CC BY
4УДК 635.64: 631.523: 575.116.4
В.Ф. Аджиева1, Н.А. Некрашевич2, С.В. Малышев2, О.Г. Бабак2, А.В. Кильчевский2
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОТИПОВ ТОМАТА (SOLANUM LYCOPERSICUM L.) БЕЛОРУССКОЙ И ЗАРУБЕЖНОЙ СЕЛЕКЦИИ
1УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия» Республика Беларусь, 213410, Могилевская обл., г. Горки, ул. Мичурина, 5 2ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Повторы простых последовательностей (Simple Sequence Repeats - SSR) широко распространены в геноме эукариот. Это одна из самых быстро изменяющихся областей генома. Подвергаясь мутациям, эти последовательности мутируют в 1000 раз чаще, чем структурные гены и показывают высокие уровни полиморфизма из-за изменения их длины [1]. Микросателлитные маркеры отличаются генетической стабильностью, высокой воспроизводимостью и кодоминантны, поэтому их часто применяют для паспортизации сортов растений. Как отмечено Veillieux и др. (1995), SSR-анализ - самый простой способ выполнить идентификацию генотипа [2].
Имеются таксономические предпочтения в распространении разных повторов. Так, в геноме растений последовательность (АТ)п отмечена как самый часто повторяющийся дину-клеотид, в геноме млекопитающих это (CA)n повтор [1, 2, 3]. У человека предположительно 50 000 микросателлитных локусов на геном - 1 на 30 тысяч пар оснований, у арабидопсиса -
1 на 430 тысяч пар оснований (в 14 раз реже) [1]. Для культурных сортов томата существует зависимость между длиной повторов и степенью их полиморфизма, которая возрастает с увеличением длины повторов [2].
Для целей идентификации и паспортизации растений необходимо выбирать маркеры, отвечающие ряду требований. В первую очередь они должны быть высокополиморфны, стабильно наследоваться в поколениях, охватывать разные области генома. Этим требованиям отвечают маркеры к микросателлитным последовательностям, или SSR-маркеры. Однако такие маркеры значительно отличаются по информативному содержанию. По данным Грушецкой и др. [4], в их исследовании значение индекса полиморфного информационного содержания колебалось от 0 для маркера SSR48 до 0,753 для ТМБ22. Поэтому целью нашего исследования являлся сравнительный анализ полиморфизма используемых нами семи SSR-маркеров для идентификации генотипов томата белорусской и зарубежной селекции.
Материалы и методы
Исходным материалом для исследования служили 13 генотипов томата (Solanum lycopersicum L.) белорусской, российской и нидерландской селекции (табл. 3).
Применяемый нами метод SSR-анализа основан на использовании ПЦР с фланкирующими праймерами к короткому микросател-литному повтору. В результате ПЦР образуются продукты амплификации, отличающиеся
по длине на один или несколько нуклеотидов, что свидетельствует о наличии или отсутствии полиморфизма по данному локусу.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из листьев индивидуальных растений согласно методике, описанной Р^сЬке и др. [5] с модификациями. Растительную ткань массой 70 мг измельчали в ступке с жидким азотом до порошкообразного состояния. Полученную массу перено-
сили в 2 мл пробирки и ресуспендировали в 500 мкл буфера для выделения (100 мМ Т рис-НС1 рН 8.5, 100 мМ ШС1, 50 мМ ЭДТА рН 8.0 и 2% БОБ) и инкубировали на водяной бане 45 мин при 65°С. Депротеинизацию проводили хлороформом в отношении 1:1. Раствор ДНК отделяли при помощи центрифугирования при 3500 об/мин в течение 10 минут. Супер-натант переносили в новые пробирки, после чего ДНК осаждали добавлением 800 мкл 96% ледяного этанола, промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл воды.
ПЦР анализ. Анализ генотипов проводился с использованием ББЯ-маркеров описанным ранее методом [6]. Применяемый нами набор
Идентификация фрагментов амплификации. Образцы разделялись в полиакрила-мидном геле (7M мочевина, 6% акриламид / бис-акриламид (19 : 1), 1x TBE (0,09 M Трис-борат pH 8,3, 2 мМ EDTA), 2% фотоинициатор (100 мМ 1-гидрокси-циклгексил-фенил-кетон в этиленгликоле) на автоматическом лазерном флуоресцентном секвенаторе ALFexpress II (GE Healthcare, UK). Электрофорез проводили в 1x TBE буфере. 1 мкл продуктов каждой ПЦР реакции смешивали с 4 мкл буфера для нанесения (5 мг/мл голубой декстран в деионизованном формамиде), денатурировали 2 мин при 95°С и вносили в гель. Один из пары праймеров был маркирован флуоресцентной меткой для анализа на ALFexpress II секвенаторе. Каждая дорожка помимо образца содержала в качестве стандарта фрагменты ДНК известного размера, которые добавляли к
микросателлитных маркеров подобран для томата в работах Smulders et al.[2], Areshchen-kova and Ganal, 1999[7], Areshchenkova and Ganal 2002 [3], Грушецкая [и др.] [4].
Реакционная смесь для ПЦР, объемом 12,5 мкл, включала 50 нг ДНК, 250 нМ каждого праймера (Праймтех, Беларусь), 200 нМ dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 10 x PCR буфер «А» (Праймтех, Беларусь), 1 ед. Taq полимеразы (Праймтех, Беларусь). Реакцию проводили в амплификаторе iCycler Thermal Cycler (BioRad Laboratories, Inc., США) по программе: 5 мин 94°С, 35 циклов: 1 мин 94°С, 2 мин Т отжига °С (таблица 1), 1 мин 72°С и затем 7 мин 72°С.
буферу для нанесения. Размер фрагментов вычисляли путем сравнения с данными стандартами при использовании программы Fragment Analyser 1.02 (GE Healthcare, UK).
Анализ уровня полиморфизма SSR-маркеров. Для оценки уровня полиморфизма использовали PIC*(polymorphic information content) - индекс полиморфного информационного содержания изучаемых SSR-маркеров. Коэффициент полиморфизма был рассчитан отдельно для каждого локуса микросателлитных последовательностей томата (табл. 2). Значение коэффициента вычисляли по формуле:
PIC= 1 - I(P1)2
где P. - частота встречаемости i-ого аллеля
[8].
Таблица 1
Микросателлитные праймеры для идентификации полиморфизма культурных
сортов томата
SSR-маркер Прямой праймер Обратный праймер Т отжига, °С
TMS 22 TGTTGGTTGGAGAAACTCCC AGGCATTTAAACCAATAGTAGC 55
LEMDDNa ATTCAAGGAACTTTTAGCTCC TGCATTAAGGTTCATAAATGA 54
TMS 9 TTGGTAATTTATGTTCGGGA TTGAGCCAATTGATTATAAGTT 55
Ssr 63 CCACAAACAATTCCATCTCA GCTTCCGCCATACTGATACG 55
Leef 1Aa AAATAATTAGCTTGCCAATTG CTGAAAGCAGCAACAGTATTT 55
Tms 37 ACAAACTCAAGATAAGTAAGAGC GTGAATTGTGTTTTAACATGG 55
Est 253712 GAAATGAAGCTCTGACATCAA TCATTGCTTGCATATGTTCATG 55
Результаты и обсуждение
Нами были протестированы 13 генотипов томата белоруской и зарубежной селекции с применением 7 различных ЗБЯ-маркеров, обладающих высоким уровнем полиморфизма и расположенных на разных хромосомах томата (табл. 2).
Все использованные нами ЗБЯ-маркеры выявили полиморфизм в группе изучаемых сортов (табл. 3). В целом, для образцов коллекции об-
наружено 26 аллелей для семи ББЯ-маркеров. В результате анализа микросателлитных локусов было выявлено от 2 ББК-аллелей для ТМБ22 до 6 для ЬееП Аа (табл. 3). В среднем наблюдалось по 3,71 аллеля на маркер. По данным исследований авторов [4], при анализе 27 генотипов томата белорусской, российской и польской селекции с 15 ББК-маркерами, среднее количество аллелей на маркер составляло 2,7.
Таблица 2
Характеристика панели микросателлитных маркеров для анализа генотипов томата
Локус Повторы Хромосома PIC* Впервые описан
TMS 22 (GT)9(AT)8(AC)13(GA)12 4 0.13 Areshchenkova и Ganal, 1999
LEMDDNa (TA)9 5 0.65 Smulders et al., 1997
TMS 9 (GATA)26 12 0.46 Areshchenkova и Ganal, 1999
Ssr 63 (AT)„ 8 0.62 Frary et al., 2005
Leef 1Аа (TAyATA)9 - 0.82 Smulders et al., 1997
Tms 37 (GA)21(TA)20 5 0.53 Areshchenkova и Ganal, 1999
Est 253712 (AT)14 6 0.57 Areshchenkova и Ganal, 2002
PIC* - индекс полиморфного информационного сод - - отсутствие данных
В нашем исследовании значение индекса информативности (PIC) варьировало от 0.133 для маркера TMS 22 до 0.82 для маркера Leef 1Аа (табл. 2). Среднее значение PIC составило 0.54. В работе [4], данный
жания изучаемых 88Я-маркеров;
индекс был на уровне 0.37, что позволяет характеризовать выбранную нами группу ББЯ-маркеров, как высокополиморфную и использовать в дальнейшем для целей ДНК-паспортизации.
Таблица 3
Результаты анализа 13 генотипов томата с применением SSR-маркеров
Наименование Размер продуктов амплификации в п.н. в результате применения SSR-маркеров
образца
TMS 22 LEMDDNa TMS 9 Ssr 63 Leef ^a Tms 37 Est 253712
F, Диво 159 229 349, 352 208 203 195 132, 147
F, Арлекин 159 213 349, 352 208 203 191 147, 149
F1 Васильевна 159 213, 229 345, 349 208 203 191 132
F1 Маркиза 159 213 352 208 203, 211 191 147, 149
Fj Бобкет 159 215, 229 352 208, 249 217 195 147
Fl GS - 12 159+163 229 352 208 209 160, 222 147, 149
Fj Адапт 159 213, 215 345, 352 208 213 195 147
Продолжение таблицы
Гарант 159 229 352 249 213 195 147
Fj Омега 159 215, 229 352 206 211 195 147
Fj Шторм 159 215 352 208, 249 207, 217 195 145, 147
Пожар 159 215 352 216 209 195 147
Девиз 159 215 352 206 213 195 145
Ранний-310 159 215 352 249 213 195 147
Внутри группы используемых нами прайме-ров наблюдалось значительное варьирование выявляемого полиморфизма. Так, маркер с наибольшим значением PIC - Leef 1 Аа (0.82) превзошел по данному показателю маркер TMS22 (0,133) в шесть раз. Однако, в работе [4] маркер TMS22 в результате анализа микросателлитных локусов оказался наиболее информативным среди 15 изучаемых маркеров. Это говорит о необходимости индивидуального подбора SSR-маркеров для каждой группы генотипов томата.
Как описано Smulders et al. (2007) [2] и S. Garcia-Martinez et al. (2006) [9], и в наших исследованиях маркер Leef 1Aa отмечен, как один из наиболее полиморфных SSR-маркеров, для которого число обнаруженных аллелей было максимальным и равнялось 6, а значение индекса информационного содержания достигало 0.82. Размер фрагментов амплификации колебался от 203 до 217 п.н.
Маркеры LEMDDNa, Ssr 63, Est 253712 и Tms 37 также выявили высокий уровень полиморфизма образцов коллекции генотипов томата. Значение PIC для них равнялось 0.65,
0.62, 0.57 и 0.53 соответственно, а количество обнаруженных аллелей - 3, 4, 4 и 4 (табл. 3).
Наименьшая полиморфная ценность в изучаемой коллекции генотипов томата была выявлена с применением маркеров ТМБ9 и ТМБ22. Для них число обнаруженных аллелей равнялось 3 и 2, соответственно, а значение индекса информационного содержания уменьшилось до 0.46 и 0.133.
Необходимо отметить, что практически для всех форм, кроме сортов Гарант, Пожар, Девиз и Ранний-310, количество аллелей у одного образца равнялось двум, что характерно для диплоидных видов и характеризует данную форму, как гетерозиготную по данному локусу.
Уровень выявляемого полиморфизма SSR-маркеров в разы выше у диких разновидностей томата в сравнении с культурными сортами [2]. Данный признак находится в прямой зависимости от генетического разнообразия образцов коллекции. Полученный нами высокий индекс информативности на уровне 0,54 характеризует данную коллекцию генотипов томата, как генетически полиморфную, а используемые SSR-маркеры, как высокоинформативные.
Заключение
Нами был проведен сравнительный анализ полиморфизма культурных сортов томата белорусской и зарубежной селекции с помощью 7 микросателлитных маркеров. Выделена группа SSR-маркеров, обладающих наивысшим индексом полиморфного информационного со-
держания, таких как Leef 1 Aa, LEMDDNa, Ssr 63, Est 253712 и Tms 37. Для данных маркеров индекс PIC находится на уровне 0.82-0.53, что позволяет эффективно использовать их наряду с другими маркерами для идентификации сортов томата по микросателлитным локусам.
Список использованной литературы
1. Карлов, Г. И. Молекулярно-генетические Г. И. Карлов; Рос. госуд. аграрн. унив. МСХА
и молекулярно-цитогенетические подходы для им. К.А.Тимирязева.- М., 2009. - 50 с. ускоренного создания селекционного материа- 2. Use of short microsatellites from database
ла растений с заданными свойствами: автореф. sequences to generate polymorphisms among Ly-
дис. ...докт. биол. наук: 03.00.23; 03.00.15 / copersicon esculentum cultivars and accessions
of other Lycopersicon species / M.J.M. Smulders [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 1997. - V. 94. -P. 264-272.
3. Areshchenkova, Т. Comparative analysis of polymorphism and chromosomal location of tomato microsatellite markers isolated from different sources / T. Areshchenkova, M.W. Ganal // Theor. Appl. Genet. - 2002. - V. 104. -Т. 14. - P. 229-235.
4. Идентификация сортов и линий томата с помощью SSR-маркеров / З. Е. Грушецкая [и др.] // Овощеводство. - 2008. - с. 151-157.
5. Plaschke, J. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers / J. Plaschke, M.W. Ganal, M.S. Röder // Theor. Appl. Genet. - 1995. -Vol. 91. - P. 1001-1007.
6. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пше-
ницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров: метод. Рекомендации / С.В. Малышев [и др]; под ред. С.В. Малышева. - Минск: УП Камет, 2006. - 27 с.
7. Areshchenkova, Т. Long tomato microsatellites are predominantly associated with centromeric regions / T. Areshchenkova, M.W. Ganal // Theor. Appl. Genet. - 1999. - V. 42. -P. 536-544.
8. Молекулярные методы паспортизации сортов груши / О.Ю. Урбанович [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика. - 2008. -Том 8. - с. 160-167.
9. Garcia-Martinez, S. Evolution of amplified fragment length polymorphism and simple sequence repeats for tomato germplasm fingerprinting utility for grouping closely related traditional cultivars / S. Garcia-Martinez et al. // Genome.- 2006. -Vol. 49. - P. 648-656.
Дата поступления статьи 15 сентября 2010 г.
