28показателями более контрастных сезонов. Группа сортов летнего срока созревания была более «однородной» с точки зрения наблюдавшихся адаптивных изменений.
Литература
1. Драгавцева И.А., Дьяков А.Б. Метод сравнительной оценки экологической адаптивности видов и сортов плодовых культур // Методики опытного дела и методические рекомендации Северо-Кавказского зонального научно -исследовательского института садоводства и виноградарства. - Краснодар, 2002. - С. 82-89.
2. Васфилов С.П. Анализ причин изменчивости отношения сухой массы листа к его площади у растений // Журнал общей биологии. - 2011. - № 6. - Т. 72. - C. 436-454.
3. Кавеленова Л.М., Розно С.А., Осипова Е.А. К методологии сравнения биоэкологических особенностей интродуцентов с аборигенными видами // Интродукция растений: теоретические, методические и прикладные проблемы. Материалы международной конференции. - Йошкар-Ола, 2009. - С. 175-178.
4. Солбриг О., Солбриг Д. Популяционная биология и эволюция. - М.: Мир, 1982. - 488 с.
5. Bussotti F., Pollastrini M. Evaluation of leaf features in forest trees: Methods, techniques, obtainable information and limits // Ecological indicators. - 2015. - Vol. 52. - P. 219-230.
УДК 634.11:575.174.015.3:577.21
РАЗРАБОТКА И АНАЛИЗ SSR-МАРКЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ СОРТОВ И ВИДОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА MALUS
Кветко Е.П., м.н.с. Кузмицкая П.В., к.б.н. Межнина О.А., к.б.н.
Урбанович О.Ю., доцент, д.б.н._
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси», г. Минск, Беларусь, lenagreidon@mail.ru
Аннотация
Молекулярные методы идентификации генотипов сортов и видов Malus, такие как ДНК-идентификация на основе SSR-маркеров, имеют ряд существенных преимуществ перед морфологическими методами идентификации. Для идентификации генотипов методом SSR-анализа в основном используются маркеры, ограничивающие динуклеотидные повторы, которые имеют свои недостатки. Исправить сложившуюся проблему могут маркеры с более сложной организацией повторяющегося мотива. В данной статье апробированы такие маркеры и отобраны наиболее информативные из них, которые показали четкие пики на капиллярном электрофорезе, расчёт PIC показал, что величины информационного полиморфизма маркеров достаточно велики, чтобы дальше проводить с данными маркерами исследования. Ключевые слова: яблоня, SSR-маркеры, ДНК-идентификация, аллель, генетическое разнообразие
THE DEVELOPMENT AND ANALYSIS OF SSR MARKERS FOR THE IDENTIFICATION 0F MALUS CULTIVARS AND SPECIES
Kvetko E.P., junior researcher Kuzmitskaya P.V., bio. sci. Cand. Mezhnina O.A., bio. sci. Cand.
Urbanovich O.Yu., bio. sc. Doctor, prof._
Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus
Abstract
Molecular methods and the identification of genotypes of Malus cultivars and species such as DNA-identification on the basis of SSR markers have a number of significant advantages over the morphological methods of identification. To identify genotypes by SSR analysis, markers limiting dinucleotide replications are used, which have their disadvantages. Markers with a more complex organization of the repeating motive can correct the problem. In this work, such markers were tested and the most informative of them were selected. The markers showed clear peaks on capillary
electrophoresis. The calculation of the value of the information polymorphism of the markers was large enough to continue to conduct research with candidate markers. Key words: apple, SSR markers, DNA-identification, allele, genetic diversity
Введение
SSR-маркеры успешно применяются для различных направлений исследований: для построения генетических карт, оценки генетического разнообразия сортов, установления родословных селекционного материала (Урбанович, 2013; Urrestarazu, 2012). Для идентификации генотипов методом SSR-анализа в основном используются маркеры, ограничивающие динуклеотидные повторы. Получаемые экспериментальные данные показывают, что использование динуклеотидных повторов сопряжено с рядом недостатков таких как "лестница" пиков на секвенаторе после разделения разделении фрагментов амплификации методом электрофореза, что значительно затрудняет интерпретацию данных. Определенную помощь в устранении недостатков может оказать создание маркеров, ограничивающих тринуклеотидные, тетрануклеотидных повторы, а также повторы с более сложной организацией повторяющегося мотива, они значительно повышают точность полученных результатов. В настоящее время использование накопленных массивов данных, полученных в результате выполнения проектов по полногеномному секвенированию геномов растений, а также секвенированию транскриптома предоставляет новые возможности для идентификации микросателлитных последовательностей и разработки новых микросателлитных маркеров, в частности ограничивающих последовательности, повторяющийся мотив в которых отличается от динуклеотидного. Такие маркеры могут обладать большей надежностью по сравнению с уже существующими, лучше подходят для практического использования (Prasad, 2000; Velasco, 2010).
Целью данной работы было создание SSR-маркеров, повторяющийся мотив которых превышает два нуклеотида, пригодных для идентификации сортов и видов рода Malus. Такие маркеры позволят повысить точность методов ДНК-идентификации видов Malus, а также позволят определять сортовую принадлежность клоновых подвоев, в том числе у растущих деревьев, что невозможно сделать по морфологическим признакам.
Материалы и методика
В качестве объекта исследования использовали коллекцию ДНК яблони, состоящую из 28 представителей рода Malus, включая 22 культурных сорта яблони и 6 сортов клоновых подвоев, имеющих белорусское происхождение (Алеся, Банановое, Белорусский синап, Белорусское летнее, Белорусское малиновое, Белорусское сладкое, Боровинка, Вербное, Весялина, Дарунак, Заславское, Имант, Коваленковское, Лошицкое, ПБ4), российское происхождение (Бабушкино, Ветеран, Имрус, Медуница, 54-118), литовское происхождение (Ауксис), казахское происхождение (Заря Алатау), польское происхождение (Коштеля), канадское происхождение (Мелба), английское происхождение (М9, ММ106, М7, М26). Для анализа полиморфизма использовали метод ПЦР-анализа. Состав реакционной смеси для амплификации объемом 20 мкл был следующий: 10*буфер для Taq полимеразы с (NH4)2SO4, без MgCl2; 1,5 мМ MgCl2; 0,2 мМ dNTP; 0,5 нМ праймеры; 1 ЕА Taq-полимераза; 20 нг ДНК. Для анализа использовались праймеры производства компании "Праймтех" (Минск). Были подобраны оптимальные условия ПЦР: I-й этап: 1 цикл: 94°С - 4 мин.; II-й этап: 35 циклов: 94°С - 30 сек.; 50°С - 45 сек.; 72°С - 1 мин; III-й этап: 1 цикл: 72°С -7 мин. Полученные фрагменты разделяли методом капиллярного электрофореза в центре коллективного пользования «Геном» Института генетики и цитологии НАН Беларуси с помощью секвенатора ABI PRISM Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems). Проводили статистическую обработку данных полученного состава аллелей. Частота встречаемости аллелей рассчитывалась как отношение доли каждого аллеля к общему количеству аллелей. Величина информационного полиморфизма маркеров (PIC) вычислялась по формуле: PIC=1-Ipi2 (где pi - частота i-того аллеля).
Для анализа генетического разнообразия представителей сформированной коллекции рода Malus было разработано 32 пары SSR-маркеров, ограничивающих повторы с мотивом не менее 3 нуклеотидов, подобранные к отдельным регионам 1-17 хромосомы генома яблони сорта Golden Deliceous, с использованием данных секвенирования, представленных в GenBank.
Результаты и их обсуждение
Анализ длины аллелей сортов яблони в исследуемых локусах показал, что 4 маркера не позволяли выявлять полиморфизм в исследуемых локусах микросателлитных последовательностей, 13 маркеров не позволяли получить информативных данных для оценки уровня полиморфизма (много пиков, два сайта связывания в геноме, не шли в реакции мультиплексной ПЦР), 7 маркеров показывали нечеткие фрагменты или не давали возможности оценить данные в мультиплексной ПЦР-реакции. Они были исключены из дальнейшего исследования.
В результате проведенного тестирования для дальнейшей работы были отобраны 8 пар праймеров: MC11L02, MC03L1, MC06L2, MC17L01, MC10L1, MC08L01, MC04L1, MC09L04. Сиквенс последовательности праймеров представлен в таблице 1.
С их помощью среди 28 представителей рода Malus в общей сложности было выявлено 70 полиморфных аллелей. Количество полиморфных аллелей для каждого маркера составило: MC11L02 - 8, MC03L1 - 6, MC06L2 - 9, MC17L01 - 4, MC10L1 - 7, MC08L01 - 14, MC04L1 - 10, MC09L04 - 12.
Таблица 1 - Молекулярные маркеры, ограничивающие области тетрануклеотидных повторов
Название праймера Последовательность праймера, 5' ^ 3'
1 MC11L02F TACTCTCTTCCGCCTGCTTT
2 MC11L02R CGTCAACATCATCATCATATCTTTC
3 MC03L1F TCAGGAAAATGCCAGTCCTC
4 MC03L1R CCACTCGGGGTATTTGACTG
5 MC06L2F TCCTCCGTCGTCTTGAGTCT
6 MC06L2R GGTGCGGTGCTTGAAAGA
7 MC17L01F CAGAGTTCCCTAACCCACCA
8 MC17L01R CCAACAAGCCACTGTGAAAA
9 MC10L1F CGTAATTCCGAAAATGTTAATGTTG
10 MC10L1R GATGATCACCATGCTGCACT
11 MC08L01F TGGATATGCCATAATGAAATCTG
12 MC08L01R AGTTTGAAGTGGGGCGTTAC
13 MC04L1F ACTCAGGACCGGCTCAACTA
14 MC04L1R ATGCACATTACGCTGTCTGC
15 MC09L04F GAGACGTACCCCAAGGACAA
16 MC09L04R GGGACAATTCCGTCTTTTCA
Расчёт частоты встречаемости аллелей показал, что аллель с наибольшей частотой встречаемости у сформированной коллекции выявляется с помощью SSR-маркера MC17L01, а аллели с наименьшей частотой встречаемости с помощью SSR-маркера MC08L01. Средняя частота встречаемости аллелей составила: MC11L02 -12,5%, MC03L1 - 16,7%, MC06L2 - 11,1%, MC17L01 - 25,0%, MC10L1 - 14,3%, MC08L01 - 7,1%, MC04L1 - 10,0%, MC09L04 - 8,3%.
Количество уникальных генотипов, выявленных каждым маркером, составило: MC11L02 - 6, MC03L1 - 5, MC06L2 - 8, MC17L01 - 2, MC10L1 - 5, MC08L01 - 13, MC04L1 - 13, MC09L04- 13. Среднее количество уникальных генотипов в исследованной выборке равнялось 8,1.
PIC для каждого SSR-маркера составил: MC11L02 - 0,701, MC03L1 - 0,742, MC06L2 - 0,769, MC17L01 - 0,603, MC10L1 - 0,80, MC08L01 - 0,893, MC04L1 - 0,860, MC09L04 - 0,813. Как видно из представленных результатов, величина данного показателя для маркеров MC08L01, MC04L1, MC09L04 оказалась выше 0,80. В среднем для 8 маркеров PIC составил 0,773.
Примеры выявленных аллелей с помощью отобранных молекулярных маркеров-кандидатов после разделения методом капиллярного электрофореза на секвенаторе приведены на рисунке 1.
Рисунок 1 - Аллели сорта яблони Бабушкино выявленные с помощью маркеров МС08Ь01 (метка Р6С), МС061.2 (метка РОХ), МС10И (метка РАМ), МС09Ю4 (метка ТДМРД) после разделения фрагментов амплификации методом капиллярного электрофореза. Длина аллелей указана цифрами в парах нуклеотидов и соответствует для маркеров МС08Ю1 - 132,140; МС061.2 - 182; МС10И - 202, 226; МС09Ю4 - 360, 370
Выводы
Подбор наиболее информативных маркеров является важной задачей при изучении генетического разнообразия любой культуры. Тестирование разработанных молекулярных маркеров на сортах яблони различного
генетического происхождения позволило выделить среди них 8, характеризующихся высоким уровнем полиморфизма. Они могут являться кандидатами для включения в набор для ДНК-идентификации как сортов яблони домашней, так и сортов клоновых подвоев. Разработанные маркеры могут также быть использованы для оценки генетического разнообразия и сохранения уникальных генетических ресурсов представителей рода Malus.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта БРФФИ №Б18М-040.
Литература
1. Урбанович О.Ю. Молекулярные методы идентификации и генотипирования яблони и груши / О.Ю. Урбанович. - Минск: Право и экономика, 2013 г. - 210 с.
2. Genetic diversity and structure if local apple cultivars from Northeastern Spain assessed by microsatellite markers / J. Urrestarazu [et al.] // Tree Genet. and Genom. - 2012. - Vol. 8. - P. 1163-1180.
3. The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity in wheat / M. Prasad [et al.] // Theor Appl Genet. - 2000. - Vol. 100. - P. 584-592.
4. Velasco R. The genome of the domesticated apple (Malus x domestica (Borkh.) / R. Velasco, A. Zharkikh, J.e.a. Affourtit // Nature genetics. - 2010. - Vol. 42, № 10. - P. 833-841.
УДК 634.11: 631.11
ВЫРАЩИВАНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ САДОВ ИНТЕНСИВНОГО ТИПА
Королёв Е.Ю., к.с.-х.н., с.н.с.
ФГБНУ ВНИИСПК, Орёл, Россия
Аннотация
В данной статье приводится краткое описание различных технологий производства посадочного материала плодовых культур. Определены основные качественные показатели надземной части саженцев, от которых зависит скороплодность и продуктивность современных садов. Отмечена высокая эффективность использования кронированного посадочного материала при закладке плодовых насаждений интенсивного типа. Рассмотрены наиболее перспективные агротехнические приемы, способствующие получению разветвленных саженцев в однолетнем возрасте.
Ключевые слова: плодовый питомник, технология выращивания посадочного материала, приемы стимуляции ветвления, кронированные саженцы
GROWING OF PLANTING MATERIAL FOR INTENSIVE ORCHARDS
Koroliov E.Yu., candidate of agricultural sciences, senior research worker
FSBSI All Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Orel, Russia, korolev.ew.91@mail.ru
Abstract
Brief description of different technologies of fruit planting material production is given in this paper. The main quantity parameters of the aerial part of seedlings, on which precocity and productivity of modern orchards depend, have been identified. High efficiency of the use of the seedlings with a formed crown has been noted when establishing intensive orchards. The most promising agricultural techniques contributing to the production of branched seedlings at the one-year-old age are considered.
Key words: nursery, technology of planting material growing, techniques of branching stimulation, formation of seedling crown
Создание скороплодных и высокопродуктивных плодовых насаждений интенсивного типа на современном этапе развития садоводства, возможно только при использовании посадочного материала высокого качества, соответствующего основным требованиям и стандартам. Закладка современных садов с более плотным размещением деревьев на гектаре и получение промышленных урожаев на 3-4 год после посадки требует от питомников и питомниководческих хозяйств увеличения объема выпуска саженцев, потенциально готовых к плодоношению.
Получение первых плодов в год посадки возможно только при использовании хорошо развитых и
