19УДК631.52:577.213
Анализ нового гибридного фонда яблони (Malus Mill.) на присутствие ДНК-маркера гена Vf устойчивости к парше (Venturia inaequalis)
Пикунова А.В., к.б.н Седов Е.Н., д.с.-х. н., академик РАН Серова З.М., к. с.-х. н. Должикова М.А., бакалавр
ФГБНУ ВНИИИСПК, Орёл, Россия, pikuanna84@mail.ru
Аннотация
Парша (Venturia inaequalis) - наиболее вредоносный патоген яблони (Malus Mill.). В настоящее время в помощь селекционерам разработаны методы, основанные на анализе полиморфизма ДНК и позволяющие с высокой точностью выявлять генотипы с генами устойчивости на ранних этапах онтогенеза растения. В статье изложены результаты ДНК-генотипирования нового гибридного фонда яблони ВНИИСПК на присутствие VfC ДНК-маркера гена устойчивости к парше Vf. Всего 94 гибридных сеянца из трех гибридных семей полученных от ортологических скрещиваний нового гибридного фонда были протестированы. В результате выявлены гибриды, имеющие ДНК-маркер гена Vf. Методы маркер-вспомогательной селекции будут способствовать повышению эффективности селекционных исследований.
Ключевые слова: ДНК-маркеры, маркер-вспомогательная селекция, яблоня, гибридный фонд, парша
Screening of new hybrid families of apple (Malus Mill.) for presence of DNA-marker of Vf gene providing resistance to scab (Venturia inaequalis)
Pikunova A.V., candidate of biological sciences
Sedov E.N., doctor of agricultural sciences, academician of Russian Academy of Science
Serova Z.M., candidate of agricultural sciences Dolzhikova M.A., bachelor
Russian research institute of fruit crop breeding, Orel, Russia, pikuanna84@mail.ru Abstract
Scab (Venturia inaequalis) is one of the most harmful pathogen of apple (Malus Mill.). Now days, methods based on analysis of DNA polymorphism and able to detect genotypes carrying resistant genes with high accuracy and on the early stages of ontogenesis are developed to help breeder. In this paper results of new apple hybrid families screening for presence of DNA-marker of Vf gene are presented. Ninety four hybrids from 3 families were tested. Hybrids amplifying DNA-marker of Vf were identified. Marker-assisted selection methods will help to increase efficiency of breeding.
Key words: DNA-markers, Marker-assisted selection, apple, hybrids, scab
Введение
Во ВНИИСПК долгие годы ведется селекция яблони (Malus Mill.) на устойчивость к парше(Venturia inaequalis) (Седов и др., 2011). В настоящее время, ген Vf, пожалуй, самый востребованный ген в селекции яблони на устойчивость к парше. В связи с этим он хорошо изучен с помощью молекулярно генетических методов. Ген Vf был клонирован, и на данный момент разработан целый ряд ДНК маркеров, различных типов для его детекции: есть SNP, SCAR, CAPS и другие типы маркеров (Tartarini et al., 1999, Vinatzer et al., 2004, Afunian et al., 2004, Jansch et al., 2015 и др.).
Для детекции наличия гена (независимо от гомо- или гетерозиготности) достаточно данных доминантного ДНК-маркера. Например, анализа полиморфизма рецептор подобных генов,
амплифицируемых VfC праймерами. Это доминантный маркер, разработанный АШап et а1. (2004) и позволяющий сравнительно быстро выявить присутствие VI гена, используя разделение фрагментов путем электрофореза в агарозном геле. Этот маркер успешно прошел валидацию на отечественном материале (Ульяновская и др. 2011, Шамшин и др. 2011) и в настоящее время используется в целях маркер-вспомогательного отбора гибридов в школке сеянцев во ВНИИСПК.
В данной статье описаны результаты ДНК-генотипирования нового гибридного фонда яблони.
Материалы и методика
Выделение ДНК проводили из свежесобранных или замороженных молодых листьев СТАВ методом (www.DiversityArrays.com). Всего 94 гибридных сеянца из 3 гибридных семей были протестированы на наличие ДНК-маркера (таблица).
Последовательности праймеров и ПЦР условия были описаны у АШап et а1. (2004), с небольшими изменениями. Детекцию ПЦР продуктов осуществляли путем разделения в 1,7 % агарозном геле.
Результаты и их обсуждение
Исходя из задач селекции на устойчивость к парше, наибольшее внимание при молекулярно-генетическом изучении уделялось нами детекции гена VI. Всего 94 гибридных сеянца из 3 гибридных семей были протестированы на наличие VfС ДНК-маркера гена VI. Сводная таблица результатов анализа представлена ниже (Таблица).
Таблица - Результаты молекулярно-генетического анализа гибридов на наличие ДНК-маркера гена VI.
Номер семьи (схема скрещивания) F1, шт Маркер гена Vf (амплификация с VfC праймерами), (% от общего числа гибридов семьи)
6350 (Восторг х 13-6-106 (сеянец Суворовца) 4х) 29 15 (52%)
6351 (Созвездие х 30-47-88 4х) 49 31 (63%)
6352 (Созвездие х 25-37-45 4х) 16 9 (56%)
Продукты амплификация с VfC праймерами представлены на рисунке.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Рисунок - Фрагмент электрофореграммы продуктов амплификации с VfC праймерами в 1,7 % агарозном геле: м.м. - маркер молекулярного веса DNA MW Ledder M100 (Dialat Ltd.), размеры фрагментов снизу вверх-100 п.н., 200 п.н., 300 п.н., 400 п.н., 500 п.н., 600 п.н., 700 п.н., 800 п.н., 900 п.н., 1000 п.н.; стрелкой указаны фрагменты размером 286 п.н., свидетельствующие о присутствии VfC маркера гена Vf.
Всего проанализированно 94 гибрида из трех гибридных семей, из них 53 амплифицировали VfC-маркер гена Vf.
Семьи 6350, 6351, 6352, вошедшие в наши исследования, получены от ортологических скрещиваний между диплоидной материнской формой и тетраплоидной отцовской формой.
В семье 6350, полученной от скрещивания по схеме Восторг х 13-6-106 (сеянец Суворовца) всего проанализировано 29 гибридов, из них 15 имеют VfC маркер гена Vf, а остальные нет. В данной семье только один из родителей имеет ген Vf в гетерозиготной форме - это сорт Восторг (Vfvf). Теоретическое расщепление в потомстве от этого сорта, при скрещивании с диплоидной формой без гена Vf, должно составить 1:1, то есть половина потомства должна унаследовать ген. Наблюдаемое расщепление, несмотря на использование тетраплоидной отцовской формы, соответствует расщеплению 1:1 (у 15 гибридов ДНК-маркер гена Vf присутствует, у 14 - нет).
В семье 6351, полученной от скрещивания Созвездие х 30-47-88 4х, было отобрано и изучено 49 образцов, 31 из которых имеет искомый маркер гена Vf. В данной семье оба родителя имеют ген Vf, в связи с чем, процент потомства с геном повышается. Составить конкретное теоритическое ожидание расщепления от ортологических скрещиваний затруднительно, в связи со слабо изученным и формоспецифическим формированием гамет у тетраплоидных форм, которые образуют как диплоидную так и гаплоидную пыльцу, при этом часть пыльцы может быть нежизнеспособна (Седов и др., 2008). В наших исследованиях, расщепление составило 1,6:1, что превышает теоретически ожидаемое соотношение при анализирующем скрещивании, когда только один из родителей имеет ген в гетерозиготе, но менее, чем при скрещивании двух гетерозиготных диплоидных форм (3:1).
В семье 6352, полученной от скрещивания Созвездие х 25-37-45 4х, проанализировано 16 гибридов, из которых у 7 был обнаружен Vrc маркер гена Vf, а у 9 - нет.
Не соответствие наблюдаемого расщепления и теоритического так же может быть связано, во-первых, с небольшими размерами семей. Во-вторых, гибриды уже прошли первичную отбраковку по ряду признаков (в т.ч. карликовому габитусу, определенным морфологическим признакам одомашнивания, таким как крупный размер листьев, толщина листовой пластинки и др., устойчивости к некоторым болезням и вредителям, например, тлям и мучнистой росе - сильно восприимчивые генотипы могут проявить себя уже в школке сеянцев). Отдельным, на данный момент слабо изученным, фактором, являются особенности формирования генотипов от ортологических (разноплоидных) скрещиваний (Седов и др., 2014).
Заключение
В статье изложены результаты ДНК-генотипирования нового гибридного фонда яблони ВНИИСПК на присутствие Vrc ДНК-маркера гена устойчивости к парше Vf. Полученная информация о наличии у гибридов ДНК маркеров гена Vf поможет селекционеру отобрать лучшие генотипы для переноса в селекционный сад, сэкономить ресурсы и площади не выращивая неперспективные сеянцы.
Литература
1. Седов Е.Н., Седышева Г.А., Серова З.М. Селекция яблони на полиплоидном уровне. Орел: ВНИИСПК, 2008, 368с.
2. Седов Е.Н., Седышева Г.А., Серова З.М., Горбачева Н.Г. Самоплодность полиплоидных сортов и форм яблони // Доклады РАСХН. №3. 2014. С. 21-23.
3. Седов Е.Н.Инновации в изменении генома яблони. Новые перспективы в селекции. Монография./ Под общей редакцией академика РАН Е.Н. Седова.- Орел: ВНИИСПК, 2015. - 336 с.
4. Ульяновская Е. В. и др. Ускоренное создание иммунных к парше сортов яблони с использованием молекулярно-генетических методов исследования / ЕВ Ульяновская, ИИ Супрун, ЕН Седов, ГА Седышева, ЗМ Серова. -Краснодар, 2011.
5. Шамшин, И., Савельев, Н., Кудрявцев, А. Применение молекулярных маркеров для идентификации генотипов яблони с геном устойчивости к парше. плодоводство и ягодоводство России, 2011, - 26, с. 126-129.
6. Afunian, M.R., Goodwin P.H., Hunter D.M. Linkage Vfa4 in Malus domestica and Malus floribunda with Vf resistance to the apple scab pathogen Venturia inaequalis// Plant Pathology. 2004, - p.467.
7. Diversity Arrays Technology P/L (DArT) (www.DiversityArrays.com)
8. Jansch, M., Broggini, G. A., Weger, J., Bus, V. G., Gardiner, S. E., Bassett, H., & Patocchi, A.. Identification of SNPs linked to eight apple disease resistance loci// Molecular Breeding. - 2015.- 35 (1) , p.1-21.
9. Tartarini, S. Development of reliable PCR markers for the selection of the Vf gene conferring scab resistance in apple / S. Tartarini, L. Gianfranceschi, S. Sansavini, C. Gessler // Plant Breeding. -1999 - V. 118.- p. 183-186.
10. Vinatzer, B. A. et al. Apple contains receptor-like genes homologous to the Cladosporium fulvum resistance gene family of tomato with a cluster of genes cosegregating with Vf apple scab resistance //Molecular Plant-Microbe Interactions.— 2001.- Т. 14. - №. 4 - p. 508-515.
