CC BY
23УДК 577.21:633
Н.А. Картель, С.В. Малышев, О.Ю. Урбанович, А.А. Хацкевич
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ В ИЗУЧЕНИИ ХОЗЯЙСТВЕННО-
ценных признаков сельскохозяйственных культур
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
С открытием Ботстейном (1980 г.) явления «полиморфизма длины рестрикционных фрагментов» (ПДРФ) [1], а позже (1986 г.) Мюли-сом «полимеразной цепной реакции» (ПЦР) [2], появилась реальная возможность изучать наследование фенотипических признаков в их связи с конкретными последовательностями ДНК, идентифицировать индивидуальные особенности организмов на молекулярном уровне с помощью так называемых ДНК-маркеров.
Как известно, для характеристики организмов, в том числе и растений, широко используются морфологические и биохимические (белковые) маркеры. Однако молекулярные и ДНК-маркеры имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с ними. Так, детекция ДНК-маркеров не зависит от условий окружающей среды, стадии роста растения и типа изучаемой ткани. ДНК-маркеры нейтральны, так как не подвержены селекционному давлению и не вносят никаких отрицательных свойств в данный сорт. Они распределены по всему геному и обладают высоким полиморфизмом. Количество ДНК маркеров очень велико - практически любой ген и даже его отдельные аллели могут быть маркированы. ДНК маркеры не взаимодействуют с другими признаками, т.е. не проявляют свойств эписта-за, они обычно доминантны или кодоминантны, дают высоко воспроизводимые результаты. Анализ большинства ПЦР-маркеров проводится по одной схеме, включающей 3 стадии: выделение ДНК, амплификацию и электрофорез.
Исключительно ценным для исследований геномов растения является метод ПЦР-анализа, для осуществления которого требуются прай-меры (синтезируемые короткие последовательности ДНК, гомологичные амплифицируемой ДНК). В зависимости от типа используемых праймеров, условий ПЦР, гель-электрофореза и способа визуализации результатов выделяют много типов маркеров: RAPD, AFLP, SSR, SCAR, STS, IRAP, REMAP и другие. Наиболее широкое распространение получили два типа маркеров RAPD - произвольно амплифициро-ванная полиморфная ДНК и SSR - простые повторяющиеся последовательности.
Методы ДНК-маркирования сейчас успешно и широко используются в самых различных направлениях и областях биологической науки, в т.ч. в генетико-селекционных исследованиях.
Это идентификация и паспортизация сортов, сертификация партий семян, определение генетической чистоты линий и сортов, выявление доноров агрономически важных признаков, маркирование генов устойчивости к болезням и другим биотическим и абиотическим факторам, ДНК-маркер сопутствующий отбор, определение связей между сортами и их происхождением, создание молекулярно-генетических карт сельскохозяйственных культур и других растений. Молекулярное маркирование сейчас также используется для определения филогенетических связей между культурными растениями и их дикими сородичами (вопросы систематики).
ДНК-паспортизация сортов сельскохозяйственных культур
Идентификация сортов, линий и гибридов растений является неотъемлемым элементом селекции и семеноводства. Сорту предоставляется правовая охрана, если он обладает такими
характеристиками как новизна, отличимость, однородность и стабильность.
Методы идентификации сортов сельскохозяйственных растений базируются в основном на
оценке морфологических признаков и биохимических (белковых) маркеров. Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков. Как известно, морфологические признаки имеют определенные ограничения, связанные с субъективностью в анализе признака, некоторые диагностические признаки проявляются только на конкретной стадии развития растения. Как морфологические, так и биохимические маркеры являются недостаточно точными. В то же время методы, основанные на использовании ДНК-маркеров, имеют ряд преимуществ, к числу которых можно отнести то, что они дают высоко воспроизводимые результаты и незаменимы в спорных случаях, когда применение традиционных подходов не позволяет достоверно различить исследуемые образцы. Важным моментом является также то, что при этом не требуются полевые испытания материала.
Нами разработана методика идентификации
и паспортизации сортов сельскохозяйственных культур [3], согласно которой для анализа генотипов в качестве маркеров используются микро-сателлитные последовательности ДНК или SSR маркеры. Эти маркеры высокополиморфны, стабильно наследуются в поколениях и охватывают разные области генома. Система SSR-маркеров характеризуется высоким уровнем стандартизации и поддается автоматизации.
Метод идентификации геномов основан на определении длины повторяющихся последовательностей ДНК у отдельных образцов растений с помощью ПЦР и специальных праймеров. В результате ПЦР исследуемых образцов с SSR-маркерами образуются продукты, отличающиеся по длине на один или несколько нуклеотидов. На рис. 1 приведен пример продуктов амплификации по одному микросателлитному маркеру WMS389.
Bylina
,¿00 „,»165 Bylina 2
------ Fantaziya 9
>¿00 _- 465 Fantaziya 10
. J.00 .J65 Zl ata 13
J00 .__ ^ ,165 ZI ata 14
-400 ^¿65 Spektr 17
W00 J 16,5 Spektr 18
.»100 - J65 Epopeya 19
100 ^Лд - Д65 Epopeya 20
-<100 -»165 Shchara 21
Л00 . _*119 У\65. Shchara 22
Nadzeya 23
,__р^Азт, Nadzeya 24
,100 _*165 Karavai 25
J 400 -/465 Karavai 26
J ¿00 Berezina 27
^400 ^465 Berezina 28
---.-Л137 Zavet 29
, 100. _—-"1137 >465. Zavet 30
_Л0£_ _у 465_ Legenda 31
^ЧШ. Legenda 32
-400 -465 Suzore 33
__ Suzore 34
«.100 . J65 Poshuk 35
УЧ00 ^Ла Poshuk 36
...100 465 Uzlet 37
r>100 _____ ^,«165 Uzlet 38
-400 -465 Poeziya 39
Poeziya 40
115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175
Рис.1. Продукты амплификации микросателлитного маркера WMS389, проанализированные с использованием программы Fragment Analyser 1.02. В виде пиков показаны фрагменты ДНК различных аллелей
для сортов пшеницы.
Подробный анализ проводится обычно примерно для 15-20 SSR-маркеров, по каждому сорту. В результате такого анализа по каждому сорту получается набор специальных, характерных только для данного
сорта аллелей, на основании которого составляется формула генотипа, т.е. паспорт. Для примера приведем здесь составленные нами молекулярные паспорта для двух сортов пшеницы.
Сорт мягкой пшеницы Былина
A123 B118 C141 F190 G235 H149 ^179 J160 K196 L79 M202 N142 O113
POR S T U W
182 ^117 null 149 115 183 246
Сорт мягкой пшеницы Спектр
A123 B118 C141 F190 G247 H149 ^179 J206 K174 L79 M210 N144 O119
POR S T U W
184 ^117 null 149 15^ 18^ 252
Подобные паспорта разработаны нами также для ряда сортов картофеля, льна, сахарной свеклы, томата, а также сортов яблони.
Для видов, характеризующихся высоким генетическим разнообразием, целесообразно использовать меньшее количество маркеров. Так, при разработке молекулярных методов идентификации сортов яблони была выбрана комбинация из 6 sSR-маркеров [4]. Ее оказалось достаточно, чтобы составить молекулярно-генетические паспорта сортов этой культуры. В целом генетические паспорта были созданы для 104 сортов и видов яблони, среди которых 38 сортов, включенных в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород Республики Беларусь. На основе полученных паспортов сортов яблони можно формировать базу данных генотипов. По распределению аллелей микроса-теллитных локусов яблони можно также судить
о генетическом сходстве или различии отдельных сортов, например, в спорных случаях. Так, в частности, в отношении идентичности сортов Белый налив и Папировка высказывались разные мнения. Часть исследователей считали Белый налив и Папировку одним сортом, в других работах указывалось, что это самостоятельные сорта [5, 6]. Молекулярные методы идентификации демонстрируют, что Белый налив и Папировка являются разными сортами, при этом достаточно близкими на генетическом уровне. Степень их генетического сходства выше, чем у других сортов, подвергнутых анализу.
В целом создание ДНК-паспортов позволяет решать следующие задачи:
- идентификация и регистрация генотипов,
- проверка генетической чистоты сортов и инбредных линий,
- оценка уровня гибридности,
- помощь в организации контроля за сменой сортового состава при семеноводстве,
- создание банка сортов, в т.ч. и внесенных в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород, допущенных к использованию.
ДНК маркеры в селекции пшеницы
Наряду с созданием генетических карт, молекулярные маркеры в сочетании с ПЦР анализом позволяют осуществлять генотипирование отдельных генов, например, в сортах сельскохозяйственных культур, имеющих хозяйственное значение.
В лаборатории молекулярной генетики ведется работа по идентификации с помощью ДНК-праймеров аллельного состава таких хозяйственно важных генов как запасных белков-глютенинов (О1и-А1, Glu-B1, Glu-D1), генов, определяющих твердозерность (Рта-D1, Pinb-D1) и устойчивость к болезням ^г Рт, Sr), генов короткостебельности Rht1, Rht2), генов яровости/озимости (Ут1, Ут3) и др. [7].
Создание полукарликовых, высокопродуктивных, устойчивых к полеганию сортов является важной задачей в селекции пшениц. В настоящее время выявлено и картировано более 20 генов короткостебельности (Rht). Нами проанализировано 20 сортов белорусской се-
лекции на присутствие в их геноме наиболее важных генов короткостебельности (КИ^В1Ь, Rht-D1b, Rht8). Только у 9 сортов выявлены такие гены. Ген Rht-B1b обнаружен лишь в одном сорте Пошук, ген Rht-D1b - у двух сортов (Спектр и Узлет), ген Rht8 - в семи сортах. Эти данные свидетельствуют о том, что у нас селекция пшеницы на короткостебель-ность ведется пока недостаточно активно.
Хлебопекарные качества пшеницы являются одной из главных целей селекции. Важнейшими факторами качества муки являются нерастворимые в воде белки глютенины, которые кодируются генами, расположенными на гомологичных хромосомах 1-ой группы. Они определяют свойства упругости и растяжимости пшеничного теста. Запасные белки семян, ответственные за образование пшеничного глютена состоят из двух главных фракций: глиадинов и глютенинов.
Глютенины - это мультимерные комплексы, состоящие из субъединиц высокого (HMW) и
низкого (LMW) молекулярного веса, связанные вместе дисульфидными связями. Высокомолекулярные глютенины кодируются генами в Glu-1 локусах, а низкомолекулярные глютенины кодируются генами в Glu-3 локусах, которые тесно сцеплены с локусом Glu-1. Каждый Glu-1 локус состоит из 2-х тесно сцепленных генов, кодирующих глютенины х и у типа. В каждом из глютениновых генов существует аллельная вариация, и в ряде исследований показано, что состав аллелей влияет на свойства пшеничного теста. Так, субъединицы HMW глютенинов Шх5-Шу10 положительно влияют на упругость теста и улучшают хле-
бопекарные качества, тогда как субъединицы Шх2-Шу12 связаны с низкими хлебопекарными качествами.
Сейчас для анализа состава глютенинов используют метод SDS полиакриламидного гель-электрофореза. Однако он довольно трудоемок и не имеет достаточной разрешающей силы, что не позволяет использовать его во многих селекционных программах. Мы применили метод ПЦР анализа на основе специфических ДНК маркеров (STS), которые амплифициру-ют отдельные наиболее ценные аллели Glu-1. Было проанализировано 20 сортов белорусской селекции (табл. 1).
Таблица1
ПЦР генотипирование аллельного состава запасных белков - HWM глютенинов
Сорт Год включения в Реестр Glu-A1x Glu-B1x Glu-D1x + Glu-D1y
Березина 1985 1 7 5+10
Надзея 1987 1 7 5+10
Сузорье 1992 1 7 5+10
Пошук 1995 1 7 2+12
Капылянка 1995 2* 7 5+10
Гармония 1997 1 7 2+12
Каравай 1998 2*, null 6 5+10
Былина 1998 null 7 5+10
Легенда 2000 null 7 5+10
Соната 2001 null, 1 6 5+10
Щара 2001 null 7 2+12
Премьера 2002 null, 1 7 5+10
Завет 2002 null 7 5+10
Узлет 2005 null 7 5+10
Спектр 2004 null 7 5+10
Эпопея - null 7 5+10
Мелодия - null, 2*, 1 7 5+10
Злата - 2* 7 2+12
Поэзия - 1 7 5+10, 2+12
Фантазия 2006 1 7 2+12
Как оказалось, лишь один сорт Копылянка содержит в геноме хорошее сочетание аллелей глютенинов. Другие сорта, наряду с положительными аллелями, содержат также аллели, негативно влияющие на качество муки.
Важным показателем качества пшеницы является также твердозерность, которая зави-
сит от экспрессии двух генов пуроиндолинов (Pina-D1 и Pmb-D1), находящихся на 5D хромосоме. Продуктом этих генов является белок фриабилин (15 Ша).
Для твердозерной пшеницы характерно, что крахмальные зерна прочно сцеплены с белковым матриксом, а у мягкой пшеницы они слабо
сцеплены с белковым матриксом. У твердозер-ных сортов белок фриабилин присутствует на поверхности крахмала в небольших количествах, а у мягкозерной - в большом количестве. Твердозерную пшеницу лучше использовать для выпечки хлебобулочных изделий, а мягкозерную - для кондитерских изделий.
Существующие методы определения твер-дозерности по физическим свойствам муки крайне трудоемки и малопригодны для применения в селекционном процессе. С помощью ДНК маркеров выявить этот параметр намного проще. Мы провели ПЦР генотипирование тех же белорусских сортов пшеницы по признаку твердозерности. Оказалось, что 12 сортов несут мутантную аллель Pinb-D1b, придающую им твердозерность (Березина, Пошук, Копы-лянка и др.), а у сорта Гармония, Каравай, Ща-
ра - несут аллели дикого типа, т.е. относятся к мягкозерным.
Пять сортов (Санта, Премьер, Завет, Эпопея и Мелодия) проявляют высокую гетерогенность, т.е. представляют собой расщепляющиеся популяции по признаку твердозерно-сти. Для улучшения хлебопекарных качеств этих сортов необходим отбор на однородность, что легко можно сделать с помощью ДНК-маркеров.
Нами также получены интересные данные по выявлению генов устойчивости к бурой листовой ржавчине - одной из основных болезней пшеницы [8]. Было проанализировано 68 сортов мягкой пшеницы на присутствие девяти Lr генов. У 4-х сортов выявлены ценные Lr34 и Lr26 гены (Мелодия, Злата, Поэзия, Фантазия).
ДНК-маркеры в селекции ржи
В настоящее время исследования, связанные с использованием эффекта гетерозиса, проводятся практически у всех культур. Причем, более высокий гетерозисный эффект дают перекрестноопыляющиеся культуры. Создание гетерозисных гибридов F1 у ржи позволяет повысить урожайность этой культуры на 1520% по сравнению с лучшими популяционны-ми сортами. Гетерозисные гибриды обладают более высоким генетическим потенциалом адаптивности, устойчивости к болезням, качества зерна и стабильной урожайности. Рядом исследователей установлено, что использование гибридных сортов экономически оправдано уже при 10%-ном уровне конкурсного гетерозиса.
В качестве биологического способа кастрации материнских растений при контролируемых скрещиваниях для получения гибридных семян используют ЦМС. На основе ЦМС создается соответствующая генетическая система, состоящая из стерильного аналога материнского компонента скрещивания, закрепителя стерильности (для поддержания и размножения стерильного аналога), восстановителя фер-тильности - отцовского компонента.
Описаны различные источники ЦМС, среди них наиболее часто используется цитоплазма «Пампа» (Р), открытая в конце 60-х годов в Аргентинской ландрасе ржи [9]. Для полно-
го восстановления фертильности пыльцы для этой цитоплазмы требуются эффективные ядерные гены восстановители. Однако частота эффективных генов-восстановителей мужской стерильности в европейском материале ниже 5% [10] и, кроме того, их эффективность сильно подвержена влиянию среды [11]. Частичное восстановление ЦМС приводит к уменьшению количества жизнеспособной пыльцы, что в свою очередь благоприятствует заражению спорыньей (Claviceps purpurea). Данная инфекция приводит к загрязнению ржаного зерна склероциями, содержащими токсичные алкалоиды. Поэтому для уменьшения такого риска ржаные гибриды должны содержать эффективные гены-восстановители. Относительно недавно новые источники генов-восстановителей были описаны в примитивной популяции Иранской ржи - IRAN IX и Аргентинской ландрасе - Pico Gentario [11]. Данные источники проявляют значительно более высокий уровень восстановления, чем используемые в настоящее время европейские линии и более высокую средовую стабильность. С использованием методов RFLP-картирования в обоих случаях были обнаружены одиночные главные гены-восстановители (Rfp1 и Rfp2), локализованные на длинном плече хромосомы 4R [12]. Оба гена, вероятно, аллельны или даже идентичны. Следует отметить, что в другом ис-
следовании, проведенном при участии лаборатории молекулярной генетики ИГЦ НАНБ, в том же районе хромосомы 4R был картирован ген-восстановитель цитоплазмы G-типа (Rfg1) [13]. Ген-восстановитель цитоплазмы С-типа (Rfcl) также картирован в этом районе [14]. Таким образом, на хромосоме 4R выявлен главный ген или кластер генов, контролирующий восстановление ЦМС у ржи, что открывает широкие возможности для использования методов «маркер-сопутствующего отбора» (MAS) для создания линий восстановителей с высоким индексом восстановления. Для эффективного применения ДНК-технологии в селекционном процессе необходимо применение ДНК-маркеров, основанных на технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР), таких как STS, CAPS или SCAR. Первые такие маркеры для генов-восстановителей у ржи уже описаны [15].
Создание гетерозисных гибридов Fj озимой ржи в настоящее время в мире наиболее успешно осуществляется фирмой «Lochow-Petkus GmbH» (Германия). Испытание ее гибрида Fj Пикассо в государственном со-
ртоиспытании Республики Беларусь показало его абсолютное превосходство над всеми другими гетерозисными гибридами, в том числе совместными российско-немецкими и белорусско-немецкими (НВП-3, ЛоБел 103, 203, 303). Подбор компонентов для создания гибридов в данной фирме проводится с использованием базы данных по селекционной ценности и степени родства имеющихся образцов генофонда ржи, что, как было указано ранее, резко повышает эффективность селекционной работы при ее значительном ускорении. В последние годы данная фирма разработала и активно применяет в селекционном процессе технологию «Pollen plus», которая заключается в использовании методов «ДНК-маркер-сопутствующего отбора» для контроля генов-восстановителей фертильности на всех стадиях селекции гибридной ржи. С использованием новой технологии уже созданы новые гибридные сорта (Pollino и Visello). Эти сорта существенно превосходят ранее созданные по признаку фертильности и устойчивости к спорынье.
ДНК-маркеры в селекции томата
Одним из современных направлений в селекции тепличных томатов является создание высокотранспортабельных и лежких гибридов. Получение таких гибридов увеличивает устойчивость зрелых плодов к перезреванию, размягчению, т.е. их способность сохраняться на растении в течение длительного времени (не менее 25 дней), повышает отдачу товарного урожая, увеличивает срок поступления свежих томатов из теплиц, позволяет перевозить тепличную продукцию на дальние расстояния без потери качества.
В селекции по данному направлению большой интерес представляет использование генов nor (non-ripening), rin (ripening ingibitor), Nr (never ripe), alc (а/cobaca), gr (green ripe) и др., которые в гетерозиготном состоянии значительно улучшают сохранность плодов томата на растении [16]. В настоящее время изучен характер наследования генов nor, rin, контролирующих задержку созревания плодов томата, и их взаимодействие с генами, определяющими структуру урожая, раннеспелость и лежкость [17]. Мутант alcobaga изучен недо-
статочно и менее использовался в селекции в сравнении с rin и nor. Он был отобран как лан-драса в Португалии и интродуцирован в 1967 в Бразилии, где и были впервые описаны его фенотипические особенности [18].
По поводу наследования мутанта alcobaga существуют некоторые противоречия в литературе. Mustchler описала его как рецессивный ген (alc) на хромосоме 10, неаллельный гену nor, и расположенный на дистанции 17 сМ от последнего [19]. В противоположность Lobo с соавт. описали его как другой аллель в локусе nor, отличающийся от nor+ и nor и обозначили символом norA [18].
Приняв за гипотезу, что мутант alcobaga является аллельной формой гена nor, мы секвени-ровали ген LeNAC-NOR у селекционной линии, несущей ген alc. С целью получения последовательности ДНК гена LeNAC-NOR у мутанта alcobaga были подобраны три пары праймеров, фланкирующие экзоны данного гена. Они были успешно использованы для амплификации кодирующей части гена LeNAC-NOR у линии Mo-950 и полученные фрагменты затем были
секвенированы. Была идентифицирована точечная мутация во втором экзоне, приводящая к аминокислотной замене валин-аспарагин. Таким образом, наши результаты свидетельствуют, что ген alc является новой аллельной формой LeNAC-NOR гена.
Разработаны и протестированы STS, CAPS и dCAPS маркеры к генам созревания томата rin,
nor и alc. Результаты генотипирования показывают, что разработанные методы позволяют эффективно выявлять данные гены на любой стадии развития растений от проростков до плодов. Кроме того, данные методы позволяют идентифицировать гетерозиготные формы, и позволяют выявлять неоднородность или засоренность материала.
ДНК маркеры в селекции яблони
Яблоня является одной из самых распространенных и важных плодовых культур в Беларуси. Она занимает 93% площадей в садах сельскохозяйственных предприятий и 79% - населения. Важнейшим направлением в селекции яблони является создание сортов с высокими потенциалом продуктивности, вкусовыми и технологическими качествами плодов [20]. Реализация данных свойств сортов во многом определяется устойчивостью их к болезням, так как только здоровые растения могут реализовать свой генетический потенциал продуктивности. Важное значение в селекции плодовых культур имеет разработка новых технологий, которые позволят сократить время селекционного процесса и повысят степень надежности оценки селекционного материала. К таким технологиям относится технология молекулярных маркеров. В частности, она может успешно использоваться в селекции яблони на устойчивость к парше -наиболее опасному и распространенному заболеванию яблони в садах Беларуси.
Известно более десяти генов, ответственных за устойчивость яблони к парше. Они обнаружены в геноме как яблони домашней, так и у диких видов яблони. Часть из них можно определить на молекулярном уровне с помощью соответствующих маркеров. Так, нами совместно с РУП "Институт плодоводства" были проведены исследования, направленные на выявление отдельных генов устойчивости к парше в геноме сортов яблони и применения маркер-сопутствующего отбора при создании устойчивых к парше сеянцев яблони.
Определение генов устойчивости к парше проводили в коллекции сортов яблони, представленной 130 образцами. Среди них 37 сортов, включенных в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород Республики Беларусь Геном данных образцов
был подвергнут тестированию на присутствие генов устойчивости к парше Vf, Vm, Vh2/Vr-A, Vr1/Vh4/Vx [21-25]. Маркер, сцепленный с локусом Vr1/Vh4/Vx, был идентифицирован в геноме 34 образцов. Среди них современные сорта и сорта, известные еще в 19 веке, такие как Папировка, Белый налив, Коробовка крупноплодная. Детектируемый локус из сорта Па-пировка был перенесен в современные сорта Мечта и Народное. Маркер также обнаружен в сорте Mcintosh и полученных на его основе сортах Wijcik, Auksis, Melba. Маркер к гену Vh2/Vr-A был идентифицирован в геноме 81 образцов. Не исключено, что не все сорта, в которых детектируется маркер, содержат искомый ген. Однако маркер можно успешно использовать в селекционных программах для того, чтобы проследить наследование данного локуса от родителей к потомкам.
Ген Vm был идентифицирован в геноме 7 образцов. Среди них сорт McIntosh и полученный на его основе сорт Wijcik. Ген обнаружен в образце SR0523 и его потомках Орловим, Первинка, 84-39/58, 84-50/9.
Ген Vf был детектирован в геноме 41 сорта селекции Франции, США, Польши, России и Беларуси. Сравнение полученных результатов с родословной сортов яблони позволило определить, что основным источником гена Vf в сортах белорусской селекции Белорусское сладкое, Дарунак, Надзейны, Память Коваленко, Поспех была линия ВМ41497. Она, в свою очередь, унаследовала ген отM. floribunda 821. Сорт Имант унаследовал ген от сорта Либерти. В сорта российской селекции Афродита, Юбиляр, Орловское полесье, Солнышко, Старт, Строевское, Веньяминовское ген был интродуцирован из линии 814.
Для представленных в коллекции сортов была проведена оценка устойчивости к парше в
полевых условиях [26]. Максимальное поражение паршой было отмечено у сортов Mcintosh, SR0523, Melba. Наличие гена Vm в геноме Mcintosh и SR0523 не защищает их от поражения паршой. Поражение паршой этих сортов сходно с поражением сорта Melba, созданного на основе Mcintosh, но не содержащего ген Vm.
Старые сорта Антоновка обыкновенная, Бабушкино, Белый налив, Боровинка, Графин-штейн, Коробовка крупноплодная, Коштеля, Папировка, Пепин литовский демонстрируют низкую или среднюю чувствительность к парше. Часть из этих сортов не содержат ни одного из использованных маркеров. Образцы, в которых выявляются маркеры к генам Vh2/ Vr-A, Vr1/Vh4/Vx демонстрируют различный уровень устойчивости к парше от низкого у SR0523 до высокого у 78-14/245. Вероятно, влияние этих локусов на устойчивость к парше не является определяющим.
Устойчивость к парше демонстрируют 17 сортов, таких как Hislop, Jay Darling, Minkar, Nora, Память Вавилова, Коваленковское, Вербное, и др. у которых не выявлен ни один из тестируемых маркеров. Устойчивость к парше у этих сортов определена другими генами или носит полигенный характер.
Все сорта, содержащие ген f демонстрируют высокую устойчивость к парше в условиях Беларуси. Они показали высокую устойчивость к поражению паршой как листьев, так и плодов. Следовательно, ген Vf до настоящего времени остается высокоэффективным в защите яблони от парши. В связи с этим были отработаны молекулярные методы отбора сеянцев яблони, содержащих этот ген. 168 образцов гибридных сеянцев яблони, полученных от различных ком-
бинаций скрещиваний, было исследовано с помощью молекулярных маркеров с целью определения гена Vf [27]. В общей сложности среди проанализированного материала 125 растений (74,4%) имеют доминантный аллель Vf в гетерозиготной форме и 43 растения (25,6%) являются рецессивными гомозиготами по данному гену. Полученные результаты показывают, что для повышения эффективности отбора в селекции, направленной на получение несущих ген Р/сортов яблони, целесообразно сочетать классический фитопатологический подход с использованием молекулярных маркеров. Это позволит значительно ускорить процесс селекции за счет идентификации ценных генов на первых стадиях роста растений и при этом получить более точные результаты относительно содержания гена Vf в генотипе селекционного материала, поскольку анализ будет проводиться непосредственно на уровне ДНК, а не на уровне подверженного влиянию среды фенотипа. Таким образом, молекулярные маркеры позволяют своевременно избавиться от селекционного брака на первых стадиях онтогенеза, сократить время селекционного процесса, получить сведения о содержании хозяйственно-ценных генов в геноме отдельных сортов и селекционных образцов.
В заключение хотелось бы подчеркнуть, что ДНК маркеры уже становятся неотъемлемым элементом селекционного процесса при выведении новых сортов. Они находят свое применение как на этапе подбора исходных источников для гибридизации, так и при последующем анализе гибридного материала и полученного сорта. Стал реальным принципиально новый уровень селекции растений, который называют «ДНК маркер сопутствующий отбор».
Список использованных источников
1. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism / D. Botstein [et al] //Am. J. Hum. Genet. - 1980- V 32 -P. 314-331.
2. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction / K.B. Mulis, [et al] // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. - 1986. - V. 51 - P. 263-273.
3. Малышев, С.В. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, льна и свеклы)
на основе ДНК маркеров / С.В. Малышев, О.Ю. Урбанович, Н.А. Картель // Методические рекомендации Минск - 2006. - С. 27.
4. Паспортизация сортов яблони на основе SSR-маркеров / О.Ю. Урбанович [и др.] // Доклады НАН Беларуси. - 2008. -Т. 52, № 5. -С. 93-99.
5.Симиренко, Л.П. Помология / Л.П. Симирен-ко// Издательство Украинской Академии с/х наук -Киев. - 1961. -Т. 1. -580 с.
6. Помология БССР, под ред. проф. Ипатье-
ва А.Н. // Издательство «Вышейшая школа», Минск. -1972. - 192 с.
7. Картель, Н.А. ДНК-технологии - новый этап в селекции и семеноводстве растений / Н.А. Картель // Наука и инновации.- 2008.-№6.- С. 36-41.
8. Определение генов устойчивости к бурой ржавчине в сортах пшеницы (Triticum aestivum L.) с использованием молекулярных маркеров / О.Ю. Урбанович [и др.] // Генетика -2006. - Т. 42 - №5 - С. 675-683.
9. Geiger, H.H. Cytoplasmic male sterility in rye (Secale cereale L.) / H.H. Geiger, F.W. Schnell // Crop Sci.- 1970.- V10.- P. 590-593.
10. Yuan, YP. Umweltstabilitat der cytoplasma-tisch-genisch vererbten mannlichen Sterilitat (CMS) bei Roggen (Secale cereale L.) / Y.P. Yuan // Verlag UE Grauer, 1995, Stuttgart, Germany.
11. Geiger, H.H. Genetic basis and phenotypic stability of male fertility restoration in rye. / H.H. Geiger, T. Miedaner // Vortr Pflanzenzuchtg.- 1996.-V. 35.- P. 27-38.
12. Mapping of genes for male fertility restoration in "Pampa" CMS winter rye (Secale cereale L.) / T. Miedaner [et al] // Theor. Appl. Genet.-2000.- V.101.- P. 1226-1233.
13. Genetics and molecular mapping of a male fertility restoration locus (Rfgl) in rye (Secale cereale L.) / A. Borner [et al] // Theor. Appl. Genet.-1998.- V. 97.-P. 99-102.
14. Stojalowski, S. Rye SCAR markers for male fertility restoration in the P cytoplasm are also applicable to marker-assisted selection in the C cytoplasm / S. Stojalowski, M. Jaciubek, T. Miedaner // J. Appl. Genet.- 2005.- V46.- P. 371-373.
15. Development of PCR-based markers linked to dominant genes for male-fertility restoration in Pampa CMS of rye (Secale cereale L.) / S. Stracke // Theor. Appl. Genet.- 2003. V. 106.-P. 1184-1190.
16. Андреева, Е. Томаты с замедленным созреванием / Е. Андреева, К. Богданов // ВНИ-ИСОК: Семена, № 3, 1999, с. 26.
17. Seroczynska, K. Niemirowicz-Szczytt Genetic analysis of selected tomato traits in crosses between cultivated lines and the nor mutant / K. Seroczynska,
J. Appl // Genet. - 1998. - V.39. - P. 259-273.
18. Lobo, M.J. Hannah Inheritance and characterization of the fruit ripening mutation in 'Alco-baca' tomato/ M.J. Lobo, L.C. Bassett // J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 1984. - V.109. - P. 741-745.
19. Mustchler, M.A. Inheritance and linkage of the 'Alcobaca' ripening mutant in tomato / M.A. Mustchler // J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 1984. -V. 109. - P. 500-503.
20. Козловская, З.А. Научные основы селекции яблони для интенсивных садов Беларуси: автореф. Дис. ... д-ра с.-х. Наук: 06.01.05 // З.А. Козловская; БГСХА.- Горки, 2006,- 40 с.
21. Linkage of Vfa4 in Malus x domestica and Malus floribunda with Vf resistance to the apple scab pathogen Venturia inaequalis / M.R. Afuni-an [et al] // Plant Pathology. -2004. -Vol. 53.-P. 461-467.
22. Development of reliable PCR markers for the selection of the Vf gene conferring scab resistance in apple / S. Tartarini [et al] // Plant Breed. -1999.-Vol. 118.- P. 183-186.
23. Development of a DNA marker for Vm, a gene conferring resistance to apple scab / F.S.Cheng [et al.] // Genome.-1998.-Vol. 41.- P. 208-214.
24. The Vh8 locus of a new gene-for-gene interaction between Venturia inaequalis and the wild appleMalus sieversii is closely linked to the Vh2 locus in Malus pumila R12740-7A / V.G.M.Bus [et al.] // New Phytologist.-2005.-Vol. 166.-P. 1035-1049.
25. Development of a multiallelic SCAR marker for the scab resistance gene Vr1/Vh4/Vx from R12740-7A apple and its utility for molecular breeding / A. Boudichevskaia [et al] // Tree Genetics and Genomes.-2006. -Vol. 2, N 4. -P. 186-195.
26. Identification of scab resistance genes in apple trees by molecular markers / O. Urbanovich [et al.] // Sodininkyste ir darzininkyste.-2008.-Vol. 27, N 2.- P. 347-357.
27. Результаты отбора гибридных сеянцев яблони на устойчивость к парше фитопато-логическими и молекулярными методами / О.Ю. Урбанович и др. // Молекулярная и прикладная генетика. -2008. - Т. 8.- С. 113-119.
Дата поступления статьи 24 марта 2009 г.
