CC BY
26
ПЕ2ПЕ
В эпидемический сезон КЭ 2002 года по ускоренной схеме привито 350 человек. Из их числа у 16 человек, не прошедших ранее вакцинацию против КЭ, был проверен уровень специфических антител после двукратного введения вакцины. Определялся уровень IgG к антигену вируса КЭ в сыворотке крови методом ИФА с применением тест-систем «Вектор ВКЭ-IgG-CTpHn» (табл. 3).
Следует отметить, что уровень антител определялся через 10-20 дней после введения второй дозы и титр 1:100 свидетельствует о формировании иммунного ответа. Таким образом, иммунный ответ был получен у большинства вакцинированных - 98%.
Был проверен уровень антител у 24 человек, получивших курс вакцинации КЭ клещевой вакциной производства НПО «Вирион» (г. Томск) 1-2 года назад и не подлежащих ревакцинации в 2002 году (табл. 4).
У 7 человек, не имевших иммунной защиты от КЭ после вакцинации томской вакциной, проведена ревакцинация австрийской вакциной против КЭ «ФСМЕ-ИММУН® Инжект». Результаты исследования, проведенные через 4 недели после ревакцинации, представлены в таблице 5.
Выводы
Выявлена хорошая переносимость вакцины «ФСМЕ-ИММУН® Инжект». Общие и местные постпрививочные реакции не превышают 1,6% случаев.
Определение иммунного ответа после двух инъекций более чем у 87% привитых свидетельствует об эффективности вакцинации «ФСМЕ-ИММУН® Инжект», что подтверждается и отсутствием заболевших среди привитых.
Результаты исследования напряженности иммунитета у клиентов, привитых по быстрой (экстренной) схеме, показали эффективность применения этой схемы.
Высокие титры !§С к вирусу КЭ у привитых вакциной «ФСМЕ-ИММУН® Инжект», выявленные тест-системами для восточных серотипов вируса КЭ, подтверждают эффективность данной вакцины для профилактики КЭ от вирусов-возбудителей, распространенных на территории Западной Сибири.
Показана возможность использования вакцины «ФСМЕ-ИММУН® Инжект» для ревакцинации против КЭ лиц, ранее вакцинированных другой вакциной.
Молекулярные механизмы действия мукозоадгезивных адъювантов
С.Г. Маркушин
ГУ «Научно-исслеловательский институт вирусных препаратов им. О.Г. Анлжапарилзе РАМН», Москва
В обзоре рассматриваются молекулярные механизмы лействия некоторых наиболее изученных мукозоалгезивных алъювантов. Оцениваются перспективы их использования лля мукозальной вакцинации.
В
настоящее время большинство вакцин вводится в организм с помощью шприца, то есть парентерально. Вместе с тем этот способ вакцинации нельзя считать оптимальным, учитывая вероятность заражения вакцинируемых опасными инфекционными агентами, передающимися парентерально (вирус иммунодефицита человека и вирусы гепатитов В и С и др.). В этой связи растет интерес к мукозальной иммунизации с использованием вакцин, которые могут действовать при нанесении их на слизистые оболочки вакцинируемого, в частности интраназально или перорально.
1. Мукозальная система иммунитета
Слизистые оболочки человеческого организма являются объектом постоянного воздействия микробных и вирусных агентов. Чтобы выполнять свои
защитные функции, слизистая оболочка должна включать эффективную сигнальную систему, позволяющую индуцировать иммунный ответ. По некоторым данным, мукозальная система иммунитета человека имеет площадь значительно более 400 квадратных метров и резко отличается по некоторым важным параметрам от лимфоидной системы. Во-первых, масса лимфоидной ткани мукозальной системы иммунитета значительно превосходит массу лимфоидной ткани, находящейся в костном мозге, тимусе, селезенке и лимфатических узлах, вместе взятых. Во-вторых, важно отметить, что функции мукозальной лимфоидной ткани не ослабевают в процессе старения организма.
Мукозальная защита против патогенов бактериальной и вирусной природы включает в себя клеточные барьеры и специализированные клетки иммун-
ПЕ2ПЕ
ной системы, локализованные на мукозальной поверхности и состоящие, главным образом, из СЭ4+ -лимфоцитов, секреторных иммуноглобулинов А(Б-^Д) и антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. В респираторном тракте большие скопления лимфоидной ткани в миндалинах (кольцо Вальдейера) содержат М-клетки, дендритные клетки, альвеолярные макрофаги и интраэпителиальные лимфоциты, обладающие антигенпрезентируюшими потенциями. Скопления лимфоидной ткани наблюдаются также и в кишечнике (Пейеровы бляшки, кишечные лимфоидные фолликулы и др.).
Имеются многочисленные данные, свидетельствующие, что антигены захватываются специализированной лимфоретикулярной тканью в верхнем респираторном тракте или кишечнике, где происходят активация, размножение и дифференциация недифференцированных лимфоцитов с последующим их превращением в эффекторные клетки. Низкомолекулярные растворимые антигены способны проникать через эпителий слизистой оболочки и взаимодействовать с дендритными клетками, макрофагами и лимфоцитами, локализованными в эпителии слизистой оболочки. Антигены в виде микрочастиц захватываются главным образом М-клетками, частично локализованными в криптах миндалин в виде скоплений субмукозной лимфатической ткани [6, 48]. В процессе иммунного ответа наблюдается индукция !§Д-антител, которые распространяются по слизистой оболочке на значительные расстояния. Одновременно наблюдается активация Т-хелперов и В-клеток, которые начинают распространяться по му-козальным тканям, включая слизистую кишечника, дыхательного тракта, глоточные миндалины и т.д. Эта активная миграция лимфоцитов и моноцитов, накопление этих клеток в эффекторных сайтах слизистой оболочки являются мощным механизмом иммунной защиты [67, 68]. Подходы к мукозальной вакцинации в настоящее время преимущественно развиваются в двух направлениях: интраназальная и пероральная вакцинация. Интраназальная вакцинация, по мнению одного из ее энтузиастов [52], имеет большие преимущества перед парентеральным введением вакцины. Во-первых, носовая полость легко доступна и имеет богатую васкуляризацию. Присутствие многочисленных ворсинок в области назального эпителия создает большую поверхность для абсорбции. После интраназальной иммунизации наблюдается индукция как мукозального, так и общего иммунного ответа, причем он может быть индуцирован в отдаленных местах организма благодаря распространению эффекторных клеток по всей мукозальной системе иммунитета. Не вызывает сомнений, что интраназальная вакцинация лучше всего подходит для иммунизации больших групп населения, поскольку не требует применения шприцев. Следует также отметить сравнительно невысокую стоимость мукозаль-ных вакцин, больший комфорт для пациентов и отсутствие необходимости иметь опытный медицинский персонал для проведения вакцинации.
Оральная мукозальная вакцинация также имеет определенные преимущества перед парентеральной. Однако следует обратить внимание на два основных недостатка оральной вакцинации. Во-первых, наблюдается ускоренная деградация вакцинных белков под действием ферментов желудочно-кишечного тракта. Во-вторых, отмечается невысокая степень захвата вакцинных белков элементами лимфоидной ткани в желудочно-кишечном тракте.
Липофильные низкомолекулярные соединения эффективно абсорбируются на слизистых оболочках. Фармакокинетический профиль этих веществ при интраназальном и внутривенном введениях часто бывает одинаковым, а уровень абсорбции достигает 80 - 100%. Однако проницаемость слизистых оболочек для гидрофильных биопрепаратов, включая пептиды и белки с высоким молекулярным весом, в норме чрезвычайно мала. Уровень абсорбции пептидов и белков на слизистых оболочках независимо от степени васкуляризации обычно не превышает 1% [30]. Наиболее важным фактором, ограничивающим абсорбцию пептидов и белков на слизистых оболочках, является низкая проницаемость липидных мембран клеток поверхностного эпителиального слоя слизистых оболочек. Низкомолекулярные гидрофильные лекарственные препараты, а также пептиды и белки могут преодолевать эпителиальный поверхностный слой слизистых оболочек, используя простой градиент концентрации, механизм везикулярного эндоцитоза, а также проникая в межклеточное пространство. Межклеточные промежутки являются динамическими структурами и могут открываться и закрываться в зависимости от внешних условий.
Предварительные исследования морфологии и физиологии межклеточных пространств свидетельствуют, что они выполняют две важные функции. Во-первых, они вовлечены в контроль пассивного движения жидкости, электролитов, макромолекул и клеток, выполняя барьерные функции. Во-вторых, они способствуют трансэпителиальному транспорту определенных соединений. Однако молекулярный механизм осуществления этих функций неизвестен и в настоящее время активно изучается [15].
Средние размеры межклеточных промежутков колеблются в пределах 10 А, в связи с чем транспорт больших молекул через межклеточное пространство резко ограничен [46, 44]. Большие пептиды и белки, как было показано, могут проникать через слизистую оболочку, используя механизм эндоцитоза, но в незначительной степени. Важным фактором, определяющим низкую проницаемость биопрепаратов через слизистую оболочку носа, являются организованные волнообразные колебания ресничек мерцательного эпителия, приводящие к быстрому удалению наносимого на слизистую оболочку препарата. Было показано, что средняя продолжительность «полужизни» наносимых на слизистую оболочку носа веществ не превышает 15 - 20 мин [27, 55]. Еще одним моментом, препятствующим транспорту белков и пептидов через слизистые оболочки, служит по-
обзор
тенциальная возможность энзиматической деградации биомолекул. Слизистые оболочки, как правило, содержат на своей поверхности экзопептидазы (моно- и диаминопептидазы), которые могут расщеплять пептидные связи на N1- и С-концах белковой молекулы, а также сериновые и цистеиновые эндопептида-зы, которые могут расщеплять внутренные пептидные связи [37].
Однако абсорбция наносимых на слизистые оболочки препаратов может быть значительно повышена, если введение препаратов осуществляется в комбинации с агентами, способствующими абсорбции. Эти агенты, часто обозначаемые как системы доставки препаратов, включают в себя значительный круг соединений и белков, отличающихся по молекулярному весу и обладающих различными механизмами действия. Все они, в конечном счете, повышают проницаемость поверхностного эпителиального слоя слизистых оболочек.
Сурфактанты
За последнее время была получена ценная информация о целом спектре различных химических соединений - сурфактантов, повышающих проницаемость эпителия слизистой оболочки. В частности, было показано, что разнообразные хелатные агенты, например некоторые соли этилендиаминтетрауксус-ной кислоты (ЭДТА), снижая концентрацию ионов кальция в среде, увеличивают проницаемость межклеточных промежутков. Они индуцируют изменения в клеточной физиологии, вызывая разрушение филаментов актина и других белковых структур на клеточной периферии, снижают адгезивные свойства клеток и активируют протеин-киназную активность [14]. Предполагается, что в этом случае хелатные ангенты стимулируют конденсацию макромолекул, входящих в состав межклеточных промежутков, в частности Р-актина, что вызывает в свою очередь сокращение молекул, образующих каркас цитоскеле-та. В связи с широкими вариациями концентраций кальция в базолатеральной части клеточного монослоя использование хелатных агентов с целью повышения проницаемости слизистой оболочки приводит к неоднозначным результатам [36]. Увеличение проницаемости межклеточного пространства эпителия слизистой оболочки вызывают жирные кислоты. При изучении влияния каприловой и лауриловой кислот на кишечный эпителий Сасо-2 было продемонстрировано, что данные соединения меняют проницаемость межклеточных промежутков, вовлекая механизм сигнальной трансдукции. Дополнительно эти соединения вызывают снижение клеточной дегидро-геназной активности и уровня АТФ [38]. Авторы делают предположение, что эти соединения могут вызвать гибель клеток из-за снижения уровня внутриклеточного АТФ.
Некоторые встречающиеся в природе соединения, способные существовать в цвиттер-ионной форме, могут значительно увеличить абсорбционные возможности слизистой оболочки. В частности, по-
казано, что ацилкарнитины природного происхождения увеличивают в кишечнике крыс абсорбцию различных препаратов без разрушения кишечного эпителия [21]. Отмечено резкое увеличение проницаемости кишечного эпителия Сасо-2 под воздействием пальмитокарнитина для декстрана. При этом не обнаруживалось следов клеточного лизиса [26]. Однако другие авторы отмечают цитотоксичность этого соединения в сходных экспериментах [20].
Механизм действия низкомолекулярных сурфактантов с различными физико-химическими характеристиками был исследован на модели клеточной культуры Сасо-2. В этих экспериментах эффективность анионного сурфактанта додецилсульфата натрия была более выражена по сравнению с неионным сурфактантом (полисорбат 80), однако додецил-сульфат натрия вызывал повреждение клеточных мембран. Во всех случаях отмечалось увеличение проницаемости маркерных молекул как через межклеточное пространство, так и через клеточные мембраны. Додецилсульфат натрия в концентрации 0,4 тМ в течение одной минуты вызывал укорочение микроворсинок на поверхности клеток, индуцировал конформационные изменения молекул актина и разрушение апикальной клеточной мембраны [1]. При этом наблюдалась четкая корреляция между повышением проницаемости кишечного эпителия и повреждением клеточных мембран. С целью снижения токсичности данного класса сурфактантов были синтезированы гликозилированные производные желчных кислот [8]. При изучении способности пяти данных соединений повышать проницаемость назального эпителия у крыс для инсулина были отобраны два соединения, отличающиеся между собой только группой замещения в позиции С3 стероидной структуры (-ОН или -N42 соответственно). Эти два соединения были исследованы с использованием в качестве маркеров гентамицина, ванкомицина и кальцитонина. Гликозилированный препарат, содержащий N42-группу, существенно увеличивал абсорбцию назального эпителия крыс для всех трех антибиотиков. Этот препарат был значительно менее токсичен, чем дезо-ксихолат натрия или таурохолат натрия. Авторы делают вывод, что увеличенная гидрофильность препарата и снижение его токсичности были достигнуты благодаря введению в его молекулу NН2-группы.
Совокупность полученных в этом направлении фактов заставляет скромно оценивать возможность использования перечисленных низкомолекулярных соединений в качестве эффективных факторов, повышающих проницаемость эпителия слизистой оболочки.
Бактериальные токсины - эффективные мукозо-адгезивные адъюванты
Было обнаружено, что многие бактериальные токсины являются эффективными мукозоадгезивными адъювантами. В настоящее время удалось расшифровать молекулярные механизмы токсического действия некоторых токсинов, а также сделать первые ша-
ПЕ2ЛЕ
ги в понимании механизмов их действия в качестве мукозоадгезивных адъювантов.
Наиболее детально в этом отношении исследованы холерный токсин, продуцируемый одножгутико-вой бактерией Vibrio cholerae; термочувствительный энтеротоксин, продуцируемый грамотрицательной бактерией Escherichia coli, а также дифтерийный токсин. Структурный ген дифтерийного токсина локализован в лизогенизируюшем фаге, который содержат некоторые штаммы бактерии Corynebacterium diphteriae, паразитируюшие в верхних дыхательных путях человека. Холерный токсин является белком с молекулярной массой 87 кДа, состояшей из двух типов субъединиц: А и В. Субъединица А, в свою очередь, в процессе взаимодействия токсина с клеткой расшепляется на два пептида - А1 и А2. Молекула холерного токсина состоит из одной A-субъединицы и пяти В-субъединиц. В-субъединицы молекулы холерного токсина узнают и взаимодействуют с находя-шимся на плазматической мембране клетки богатым углеводами ганглиозидом Gml, после чего пептид А1 попадает в клетку и модифицирует ковалентно Gsa-белок, регулируюший активность аденилатциклазы путем переноса АДФ-рибозы с никотинадениндинук-леотида (NAD+) на боковую цепь аргинина Gsa-бел-ка. При этом модифицированный Gsa-белок лишается возможности инактивировать клеточную адени-латциклазу в слизистой тонких кишок, что приводит к запредельному завышению в клетках кишечника циклического АМФ (цАМФ). В результате этого процесса стимулируется активный транспорт ионов в кишечном эпителии и возрастаюший выход ионов Na+ и воды в полость кишечника.
Термолабильный энтеротоксин иммунологически и физиологически сходен с холерным токсином. Аминокислотные последовательности термочувствительного энтеротоксина (LT) и холерного токсина (СТ) имеют 80% гомологии. Тем не менее, по данным японских исследователей [35], LT имеет ряд отличий от СТ. Во-первых, LT взаимодействует помимо класса рецепторов Gml также с классом рецепторов Gm2. Во-вторых, LT активирует как Th1- так и Th2-клетки, в то время как СТ преимушественно индуцирует ТР|2-зависимый иммунный ответ. В-третьих, у мышей, иммунизированных перорально LT, наблюдался гораздо более низкий уровень IgE по сравнению с СТ.
Дифтерийный токсин обладает молекулярной массой 61 кДа. Его молекула состоит из одного фрагмента А с молекулярной массой 21 кДа и одного фрагмента В с молекулярной массой 40 кДа [5]. При взаимодействии дифтерийного токсина с клеткой фрагмент В связывается с гепаринсвязываюшим рецептором на поверхности плазматической мембраны [31]. После гидрофобного взаимодействия фрагмента В с эндосомальными мембранами происходит пе-ремешение фрагмента А в цитоплазму [50]. Более детальные исследования показали, что гидрофобная часть молекулы токсина проникает в липидный монослой и формирует ионный канал, по которому субъ-
единица А проникает в цитоплазму [51]. 1Ч-терми-нальная часть фрагмента В, включая амфипатиче-ский участок альфа-спирали ТН1, играет активную роль во время транслокации фрагмента А. Замена несущих заряд аминокислотных остатков незаряженными аминокислотными остатками в этой части фрагмента В ингибирует транслокацию фрагмента А [45]. При перемещении в цитозоль гидрофильный фрагмент А становится энзиматически активным и катализирует перенос АДФ-рибозильной группы с 1ЧДО+ на гистидиновый остаток цитоплазматического фактора элонгации 2(ЕЕ-2), который осуществляет ГТФ-зависимое перемещение пептидил-тРНК из участка А в участок В на рибосоме после образования пептидной связи. Рибозилированный ЕЕ-2 становится неактивным, что влечет за собой нарушение белкового синтеза и гибель клетки.
Использование токсинов в качестве мукозоадгезивных адъювантов сопряжено с большим риском в связи с их высокой токсичностью. Выходом из этого положения могло быть использование препаратов В-субъединиц токсинов. Эта идея нашла отражение в работах ряда авторов [56, 39, 13]. Однако было обнаружено, что препараты В-субъединиц токсинов не обладают эффективными мукозоадъювантными свойствами. Принимая во внимание это обстоятельство, ряд исследователей попытались в качестве мукозоадгезивных адъювантов использовать препараты В-субъединиц с добавлением следовых количеств целого токсина [57, 58].
Другой более перспективный подход заключался в использовании в качестве мукозоадгезивных адъювантов мутантных форм токсинов, снизивших или потерявших токсические свойства в результате сайт-специфических мутаций. Комазе с соавт. [32] исследовали эффективность шести мутантных форм 1_Т в качестве мукозоадгезивных адъювантов для инактивирован-ной гриппозной вакцины, используемой интраназаль-но на модели мышей. Мутантные формы 1_Т, полученные с помощью сайт-специфического мутагенеза, имели замещения в позициях 7, 61, 112, 118, 146 и 192 1Ч-концевой части А1-фрагмента А-субъединицы. Было обнаружено, что мутантный токсин 1_Т7К, А-субъединица которого в позиции 7 имела аминокислотное замещение аргинин-лизин, мог рассматриваться как наименее токсичный мукозоадгезивный адъю-вант для интраназального введения инактивирован-ной гриппозной вакцины. Из шести мутантных форм 1_Т пять обнаружили сниженную в различной степени токсичность по сравнению с исходной формой 1_Т. Однако только три мутантные формы 1_Т сохранили муко-зоадгезивные свойства: 1_Т7К, 1_Т192С и 1_Т146Е. Мутантный энтеротоксин 1_Т7К не только снижал АДФ-рибозилтрансферазную активность, но также увеличивал свою чувствительность к расщеплению трипсином. Авторы работы делают вывод, что АДФ-рибозил-трансферазная активность связана с мукозо-адгезив-ными свойствами токсина.
С целью понять молекулярный механизм действия бактериальных токсинов в качестве мукозоадгезив-
сьминар нт
ных адъювантов были изучены эффекты различных мутаций в разных частях генов, кодирующих токсины, в том числе влияние этих мутаций на токсичность и мукозоадгезивные качества. В частности, свойства термочувствительного энтеротоксина как мукозоад-гезивного адъюванта были изучены на модели сайт-специфических мутантов, имеющих мутации в активном центре токсина (Б61Р, Д69С, Е112К), мутанта с дефектом протеазного расщепления (К192С) и реком-бинантного белка, соответствующего В-фрагменту энтеротоксина. У мутантных белков были исследованы токсичность, способность повышать активность цАМФ в клетках, а также мукозоадъювантные свойства при использовании столбнячного токсина как антигена [12]. Как показали результаты экспериментов, замещение любой аминокислоты в активном центре энтеротоксина с помощью сайт-специфического мутагенеза приводило к потере токсичности в различных биологических системах. Также было показано, что удаление лизина из активного центра у мутантно-
го белка Е1 12К не только ведет к устранению АДФ-рибозилирующей активности, но также влечет за собой потерю возможности повышать уровень цАМФ в клетках и снижение мукозоадъювантных свойств [40]. На основании последнего факта было сделано заключение, что АДФ-рибозилирование и индукция цАМФ необходимы для проявления мукозоадъювантных свойств термочувствительного энтеротоксина и холерного токсина. Таким образом, аккумуляция цАМФ в клетках ответственна за секрецию ионов и жидкости в просвет кишечника и тесно связана с мукозо-адъювантными свойствами токсинов. Однако имеются сообщения о том, что некоторые мутантные формы холерного токсина и термочувствительного токсина, лишенные АДФ-рибозилтрансферазной активности, сохранили способность индуцировать антиген-специфические сывороточные !§С при интраназаль-ном введении [10, 25].
Прололжение в < 6(19)
Работа со средствами массовой информации (семинар ВОЗ по побочным эффектам после иммунизации)
Т.А. Бектемиров, A.M. Саардак ГУ «НИИ станлартизаиии и контроля
мелииинских биологических препаратов им. A.A. Тарасевича», ГУ «Центральный НИИ эпилемиологии Минзлрава России», Москва
Олин из паралоксов современной вакиинопрофилактики состоит в том, что с повышением эффективности и безопасности вакиинаиии олновременно растет настороженное и взыскательное отношение населения к ней. В немалой степени это объясняется тем, что в срелствахмассовой информаиии (СМИ) аргументы «за» и «против» вакиинаиии уравнены. В лействительности, по ланным ВОЗ, в срелнем вероятность осложнений при вакиинаиии составляет олин случай на миллион, а у заболевших непривитых - олин на лвалиать.
н
енаучная и неадекватная оценка фактических данных приводит к необоснованным отводам от прививок, ставит под угрозу здоровье, особенно со стороны ряда наиболее распространенных инфекционных заболеваний, управляемых средствами специфической профилактики (в Законе об иммунопрофилактике Российской Федерации от 1998 года к последним отнесены прививки против полиомиелита, кори, паротита, гепатита В, туберкулеза, столбняка, коклюша и дифтерии).
К отказу от прививок приводит также мнение многих родителей, что побочное действие вакцин, даже если оно проявляется крайне редко, проявится именно у их ребенка, а вот инфекционное заболевание, нередко угрожающее жизни ребенка, обойдет его стороной.
Все вышеизложенное обязывает органы здравоохранения принимать меры для повышения доверия населения к вакцинопрофилактике. В первую очередь обеспечивать производство вакцин, соответст-
