний 115 170,184 184,194 101,114,136, 152 129,133 152,158
13 Золотоворотская 101,123 174 184 101,140 109,117 152
14 Колхозница 111,127 154,174 184 101,112,124, 134 119,125 152
15 Конференция 111,127 154,174 184 112,124,134 133 152
16 Кудесница 115 154,176 182,202 101,124,138, 144 125,133 152,158
17 Лагодная 115 154,176 184 101,124,144 117,133 158
18 Лира 127 164 164,184 103,138,160 119,125 150
19 Мраморная 127 164 164,184 103,114,134, 160 129,133 150
20 Муратовская 127 164 164,176 154 117 150
21 Нарядная Ефимова 111 154,172 184,202 116,136,148 117 150
22 Памяти Яковлева 95,127 154,179 184 101,103,160 133 150,160
23 Пин-го-ли 89,93 140,154 166,186 116,136 111 154
24 Просто Мария 111 140,154 168,184 101 111,117 150
25 Светлянка 89,111 140,154 184 124,138 119 150,160
26 Сильва 127 154,206 184 101,103,154, 160 119,133 150
27 Сладкая из Млиева 115 154,168 184 101,103,138, 160 133 150
28 Сокровище 127 154 184 101,114,134, 154 133 150
29 Талгарская красавица 127 176 176,184 138 111,133 150,156
30 Хони Дью 111 168,184 184,188 116 111,117 150
31 Чижовская 89,127 140,164 202 103,114,134,160 119,121 152,160
32 Юрате 113,127 162,170 162,184 101,103 129,133 152,158
33 Ясачка 111 168,172 182,190 114,124,134 117,133 150,158
34 Гибрид (Маргарита Марилья х P. communis) x P. yematsuana 115 162,184 184 116,132 117,119 152
Это наглядно видно на дендрограмме генетического сходства, построенной на основе проведенного анализа (Рис. 2). Все 34 сорта груши находятся на разном генетическом расстоянии друг от друга. Генетическое расстояние между сортами колеблется в пределах от 0,9 до 0,1, и сравнимо с таковым у яблони. В целом, сорта груши отличаются значительным
генетическим разнообразием, характерным для перекрестноопыляемых видов.
Таким образом, требованиям метода ДНК-паспортизации в достаточной степени соответствует предложенная комбинация из шести SSR-маркеров. С ее помощью можно идентифицировать на молекулярном уровне сорта как груши, так и яблони.
0.9 о.8-¡Л7-о:?-оз-оз-03-И-И-
Бере Люка Большая летняя Видная Светлянка Бере лошицкая Колхозница Конференция Кудесница Лагодная
Талгарская красавица Лира
Мраморная Духмяная Сокровище Сладкая из М^иева Пам яти Яковлева Сильва Велеса Верная Юрате
Дюшес летний Десертная россошанская Августовская роса Белорусская поздняя Ясачка
Нарядная Ефимова Просто Мария Хони Дью Золотоворотская Гибрид Муратовская Вродлива Чижовская Пин Го Ли
Ц
Рис. 2. Дендрограмма генетического сходства сортов груши, построенная на основе результатов анализа шести 88Я-локусов. При необходимости предложенную комбинацию маркеров можно расширить, что позволит идентифицировать практически неограниченное количество сортов.
Заключение
В представленном исследовании разработана система идентификации и ДНК-паспортизации генотипов сортов груши. Метод основан на использовании SSR-маркеров, выявляемых в результате полимеразной цепной реакции. Метод позволяет проводить анализ любых органов растений на различных стадиях онтогенеза. Для груши подобран набор из шести высокополиморфных SSR-маркеров CH01c06, CH02b12, CH02c02b, CH03d12, CH04h02, SdSSR, удобных в использовании, охватывающих различные области генома, достаточный для идентификации сортов. Представлена система регистрации
генотипов груши в виде паспорта сорта, который отображает аллельный состав локусов микросателлитных последовательностей. Предложенный метод ДНК-паспортизации обеспечивает возможность проверки соответствия сортов критериям отличимости, однородности и стабильности ООС-теста. Метод относится к новым технологиям и может быть использован для создания компьютерной базы данных ДНК-паспортов сортов, охраняемых в Республике Беларусь, в селекционной практике, для подтверждения соответствия сорта стандарту, для охраны авторских прав.
Список использованных источников
1. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров / С.В. Малышев [и др.] // Методические рекомендации. Минск. -2006. - 28 с.
2. Advances in fruit breeding. / R.E.C. Layne [et al.] // In: Janick J., Moore J.N. (Eds). Purdue University Press, West Lafayette. - Indiana. - 1975.
3. The origin of the apple subfamily (Maloide-ae: Rosaceae) is clarified by DNA sequence data from duplicated GBSSI genes / R.C. Evans [et al.] // Am. J. Bot. - 2002. - Vol. 89. -P. 1478-1484.
4. Identification of Callery pear cultivars by peroxidase isozime patterns / F.S. Santamour [et al.] // Hered. - 1980. - Vol. 71. - P. 447-449.
5. Characterization of Pyrus species and cultivars using gradient polyacrylamide gel electrophoresis / R.A. Menendez [et al.] // J. Environ. Hortic. - 1986. - Vol. 4. - P. 56-60.
6. Incongruence between RFLP's of chlo-roplast DNA and morphological classification in East Asian pear (Pyrus spp.) / H. Iketani [et al.] // Genet. Resour. Crop Evol. - 1998. - V. 45. -P. 533-539.
7. Comparative analysis of chloroplast DNA in Pyrus species: physical map and gene localization / H. Katayama [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2003. - Vol. 106. - P. 303-310.
8. Assessment of genetic relationships among Pyrus species and cultivars using AFLP and RAPD markers / L. Monte-Corvo [et al.] // Genet. Resour. Crop Evol. - 2000. - Vol. 47. -P. 57-265.
9. ISSR analysis of cultivars of pear and suitability of molecular markers for clone discrimination / L. Monte-Corvo [et al.] // J. Am. Soc. Hortic. Sci. - 2001. - Vol. 126. - P. 517-522.
10. Molecular typing of Pyrus based on RAPD markers / C. Oliveira [et al.] // Sci. Hort. - 1999. -Vol. 79. - P. 163-174.
11. Genetic relationships of Pyrus species and cultivars native to East Asia revealed by ran-
domly amplified polymorphic DNA markers / Y. Teng [et al/] // J. Am. Soc. Hortic. Sci. - 2002. -Vol. 127. - P. 2б2-270.
12. Characterisation and transferability of apple SSRs to two European pear F population / L. Pierantoni [et al] // Theor. Appl. Genet. - 2004. -Vol. 109. - P. 1519-1524.
13. European and Asian pear: simple sequence repeat-polyacrilamide gel electrophoresis-based analysis of commercial important North American cultivars / A.K. Ghosh [et al.] // Hort. Science. -200б. - Vol. 41. - P. 304-309.
14. Development and characterization of 140 new microsatellites in apple (Malus x domestica Borkh.) / R. Liebhard [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2002. - Vol. 10. - P.217-241.
15. Cevik, V. High-resolution genetic analysis of the Sd-1 aphid resistance locus in Malus spp / V Cevik, G.J. King // Theor. Appl. Genet. - 2002. -Vol.105. - P. 34б-354.
16. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Botstein [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 1980. - Vol. 32. - P. 314-331.
17. Nei, M., Li W.H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases /. M. Nei,W.H. Li // Proc Natl Acad Sci USA. - 1979. - Vol. 7б. - P. 52б9-5273.
18. Microsatellite markers spanning the apple (Malus x domestica Borkh.) genome / E. Silfver-berg-Dilworth [et al.] // Tree Genetics & Genomes. - 200б. - Vol. 2. - P. 202-224.
19. Development of a standard set of microsatellite reference alleles for identification of grape cultivars / P. This [et al.] // Theor. Appl. Genet. -2004. - Vol. 109. - P. 1448-1458.
20. Паспортизация сортов яблони на основе SSR-маркеров / О.Ю. Урбанович [и др.] // Доклады НАН Беларуси. 2008. - Т. 52. - № 5. -С. 93-99.
21. Characterization of variability and genetic similarity of European pear using microsatellite loci developed in apple / A. Wunsch [et al.] // Scientia Horticulturae. - 2007. -Vol. 113. - P. 37-43.
Дата поступления статьи 10 апреля 2009 г.
