МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ФИБРОЗА ПРИ ПОСТИНФАРКТНОМ РЕМОДЕЛИРОВАНИИ МИОКАРДА

Барбараш О.Л.; Кутихин А.Г.; Печерина Т.Б.; Тарасов Р.С.; Кашталап В.В.; Федорова Н.В.; Богданов Л.А.; Хрячкова О.Н.; Седых Д.Ю.

https://doi.org/10.23946/2500-0764-2022-7-1-17-30

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ФИБРОЗА ПРИ ПОСТИНФАРКТНОМ РЕМОДЕЛИРОВАНИИ МИОКАРДА

БАРБАРАШ О.Л., КУТИХИН А.Г., ПЕЧЕРИНА Т.Б.*, ТАРАСОВ Р.С., КАШТАЛАП В.В., ФЕДОРОВА Н.В., БОГДАНОВ Л.А., ХРЯЧКОВА О.Н., СЕДЫХ Д.Ю.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», г. Кемерово, Россия

Резюме

Несмотря на высокую распространенность и клиническую значимость фиброза миокарда, молекулярно-генетические факторы его реализации в постинфарктном периоде остаются предметом дискуссий.

Цель. Выявление молекулярных маркеров фиброза миокарда при его постинфарктном ре-моделировании.

Материалы и методы. При проведении плановой коронаровентрикулографии выполнялась эндомиокардиальная биопсия миокарда пораженных и интактных областей межжелудочковой перегородки со стороны правого желудочка 7 пациентов с перенесенным передним распространенным инфарктом миокарда. Получены биоптаты фиброзированного и прилежащего здорового миокарда, которые были механически разделены на два равных сегмента и подвергнуты: 1) гомогенизации с последующим выделением РНК, синтезом кД-НК и анализом генной экспрессии при помощи количественной полимеразной цепной реакции; 2) фиксации в формалине и заключению в парафин с дальнейшим окрашиванием по ван Гизону для гистологической верификации фиброза.

Результаты. Обнаружено, что экспрессия генов ACTA2, VIM, CTGF, COL1A1, TGFB1, TGFBR1, AGTR1, CCL2 и TNF в фиброзирован-ном миокарде более чем в три раза выше, чем в прилежащем здоровом миокарде, что может отражать активный синтез белков экстрацел-

люлярного матрикса миофибробластами, дифференцирующимися из синтетически неактивных фибробластов в процессе развития фиброза миокарда, который сопровождается асептическим воспалением.

Заключение. Впервые показано, что гены AGTR1, CCL2 и TNF могут быть вовлечены в развитие фиброза у пациентов после перенесенного инфаркта миокарда; подтверждена значимость генов ACTA2, VIM, CTGF, COL1A1, TGFB1 и TGFBR1 для этого патологического процесса.

Ключевые слова: инфаркт миокарда, фиброз миокарда, молекулярные маркеры, гены AGTR1, CCL2, TNF.

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования

Исследование выполнено в рамках фундаментальной темы НИР НИИ КПССЗ № 04192022-0002 (период выполнения 2022-2026 гг.) «Разработка инновационных моделей управления риском развития болезней системы кровообращения с учетом коморбидности на основе изучения фундаментальных, клинических, эпидемиологических механизмов и организационных технологий медицинской помощи в условиях промышленного региона Сибири» (научный руководитель - член-корреспондент РАН О.Л. Барбараш), № госрегистрации 122012000364-5 от 20.01.2022 г.

Для цитирования:

Барбараш О.Л., Кутихин А.Г., Печерина Т.Б., Тарасов Р.С., Кашталап В.В., Федорова Н.В., Богданов Л.А., Хрячкова О.Н., Седых Д.Ю. Молекулярные маркеры фиброза при постинфарктном ремоделировании миокарда. Фундаментальная и клиническая медицина. 2022;7(1): 17-30. https://doi.org/10.23946/2500-0764-2022-7-l-17-30

*Корреспонденцию адресовать:

Печерина Тамара Борзалиевна, 650002, Россия, г. Кемерово, б-р Сосновый, д. 6, E-mail: tb.pechorina@gmail.com © Барбараш О.Л. и др.

ORIGINAL RESEARCH

MOLECULAR MARKERS OF CARDIAC FIBROSIS AFTER MYOCARDIAL INFARCTION

Olga L. Barbarash, Anton G. Kutikhin, Tamara B. Pecherina *, Roman S. Tarasov, Vasiliy V. Kashtalap, Natalia V. Fedorova , Leo A. Bogdanov, Oksana N. Hryachkova, Darja Yu. Sedykh

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation

English ► Abstract

Aim. To perform a screening for molecular markers of cardiac fibrosis upon myocardial infarction.

Materials and Methods. We carried out echo-cardiography-guided endomyocardial biopsy of affected and intact interventricular septum segments of 7 patients with anterior myocardial infarction. Fibrotic and adjacent intact cardiac tissue was dissected into 2 equal segments and: 1) homogenised with the further RNA extraction, reverse transcription, and quantitative polymerase chain reaction; 2) fixed in formalin and embedded into paraffin with the further van Gieson staining for the histological verification of cardiac fibrosis.

Results. We found that the expression of AC-TA2, VIM, CTGF, COL1A1, TGFB1, TGFBR1, AGTR1, CCL2 and TNF genes in fibrotic cardiac tissue was > 3-fold higher as compared with the adjacent intact myocardium reflective of active ex-

tracellular matrix production by fibroblast-derived myofibroblasts.

Conclusion. We have for the first time shown AGTR1, CCL2, and TNF genes as candidates for post-infarction cardiac fibrosis in addition to AC-TA2, VIM, CTGF, COL1A1, TGFB1, and TGFBR1 genes.

Keywords: myocardial infarction, cardiac fibrosis, molecular markers, AGTR1, CCL2, TNF.

Conflict of Interest

None declared.

Funding

This research was funded by the Complex Program of Basic Research under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences within the Basic Research Topic of Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases № 04192022-0002 "Development of innovative models for management of cardiovascular disease risk factors and comorbid conditions".

For citation:

Olga L. Barbarash, Anton G. Kutikhin, Tamara B. Pecherina, Roman S. Tarasov, Vasiliy V. Kashtalap, Natalia V. Fedorova, Leo A. Bogdanov, Oksana N. Hryachkova, Darja Yu. Sedykh. Molecular markers of cardiac fibrosis after myocardial infarction. Fundamental and Clinical Medicine. 2022;7(1): 17-30. https://doi.org/10.23946/2500-0764-2022-7-1-17-30

**Corresponding author:

Dr. Tamara B. Pecherina, 6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation , E-mail: tb.pechorina@gmail.com © Olga L. Barbarash, et al.

Введение

Хроническая сердечная недостаточность (ХСН), представляющая собой основное осложнение ишемической болезни сердца (в том числе инфаркта миокарда (ИМ)), характеризуется развитием прогрессирующего интерсти-циального фиброза миокарда, приводящего к снижению эластичности, сократимости и электрической проводимости сердечной мышцы [1, 2]. Несмотря на достигнутые успехи в лечении, ХСН остается ведущей причиной смерти от сердечно-сосудистых заболеваний [1, 3]. Поскольку постинфарктный фиброз миокарда

является одной из основных причин, обусловливающих тяжесть ХСН после ИМ [1, 2], представляется актуальным изучение его патогенетических маркеров. Фибротическое ремодели-рование миокарда характеризуется избыточным отложением белков экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) сердечными фибробластами [4-6]. Повышение плотности и, соответственно, ригидности ЭЦМ снижает сократительную способность миокарда и ускоряет прогрессиро-вание ХСН [7]. Наряду со снижением сократимости фиброз миокарда также может нарушать электрическое сцепление кардиомиоцитов пу-

тем их разделения избыточным синтезом белков ЭЦМ [1, 2, 5]. Кроме того, фиброз миокарда приводит к снижению плотности капилляров и развитию хронической тканевой гипоксии кар-диомиоцитов, что постепенно приводит к их гибели [1, 2, 5]. Важно отметить, что фиброз миокарда коррелирует не только с тяжестью ХСН, но и с риском развития жизнеугрожающих нарушений ритма и проводимости, повышая частоту внезапной сердечной смерти [8]. Особый интерес представляет поиск молекулярно-гене-тических факторов постинфарктного фиброза миокарда, поскольку это имеет непосредственную ценность для диагностики тяжести ХСН [9, 10], а также будет способствовать разработке антифибротических препаратов [11, 12]. Несмотря на первоначальные ожидания [13], лучевые диагностические маркеры фиброза и ре-моделирования миокарда не показали более высокой эффективности при оценке риска у пациентов с ХСН по сравнению с молекулярными [14, 15].

ИМ сопровождается некрозом участка мышечной ткани сердца с последующим развитием соединительной ткани (очаговый постинфарктный фиброз), формирующейся вследствие низкого регенеративного потенциала миокарда [1, 2]. Кроме того, к диффузному фиброзу миокарда могут приводить и первичные факторы риска ишемической болезни сердца, такие как артериальная гипертензия, сахарный диабет и метаболический синдром [5, 16]. В норме сердечные фибробласты поддерживают гомеостаз ЭЦМ, который обеспечивает структурную основу для кардиомиоцитов, распределяет механические силы по сердечной ткани и проводит электрический потенциал [17, 18]. Однако по сравнению с другими органами сердце обладает малым регенеративным потенциалом, в связи с чем процессы репарации сердечной ткани при ишемии заключаются в распаде и поглощении подвергшихся некрозу кардиомиоцитов, после чего следует образование патологической фиброзной ткани сердечными фибробластами для сохранения структуры и предотвращения разрыва миокарда [1, 2, 5]. При этом фибробласты дифференцируются в миофибробласты для ускоренной секреции белков ЭЦМ [1, 2, 5]. Таким образом, как первичный, так и постинфарктный фиброз миокарда характеризуется избыточным отложением ЭЦМ, синтезируемого сердечными фи-бробластами, что ускоряет прогрессирование

ХСН [1, 2, 5]. Ремоделирование и фиброз являются неизбежными компенсаторно-приспособительными процессами восстановления миокарда в ответ на некроз. Предполагается, что за развитие постинфарктного фиброза миокарда может быть в значительной степени ответственен путь трансформирующего фактора ро-ста-в (TGF-P), который действует через соответствующие рецепторы (TGFBR1, TGFBR2 и TGFBR3) и транскрипционные факторы семейства SMAD (SMAD2, SMAD3 и SMAD4) и запускает дифференцировку фибробластов в миофибробласты, усиливая их синтетическую активность [19]. Дифференцировка фибробла-стов в миофибробласты отражается усилением экспрессии альфа-гладкомышечного актина в дополнение к маркеру клеток мезенхималь-ного ряда виментину [20]. Кроме того, TGF-P также способен индуцировать синтез TGF-P-активируемой киназы 1 (ТАК1/МАР3К7) и р38-семейства митоген-активируемых протеинки-наз (МАРК11, МАРК12, МАРК13, МАРК14), которые способствуют апоптозу кардиомиоци-тов и синтезу сердечными фибробластами белков ЭЦМ [21]. Синтетическая активность сердечных миофибробластов регулируется мощными вазоконстрикторами адреналином, ан-гиотензином II и эндотелином-1 (EDN1) через соответствующие рецепторы (ADRB2, AGTR1, EDNRA, EDNRB) [22-26], G-белок-связанные рецепторы [27] и транскрипционные факторы миокардин-ассоциированный транскрипционный фактор А (MRTF-A) и фактор сывороточного ответа (SRF) [28, 29]. Свой вклад в развитие фиброза миокарда вносят и секретируемые сердечными фибробластами медиаторы воспаления, такие как моноцитарный хемоаттрак-тантный белок (МСР-1/С^2), фактор некроза опухоли-а (Т№-а), интерлейкин-1в (ГЬ1В) и интерлейкин-6 (ЕЬ6), которые стимулируют их пролиферацию и синтез белков ЭЦМ в ауто-кринной и паракринной манере [30-34]. Синтетический профиль сердечных фибробластов отражается синтезом и секрецией фактора роста соединительной ткани (CTGF) [35], семейства фактора роста тромбоцитов (PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD) [36], коллагена I типа [37, 38] и фибронектина [38]. В целом можно предположить, что открытие патогенетических и диагностических маркеров, объективно отражающих развитие фиброза миокарда, могло бы способствовать разработке таргетной терапии для лечения данной патологии [11, 12].

Цель исследования

Выявление молекулярно-генетических маркеров фиброза миокарда при его постинфарктном ремоделировании.

Материалы и методы

Пациенты

В исследование были включены 7 пациентов с ранее перенесенным ИМ передней стенки левого желудочка, госпитализированных в НИИ КПССЗ для выполнения плановой коро-наровентрикулографии (КВГ) с целью уточнения показаний к хирургической реваскуляриза-ции миокарда. Согласно рекомендациям Американской ассоциации сердца, Американского общества по лечению ХСН и Европейского общества кардиологов [39], предварительно у всех пациентов были определены клинические показания к выполнению эндомиокардиальной биопсии миокарда (ЭБМ). Основные показания для проведения ЭМБ: дифференциальный диагноз с дилятационной кардиомиопатией; невозможность клинически исключить идеопатиче-ские нарушения ритма и проводимости; дифференциальный диагноз с гипертрофической кардиомиопатией; а также быстро прогрессирующая застойная сердечная недостаточность.

Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен объединенным локальным этическим комитетом учреждения. Все пациенты подписывали информированное согласие на проведение ЭБМ в качестве исследования.

Все пациенты были мужского пола (средний возраст 59,7 ± 9,04 лет) и ранее перенесли эффективное чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) со стентированием инфаркт-зависимой коронарной артерии. Всем больным проводилась трансторакальная эхо-кардиография (ЭХО-КГ) на аппарате экспертного класса с визуализацией зон акинезии (Sonos 2500, Hewlett Packard). По данным ЭХО-КГ у всех больных отмечались признаки сформировавшейся постинфарктной аневризмы левого желудочка с систолической дисфункцией миокарда в виде промежуточного снижения показателя фракции выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ) до 49,3 ± 4,59%. В анамнезе пациентов имелись указания на наличие нарушений липидного обмена - у 4 (57,14%), артериальной гипертензии - у 6 (85,71%), са-

харного диабета 2-го типа - у 2 (28,57%), не-стенозирующего церебрального атеросклероза - у 6 (85,71%), ожирения по индексу массы тела - у 4 (54,14%), желудочковой экстрасисто-лии 3 градации по Лауну - у 2 (28,57%). Клинические признаки стенокардии в пределах 2-го функционального класса по Канадской классификации были определены у 2 (28,57%) пациентов, проявления ХСН 1-2 класса по Нью-Йоркской классификации наблюдались у 6 (85,71%) больных. Все пациенты принимали антиагреганты, бета-блокаторы, статины, бло-каторы ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС). Двое пациентов с сахарным диабетом 2-го типа регулярно принимали пе-роральную гипогликемическую терапию. При проведении КВГ в рамках плановой госпитализации в НИИ КПССЗ зоны гипо- и акинезии миокарда регистрировались лишь у 2 (28,57%) пациентов, рестеноз в области ранее установленных стентов был выявлен у 1 (14,28%) больного и не достигал 40%, у 4 (54,14%) других пациентов были выявлены значимые поражения коронарного русла в другом сосудистом бассейне.

Эндомиокардиальная биопсия

У всех пациентов забирались образцы фи-брозированного миокарда посредством ЭБМ в области передней или передне-верхушечной области ЛЖ после предварительно выполненной левой вентрикулографии с визуализацией контуров ЛЖ в систолу и диастолу, исключения внутрижелудочкового тромбоза и подтверждения акинеза соответствующей локализации для прицельной ЭБМ фиброзированного миокарда. Образцы условно интактного миокарда (без фибротических изменений) были получены путем ЭБМ правого желудочка (ПЖ). Процедура ЭБМ выполнялась в условиях катетеризацион-ной лаборатории, оснащенной ангиографиче-ской установкой Innova 2100 (General Electric). Оценка гемодинамических параметров и электрокардиографический контроль осуществлялся при помощи физиологической станции Solar (General Electric). Использовали местную анестезию (новокаин, лидокаин или бупивакаин), мониторинг ЭКГ, артериального давления, сатурации кислорода, флюороскопический контроль. Умеренной гипокоагуляции достигали путем внутривенного введения нефракциони-рованного гепарина в дозе 25-30 международных единиц (МЕ) на 1 кг массы тела пациента (в среднем 2,0-2,5 тыс. МЕ).

Для ЭБМ ЛЖ использовали доступ через правую общую бедренную артерию (ОБА). После анестезии и пункции в ОБА по проводнику устанавливали интродьюсер 10 F. После выполнения левой вентрикулографии в правой косой проекции под углом 45-60 градусов через катетер pig-tail 6 F с объемом рентгенконтраст-ного вещества 30-40 мл при скорости введения 15-20 мл/сек., биоптом Cordis Bipal 7 длиной 104 см (Cordis) заводили в ЛЖ по проводниковому катетеру, которым в свою очередь катетеризировали ЛЖ с использованием катетера pigtail 6 F на проводнике 0,035''. При выходе из доставляющего катетера в свободную полость ЛЖ режущие чашечки биоптома открывали на небольшом расстоянии от миокарда ЛЖ. Далее продвигали биоптом до соприкосновения его режущих чашечек с миокардом ЛЖ. После этого приводили биоптом в закрытое состояние, что позволяло фиксировать биоптат внутри чашечек биоптома. Биоптом в закрытом состоянии заводили в систему доставки и выводили наружу, после чего биоптат удаляли из чашечек биоптома при помощи иглы и помещали в пробирку. Для исследования последовательно забирали от 2 до 4 фрагментов ЛЖ.

Для ЭБМ ПЖ использовали доступ через правую общую бедренную вену (ОБВ). После анестезии и пункции в ОБВ по проводнику устанавливали интродьюсер 10 F. В качестве биоптома использовали гибкий биоптом Cordis Bipal 7 длиной 104 см (Cordis). Данный биоп-том заводили в ПЖ по проводниковому катетеру, которым в свою очередь катетеризировали ПЖ с использованием катетера pig-tail 6 F на проводнике 0,035''. Методология взятия образцов из ПЖ существенно не отличалась от таковой при биопсии миокарда ЛЖ, которая была описана выше. Для исследования последовательно забирали от 2 до 4 фрагментов ПЖ.

После завершения процедуры ЭБМ интро-дьюсеры из ОБА и ОБВ удаляли, осуществляли компрессионный гемостаз в области пункции в течение 10-15 минут, после чего накладывали давящую повязку на срок от 12 до 24 часов, предписывая строгий постельный режим для пациента и не компрометируя кровоток в конечности. В течение всего времени выполнения процедуры ЭБМ, гемостаза и последующего наблюдения у пациентов тщательно монито-рировали гемодинамику. При подозрении на ге-мотампонаду в экстренном порядке выполняли ЭХО-КГ.

Гистологическая верификация фиброза миокарда и пробоподготовка образцов миокарда к анализу генной экспрессии

После ЭБМ (пораженные и интактные области межжелудочковой перегородки со стороны правого желудочка) 7 пациентов, перенесших передний распространенный ИМ, биоптаты фиброзированного и прилежащего интактно-го миокарда (всего 14 биоптатов, по 7 в каждой группе) были механически разделены на два равных сегмента: один для гистологической верификации фиброза миокарда и один для анализа генной экспрессии. Таким образом, особенности генной экспрессии в фиброзирован-ном и нормальном миокарде были изучены на тканях, забранных у одних и тех же пациентов, что позволило исключить индивидуальные различия между пациентами в развитии постинфарктного фиброза миокарда. Гистологическая верификация фиброза миокарда проводилась при помощи окрашивания по ван Гизону после фиксации биоптатов в формалине и заключения в парафин по стандартной методике.

Для анализа различий в генной экспрессии между фиброзированным и здоровым миокардом соответствующие сегменты биоптатов были гомогенизированы (гомогенизатор Fast-Prep-24, MP Biomedicals) с последующим выделением РНК из гомогенатов согласно классической методике (TRI Reagent, каталожный номер T9424, Sigma) и обратной транскрипцией для синтеза кДНК (термоциклер Veriti, Applied Biosystems, набор High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, каталожный номер 4368814, Applied Biosystems). Количественная оценка и контроль качества выделенных нуклеиновых кислот проводились при помощи спектрофото-метрии на приборе NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).

Анализ генной экспрессии

В соответствии с основными звеньями патогенеза постинфарктного фиброза миокарда в фиброзированном и прилежащем здоровом миокарде методом количественной поли-меразной цепной реакции была оценена экспрессия следующих генов: TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, SMAD2, SMAD3, SMAD4, MAP3K7, MAPK11, MAPK12, MAPK13, MAPK14 (сигнальный путь TGF-ß), PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PDGFRA, PDGFRB (семейство факторов роста тромбоцитов и их рецепторов), CTGF, COL1A1, COL1A2, FN1 (маркеры активности синтеза ЭЦМ), AC-

TA2, VIM (маркеры миофибробластов), ADRB2, AGTR1, EDN1, EDNRA, EDNRB, RHOA, GRK2, ARRB1, ARRB2, MKL1, SRF (вазоконстрикторы и связанные с ними рецепторы и транскрипционные факторы), CCL2, TNF, IL1B, IL6, TNFR1, IL1R1, IL1R2, IL6R (медиаторы воспаления и их рецепторы).

количественная полимеразная цепная реакция проводилась в соответствии с протоколом производителя мастер-микса (PowerUp SYBR Green Master Mix, каталожный номер A25777, Applied Biosystems) на приборе ViiA 7 (Applied Biosystems) в трех повторах для каждого образца. Праймеры для количественной полимераз-ной цепной реакции были разработаны в программе Primer-BLAST (National Institutes of Health) с использованием следующих параметров: длина ПЦР-продукта - от 70 до 150 пар оснований, температура плавления праймеров - от 59 до 65°С с различием между праймера-ми не более 3°С, включение интрона с длиной не менее 200 пар оснований - обязательно, длина праймера - от 18 до 22 нуклеотидов, содержание гуанина и цитозина в праймерах - от 40 до б0%, максимальная длина повтора одного и того же нуклеотида подряд - 4, максимальное содержание гуанина и цитозина на З'-конце -не более 3 (б0%), максимальная комплементар-ность праймеров - не более 5 условных единиц. Все остальные параметры программы соответствовали настройкам по умолчанию. Выбирались исключительно пары праймеров, специфичные к гену интереса.

После разработки праймеров производился контроль их качества в программах PCR Primer Stats (Sequence Manipulation Suite, www.bio-informatics.org) и Multiple Sequence Analyzer (Thermo Scientific Web Tools) на стандартных настройках. В случае обнаружения вероятных димеров разрабатывалась новая пара прайме-ров (до исключения всех возможных димеров). Синтез разработанных праймеров проводился в компании Евроген (г. Москва).

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных и их графическое представление выполняли при помощи программ Microsoft Excel (Microsoft Corporation) и GraphPad Prism 7 (GraphPad Software). В качестве референсных генов были выбраны гены GAPDH, ACTB и B2M. Уровень экспрессии генов в фиброзиро-ванном миокарде рассчитывался при помощи 2-ААа-метода (поправка на экспрессию генов «до-

машнего хозяйства» и экспрессию гена интереса в прилежащем здоровом миокарде). Такой подход позволил определить гены-кандидаты развития фиброза миокарда (гены, экспрессия которых высока и различается не менее чем в три раза между фиброзированным и прилежащим нормальным миокардом). Данные анализа генной экспрессии (кратность изменения в фи-брозированном миокарде в сравнении с прилежащим здоровым) были представлены на графиках в виде среднего и стандартного отклонения от среднего.

Результаты

Методологические подходы к диагностике постинфарктного фиброза миокарда многогранны и включают в себя как лучевые методы, так и гистологическую верификацию при ЭБМ, включающую сравнение содержания отложений коллагена в сегментах миокарда с предполагаемым фиброзом (в частности, при помощи окрашивания по ван Гизону). На рисунке 1 представлена такая верификация применительно к данному исследованию (выбрано 4 репрезентативных пациента из 7).

Важной задачей изучения прогрессирова-ния постинфарктного фиброза миокарда, необходимой для выявления его патогенетических, терапевтических и прогностических маркеров, является определение информативных молекул-кандидатов, дифференциально экспрес-сированных на генном или белковом уровнях между миокардом, фиброзированным вследствие ИМ, и прилежащим здоровым миокардом. При исследовании молекулярных путей, ответственных за избыточный синтез ЭЦМ (путь TGF-в и путь тромбоцитарного фактора роста (PDGF), а также при измерении экспрессии собственно белков ЭЦМ и маркеров мио-фибробластов было обнаружено, что экспрессия гена трансформирующего фактора роста (TGFB1) и его рецептора (TGFBR1), а также генов фактора роста соединительной ткани (CT-GF), коллагена I типа (COL1A1), альфа-актина гладких мышц (ACTA2) и виментина (VIM) в фиброзированном миокарде более чем в три раза выше, чем в прилежащем здоровом миокарде (рисунок 2). Таким образом, была выявлена экспрессия как генов, запускающих переход неактивных фибробластов в синтетически активные миофибробласты, так и собственно генов компонентов ЭЦМ (коллаген I типа, фактор роста соединительной ткани) и маркеров

Гистологическим анализ фиброза миокарда, окрашивание по ван Гизону, ув. х200. Сиреневые участки (сверху) отражают отложения коллагена, характерные для постинфарктного фиброза.

Histological analysis of cardiac fibrosis. Van Gieson staining, x200 magnification. Purple colour indicates collagen deposition.

Рисунок 2.

Анализ уровня экспрессии генов интереса (путь ТСР-р, путь факторов роста тромбоцитов, маркеры активности синтеза ЭЦМ, маркеры миофибробластов) в фиброзированном миокарде, расчет по 2-ма-методу (поправка на экспрессию генов «домашнего хозяйства» и экспрессию гена интереса в прилежащем здоровом миокарде). Серые пунктирные линии отражают значимые различия между фиброзированным и прилежащим здоровым миокардом (кратность изменения > 3 или < 0,33). ТСР-р - трансформирующий фактор роста бета, РРСР - тромбоцитарный фактор роста, ЭЦМ -экстрацеллюлярный матрикс, МФ - миофибробласты.

Figure 2.

Gene expression profiling (TGF-p pathway, platelet-derived growth factor pathway, production of the extracellular matrix, myofibroblast markers) in the fibrotic cardiac tissue. Calculation was performed using 2-MCt method (adjustments for the expression of housekeeping genes and the gene of interest in the adjacent intact myocardium). Gray dotted lines reflect significant differences between the fibrotic and adjacent intact myocardium (fold change > 3 or s 0,33). TGF-p - transforming growth factor beta, PDGF - platelet-derived growth factor.

Рисунок 3.

Анализ уровня экспрессии генов интереса (вазоконстрикторы и ассоциированные транскрипционные факторы, Са2*-канал Т1*РС6, цитокины и их рецепторы) в фиброзированном миокарде, расчет по 2-ма-методу (поправка на экспрессию генов «домашнего хозяйства» и экспрессию гена интереса в прилежащем здоровом миокарде). Серые пунктирные линии отражают значимые различия между фиброзированным и прилежащим здоровым миокардом (кратность изменения > 3 или < 0,33). ТФ -транскрипционные факторы.

Figure 3.

Gene expression profiling (vasoconstrictors and associated transcription factors, Ca2*-channel TRPC6, cytokines and their receptors) in the fi-brotic cardiac tissue. Calculation was performed using 2-MCt method (adjustments for the expression of housekeeping genes and the gene of interest in the adjacent intact myocardium). Gray dotted lines reflect significant differences between the fibrotic and adjacent intact myocardium (fold change > 3 or s 0,33).

миофибробластной дифференцировки (гены альфа-актина гладких мышц и виментина, который также косвенно свидетельствует о синтетическом фенотипе фибробластов).

Далее в фиброзированном вследствие ИМ и прилежащем здоровом миокарде была измерена экспрессия генов, кодирующих сосудосуживающие молекулы (вазоконстрикторы) и ассоциированные с их действием транскрипционные факторы, а также цитокины и их рецепторы, поскольку данные пути напрямую не вызывают дифференцировку фибробластов по синтетическому фенотипу, однако могут способствовать избыточному синтезу ЭЦМ уже активированными фибробластами. В результате было обнаружено, что ген рецептора 1 типа к ангиотензину II (AGTR1), а также ген моно-цитарного хемоаттрактантного белка (CCL2) и фактора некроза опухоли (TNF) также ги-перэкспрессированы более чем в три раза в фи-брозированном миокарде в сравнении с прилежащими интактными тканями (рисунок 3). В совокупности полученные результаты могут отражать активный синтез белков ЭЦМ миофи-бробластами, дифференцирующимися в процессе развития сопровождающегося воспалением фиброза из синтетически неактивных фи-бробластов.

Обсуждение

В данной работе были получены приоритетные данные о возможной роли генов AGTR1,

CCL2 и TNF в развитии фиброза миокарда у пациентов после ИМ, а также подтверждена значимость для этого патологического процесса генов ACTA2, VIM, CTGF, COL1A1, TGFB1 и TGFBR1, роль которых в развитии фиброза миокарда ранее была предположена в вышеуказанных экспериментальных исследованиях на животных моделях. Поэтому имеет смысл более детальный анализ литературы, касающейся участия генов AGTR1, CCL2 и TNF в развитии постинфарктного фиброза миокарда.

Ранее было показано, что применение гид-рохлортиазида у крыс с модельной ишемией миокарда в результате перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии повышает фракцию выброса левого желудочка, а также снижает выраженность фиброза миокарда и экспрессию как соответствующих генов, так и собственно ангиотензиновых рецепторов 1 типа к ангиотензину II, TGF-ß и транскрипционного фактора пути TGF-ß Smad2 в тканях сердца, при этом добавление ангиотензина II к культурам сердечных фи-бробластов крыс повышало уровень TGF-ß и Smad2 (что также частично блокировалось гидрохлортиазидом) [40]. Семидневное введение ангиотензина II вызывало гиперэкспрессию генов TNF, CCL2 и TGFB1 в сердце мышей, при этом провоспалительные факторы (TNF и CCL2) были экспрессированы на 1-й день после введения, а профибротиче-ские (TGFB1) - на 7-й [41].

При перегрузке левого желудочка, вызванного наложением стриктуры на аорту, было отмечено повышение уровня фактора некроза опухоли в сочетании с гибелью кардиомиоцитов, гипертрофией миокарда и повышением активности матриксной металлопротеиназы-9, при этом данные эффекты были значительно менее выражены у мышей с нокаутированным геном TNF [42]. Применение селективного рекомби-нантного ингибитора фактора некроза опухоли этанерсепта снижало дилатацию и гипертрофию левого желудочка у крыс с вызванной аор-токавальной фистулой перегрузкой желудочков вследствие блокирования деградации коллагена [43]. Аналогичные результаты были получены при внутривенном введении этанерсепта крысам с перевязанной коронарной артерией, в тканях миокарда которых наблюдалось снижение лейкоцитарной инфильтрации, активности кол-лагеназы и улучшение систолической и диасто-лической функций [44]. Наконец, увеличенное содержание фактора некроза опухоли в крови было ассоциировано с более высокой смертностью пациентов с ХСН как со сниженной, так и с сохранной функцией левого желудочка в течение 2-летнего периода наблюдения [45]. Считается, что фактор некроза опухоли способствует секреции матриксных металлопротеиназ активированными сердечными фибробластами и вызываемой данными ферментами деградации коллагена миокарда, что, в свою очередь, ведет к последующему его фиброзу из-за избыточного синтеза и патологически измененной сборки замещающего подобные дефекты коллагена [46, 47].

Аналогично фактору некроза опухоли, хемо-кин CCL2 (моноцитарный хемоаттрактантный белок-1) также способствует развитию фиброза миокарда. На модели краткосрочной, но регулярной ишемии и реперфузии мыши с нокаутированным геном CCL2 или блокадой данного белка соответствующим антителом характеризовались менее выраженным интерстициаль-ным фиброзом и более сохранной функцией желудочков, вероятно, вследствие меньшей инфильтрации миокарда макрофагами, хотя сам белок CCL2 не вызывал миофибробластной дифференцировки [48]. Направленное ингиби-рование транскрипции гена CCL2 при помощи генно-инженерного вектора после вызванного перевязкой коронарной артерии ИМ снижало выраженность интерстициального фиброза и инфильтрации миокарда макрофагами, со-

храняло функцию желудочков и также уменьшало экспрессию в пораженном миокарде фактора некроза опухоли и TGF-ß [49]. Нейтрализация MCP-1 соответствующим антителом ин-гибировала макрофагальную инфильтрацию, пролиферацию фибробластов и синтез TGF-ß и препятствовала развитию фиброза миокарда у крыс с частично перевязанной аортой [50]. Как и в случае с фактором некроза опухоли, увеличенная концентрация CCL2 в крови была ассоциирована с повышенной смертностью у пациентов с ХСН [51]. Следует отметить взаимную регуляцию указанных молекул, поскольку нокаут гена CCL2 также снижал экспрессию генов TNF и TGFB1 [30], а нокаут гена TNF снижал экспрессию гена CCL2 [52] у мышей с ИМ.

Таким образом, представленные результаты (гиперэкспрессия генов TGFB1, TGFBR1, CTGF, COL1A1, ACTA2, VIM, AGTR1, CCL2 и TNF) видятся достаточно логичными при их сопоставлении с данными литературы, учитывая, что генные пути TGF-ß, синтеза компонентов ЭЦМ, миофибробластной дифференцировки, пути ангиотензина II и пути провоспалитель-ной активации в той или иной степени потенцируют развитие друг друга. Идентифицированные гены-кандидаты свидетельствуют об активно идущей в фиброзированном миокарде миофибробластной дифференцировке (гиперэкспрессия генов ACTA2 и VIM) под воздействием трансформирующего фактора роста (гиперэкспрессия генов TGFB1 и TGFBR1), сопровождающейся активным синтезом ЭЦМ (гиперэкспрессия генов CTGF и COL1A1) и усугубляющейся в результате активации ангио-тензиновых рецепторов II типа (гиперэкспрессия гена AGTR1) и провоспалительных молекул (гиперэкспрессия генов CCL2 и TNF).

В качестве мишеней для лекарственных воздействий целесообразно рассматривать рецепторы 1 типа к ангиотензину II (поскольку они успешно таргетируются применяемыми в настоящее время в клинической практике сар-танами), а также провоспалительный хемокин CCL2, клинических испытаний ингибиторов которого применительно к фиброзу миокарда пока проведено не было. К сожалению, клинические испытания селективного ингибитора фактора некроза опухоли этанерсепта [53, 54] и моноклонального антитела к фактору некроза опухоли инфликсимаба [55] не продемонстрировали своей эффективности в терапии ХСН. В отношении относительно селек-

тивных ингибиторов TGF-в пирфенидона и траниласта результаты клинических испытаний по их эффективности у пациентов с ХСН опубликованы пока еще не были [56]. Что же касается маркеров миофибробластной диффе-ренцировки (ACTA2 и VIM), то сложно представить себе направленную на эти гены терапию, поскольку альфа-актин гладких мышц экспрессируется во всех сосудистых гладко-мышечных клетках, а виментин, несмотря на то, что является суррогатным маркером синтетического фенотипа, обильно представлен во всех клетках организма человека в качестве компонента цитоскелета. Аналогично ситуация обстоит и с коллагеном и фактором роста соединительной ткани (кодируемым геном CTGF), которые в норме являются важными компонентами ЭЦМ всех тканей и органов, хотя моноклональные антитела против фактора роста соединительной ткани достаточно эффективно улучшали функцию желудочков и снижали выраженность желудочковой гипертрофии и фиброза миокарда в эксперименте, также способствуя выживаемости мышей по-

сле индуцированного перевязкой коронарной артерии ИМ [57].

В целом можно предположить, что изучение молекулярных маркеров фиброза и их генетического регулирования, а также сопоставление с инструментальными и гистологическими данными в перспективе позволит разработать подходы к антифибротической терапии, которая в настоящей момент сопряжена с отсутствием органоспецифичности, и, следовательно, малоэффективна.

Заключение

В настоящем исследовании впервые показано, что, помимо генов непосредственно миофи-бробластной дифференцировки (ACTA2, VIM, TGFB1, TGFBR1) и синтеза ЭЦМ (CTGF и CO-L1A1), в развитии фиброза миокарда у пациентов после ИМ гены могут играть значимую роль гены вазоконстрикторов (AGTR1) и про-воспалительных факторов (CCL2 и TNF), вероятно, также вносящих свой вклад в синтез компонентов ЭЦМ активированными сердечными фибробластами.

Литература :

1. Travers JG, Kamal FA, Robbins J, Yutzey KE, Blaxall BC. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. CircRes. 2016;118(6):1021-1040. https:// doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.115.306565

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

2. Talman V, Ruskoaho H. Cardiac fibrosis in myocardial infarction-from repair and remodeling to regeneration. Cell Tissue Res. 2016;365(3):563-581. https://doi.org/10.1007/s00441-016-2431-9

3. Bui AL, Horwich TB, Fonarow GC. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nat Rev Cardiol. 2011;8(1):30-41. https://doi.org/10.1038/ nrcardio.2010.165

4. Bing R, Dwec MR. Myocardial fibrosis: why image, how to image and clinical implications. Heart. 2019;105:1832-1840. https://doi.org/10.1136/ heartjnl-2019-315560

5. Leask A. Getting to the heart of the matter: new insights into cardiac fibro-sis. Circ Res. 2015;116(7):1269-1276. https://doi.org/10.1161/CIRCRE-SAHA.116.305381

6. Kong P, Christia P, Frangogiannis NG. The pathogenesis of cardiac fibrosis. Cell Mol Life Sci. 2014;71(4):549-574. https://doi.org/10.1007/ s00018-013-1349-6

7. Tallquist MD. Cardiac Fibroblast Diversity. Annu Rev Physiol. 2020;82:63-78. https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-021119-034527

8. Tian J, An X, Niu L. Myocardial fibrosis in congenital and pediatric heart disease. Exp Ther Med. 2017;13(5):1660-1664. https://doi.org/10.3892/ etm.2017.4224

9. López B, González A, Ravassa S, Beaumont J, Moreno MU, San José G, Querejeta R, Díez J. Circulating Biomarkers of Myocardial Fibrosis: The Need for a Reappraisal. J Am Coll Cardiol. 2015;65(22):2449-2456. https://doi.org/10.1016/jjacc.2015.04.026

10. Heymans S, González A, Pizard A, Papageorgiou AP, López-Andrés N, Jaisser F, Thum T, Zannad F, Díez J. Searching for new mechanisms of myocardial fibrosis with diagnostic and/or therapeutic potential. Eur J Heart Fail. 2015;17(8):764-771. https://doi.org/10.1002/ejhf.312

11. Roubille F, Busseuil D, Merlet N, Kritikou EA, Rhéaume E, Tardif JC. In-vestigational drugs targeting cardiac fibrosis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2014;12(1):111-125. https://doi.org/10.1586/14779072.2013.839942

12. Fan Z, Guan J. Antifibrotic therapies to control cardiac fibrosis. Biomater Res. 2016;20:13. https://doi.org/10.1186/s40824-016-0060-8

13. Kockova R, Kacer P, Pirk J, Maly J, Sukupova L, Sikula V, Kotrc M,

Barciakova L, Honsova E, Maly M, Kautzner J, Sedmera D, Penicka M. Native T1 Relaxation Time and Extracellular Volume Fraction as Accurate Markers of Diffuse Myocardial Fibrosis in Heart Valve Disease-Comparison With Targeted Left Ventricular Myocardial Biopsy. Circ J. 2016;80(5):1202-1209. https://doi.org/10.1253/circj.CJ-15-1309

14. Liu CY, Heckbert SR, Lai S, Ambale-Venkatesh B, Ostovaneh MR, McClelland RL, Lima JAC, Bluemke DA. Association of Elevated NT-proBNP With Myocardial Fibrosis in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA). J Am Coll Cardiol. 2017;70(25):3102-3109. https://doi.org/10.1016/jjacc.2017.10.044

15. Lurz JA, Luecke C, Lang D, Besler C, Rommel KP, Klingel K, Kandolf R, Adams V, Schöne K, Hindricks G, Schuler G, Linke A, Thiele H, Gutberlet M, Lurz P. CMR-Derived Extracellular Volume Fraction as a Marker for Myocardial Fibrosis: The Importance of Coexisting Myocardial Inflammation. JACC Cardiovasc Imaging. 2018;11(1):38-45. https://doi. org/10.1016/j.jcmg.2017.01.025

16. Cavalera M, Wang J, Frangogiannis NG. Obesity, metabolic dysfunction, and cardiac fibrosis: pathophysiological pathways, molecular mechanisms, and therapeutic opportunities. Transl Res. 2014;164(4):323-35. https://doi.org/10.1016Zj.trsl.2014.05.001

17. Souders CA, Bowers SL, Baudino TA. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 2009;105(12):1164-1176. https://doi.org/10.1161/CIR-CRESAHA.109.209809

18. Porter KE, Turner NA. Cardiac fibroblasts: at the heart of myocar-dial remodeling. Pharmacol Ther. 2009;123(2):255-278. https://doi. org/10.1016/j.pharmthera.2009.05.002

19. Dobaczewski M, Bujak M, Li N, Gonzalez-Quesada C, Mendoza LH, Wang XF, Frangogiannis NG. Smad3 signaling critically regulates fibroblast phenotype and function in healing myocardial infarction. Circ Res. 2010;107ß):418-428. https://doi.org/10.1161/CIRCRESA-HA.109.216101

20. Krishnan P, Purushothaman KR, Purushothaman M, Turnbull IC, Tar-ricone A, Vasquez M, Jain S, Baber U, Lascano RA, Kini AS, Sharma SK, Moreno PR. Enhanced neointimal fibroblast, myofibroblast content and altered extracellular matrix composition: Implications in the progression of human peripheral artery restenosis. Atherosclerosis. 2016;251:226-233. https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2016.06.046

21. See F, Thomas W, Way K, Tzanidis A, Kompa A, Lewis D, Itescu S, Krum H. P38 mitogen-activated protein kinase inhibition improves cardiac function and attenuates left ventricular remodeling following myocardial infarction in the rat. J Am Coll Cardiol. 2004;44(8):1679-1689. https://doi. org/10.1016/j.jacc.2004.07.038

22. Turner NA, Porter KE, Smith WH, White HL, Ball SG, Balmforth AJ. Chronic beta2-adrenergic receptor stimulation increases proliferation of human cardiac fibroblasts via an autocrine mechanism. Cardiovasc Res. 2003;57(3):784-792. https://doi.org/10.1016/s0008-6363(02)00729-0

23. Katwa LC. Cardiac myofibroblasts isolated from the site of myocardial infarction express endothelin de novo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;285(3):H1132-9. https://doi.org/10.1152/ajpheart.01141.2002

24. Hafizi S, Wharton J, Chester AH, Yacoub MH. Profibrotic effects of endothelin-1 via the ETA receptor in cultured human cardiac fibroblasts. Cell Physiol Biochem. 2004;14(4-6):285-292. https://doi. org/10.1159/000080338

25. Gao X, He X, Luo B, Peng L, Lin J, Zuo Z. Angiotensin II increases collagen I expression via transforming growth factor-beta1 and extracellular signal-regulated kinase in cardiac fibroblasts. Eur J Pharmacol. 2009;606(1-3):115-120. https://doi.org/10.1016Zj.ejphar.2008.12.049

26. Chen XQ, Liu X, Wang QX, Zhang MJ, Guo M, Liu F, Jiang WF, Zhou L. Pioglitazone inhibits angiotensin II-induced atrial fibroblasts proliferation via NF-kB/TGF-p1/TRIF/TRAF6 pathway. Exp Cell Res. 2015;330(1):43-55. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2014.08.021

27. Li J, Philip JL, Xu X, Theccanat T, Abdur Razzaque M, Akhter SA. Beta-arrestins regulate human cardiac fibroblast transformation and collagen synthesis in adverse ventricular remodeling. J Mol Cell Cardiol. 2014;76:73-83. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2014.08.006

28. Small EM, Thatcher JE, Sutherland LB, Kinoshita H, Gerard RD, Richardson JA, Dimaio JM, Sadek H, Kuwahara K, Olson EN. Myocardin-related transcription factor-a controls myofibroblast activation and fibrosis in response to myocardial infarction. Circ Res. 2010;107(2):294-304. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.110.223172

29. Weng X, Yu L, Liang P, Chen D, Cheng X, Yang Y, Li L, Zhang T, Zhou B, Wu X, Xu H, Fang M, Gao Y, Chen Q, Xu Y. Endothelial MRTF-A mediates angiotensin II induced cardiac hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 2015;80:23-23. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2014.11.009

30. Dewald O, Zymek P, Winkelmann K, Koerting A, Ren G, Abou-Khamis T, Michael LH, Rollins BJ, Entman ML, Frangogiannis NG. CCL2/ Monocyte Chemoattractant Protein-1 regulates inflammatory responses critical to healing myocardial infarcts. Circ Res. 2005;96(8):881-889. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000163017.13772.3a

31. Mitchell MD, Laird RE, Brown RD, Long CS. IL-1beta stimulates rat cardiac fibroblast migration via MAP kinase pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007;292(2):H1139-47. https://doi.org/10.1152/ ajpheart.00881.2005

32. Baneijee I, Fuseler JW, Intwala AR, Baudino TA. IL-6 loss causes ventricular dysfunction, fibrosis, reduced capillary density, and dramatically alters the cell populations of the developing and adult heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009;296(5):H1694-704. https://doi. org/10.1152/ajpheart.00908.2008

33. Christia P, Bujak M, Gonzalez-Quesada C, Chen W, Dobaczewski M, Reddy A, Frangogiannis NG. Systematic characterization of myocardi-al inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. J Histochem Cytochem. 2013;61(8):555-570. https://doi.org/10.1369/0022155413493912

34. Duerrschmid C, Crawford JR, Reineke E, Taffet GE, Trial J, Entman ML, Haudek SB. TNF receptor 1 signaling is critically involved in mediating angiotensin-II-induced cardiac fibrosis. J Mol Cell Cardiol. 2013;57:59-67. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2013.01.006

35. Rosin NL, Falkenham A, Sopel MJ, Lee TD, Legare JF. Regulation and role of connective tissue growth factor in angii-induced myocardial fi-brosis. Am J Pathol. 2013;182(3):714-726. https://doi.org/10.1016/j.aj-path.2012.11.014

36. Zhao W, Zhao T, Huang V, Chen Y, Ahokas RA, Sun Y. Platelet-derived growth factor involvement in myocardial remodeling following infarction. J Mol Cell Cardiol. 2011;51(5):830-838. https://doi.org/10.1016/j. yjmcc.2011.06.023

37. Liu C, Zhao W, Meng W, Zhao T, Chen Y, Ahokas RA, Liu H, Sun Y. Platelet-derived growth factor blockade on cardiac remodeling following infarction. Mol Cell Biochem. 2014;397(1-2):295-304. https://doi. org/10.1007/s11010-014-2197-x

38. Tzanidis A, Hannan RD, Thomas WG, Onan D, Autelitano DJ, See F, Kelly DJ, Gilbert RE, Krum H. Direct actions of urotensin II on the heart: implications for cardiac fibrosis and hypertrophy. Circ Res. 2003;93(3):246-253. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000084382.64418.BC

39. Maleszewski JJ, Rihal CS. Current status of endomyocardial biopsy. Mayo Clin Proc. 2011;86(11):1095-1102. https://doi.org/10.4065/ mcp.2011.0296

40. Luo J, Chen X, Luo C, Lu G, Peng L, Gao X, Zuo Z. Hydrochlorothiazide modulates ischemic heart failure-induced cardiac remodeling via inhibiting angiotensin II type 1 receptor pathway in rats. Cardiovasc Ther. 2017;35(2). https://doi.org/10.1111/1755-5922.12246.

41. Duerrschmid C, Trial J, Wang Y, Entman ML, Haudek SB. Tumor necrosis factor: a mechanistic link between angiotensin-II-induced cardiac inflammation and fibrosis. Circ Heart Fail. 2015;8(2):352-61. https://doi. org/10.1161/CIRCHEARTFAILURE.114.001893

42. Sun M, Chen M, Dawood F, Zurawska U, Li JY, Parker T, Kassiri Z, Kirshenbaum LA, Arnold M, Khokha R, Liu PP. Tumor necrosis factor-alpha mediates cardiac remodeling and ventricular dysfunction after pressure overload state. Circulation. 2007;115(11):1398-407. https://doi. org/10.1161/CIRCULATIONAHA.106.643585

43. Jobe LJ, Melendez GC, Levick SP, Du Y, Brower GL, Janicki JS. TNF-alpha inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009;297(4):H1462-8. https://doi.org/10.1152/ajpheart.00442.2009

44. Berry MF, Woo YJ, Pirolli TJ, Bish LT, Moise MA, Burdick JW, Morine KJ, Jayasankar V, Gardner TJ, Sweeney HL. Administration of a tumor necrosis factor inhibitor at the time of myocardial infarction attenuates subsequent ventricular remodeling. J Heart Lung Transplant. 2004;23(9):1061-1068. https://doi.org/10.1016/j.healun.2004.06.021

45. Dunlay SM, Weston SA, Redfield MM, Killian JM, Roger VL. Tumor necrosis factor-alpha and mortality in heart failure: a community study. Circulation. 2008;118(6):625-631. https://doi.org/10.1161/CIRCULATION-AHA.107.759191

46. Sivasubramanian N, Coker ML, Kurrelmeyer KM, MacLellan WR, DeMayo FJ, Spinale FG, Mann DL. Left ventricular remodeling in transgenic mice with cardiac restricted overexpression of tumor necrosis factor. Circulation. 2001;104(7):826-831. doi: https://doi.org/10.1161/hc3401.093154

47. Li YY, Feng YQ, Kadokami T, McTiernan CF, Draviam R, Watkins SC, Feldman AM. Myocardial extracellular matrix remodeling in transgenic mice overexpressing tumor necrosis factor alpha can be modulated by anti-tumor necrosis factor alpha therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(23):12746-12751. https://doi.org/10.1073/pnas.97.23.12746

48. Frangogiannis NG, Dewald O, Xia Y, Ren G, Haudek S, Leucker T, Kraemer D, Taffet G, Rollins BJ, Entman ML. Critical role of monocyte chemoattractant protein-1/CC chemokine ligand 2 in the pathogenesis of ischemic cardiomyopathy. Circulation. 2007;115(5):584-92. https://doi. org/10.1161/CIRCULATIONAHA.106.646091

49. Hayashidani S, Tsutsui H, Shiomi T, Ikeuchi M, Matsusaka H, Suematsu N, Wen J, Egashira K, Takeshita A. Anti-monocyte chemoattractant pro-tein-1 gene therapy attenuates left ventricular remodeling and failure after experimental myocardial infarction. Circulation. 2003;108(17):2134-2140. https://doi.org/10.1161/01.CIR.0000092890.29552.22

50. Kuwahara F, Kai H, Tokuda K, Takeya M, Takeshita A, Egashira K, Imai-zumi T. Hypertensive myocardial fibrosis and diastolic dysfunction: another model of inflammation? Hypertension. 2004;43(4):739-745. https://doi. org/10.1161/01.HYP.0000118584.33350.7d

51. Hohensinner PJ, Rychli K, Zorn G, Hulsmann M, Berger R, Mortl D, Richter B, Huber K, Wojta J, Pacher R, Niessner A. Macrophage-modulat-ing cytokines predict adverse outcome in heart failure. Thromb Haemost. 2010;103(2):435-441. https://doi.org/10.1160/TH09-06-0399

52. Maekawa N, Wada H, Kanda T, Niwa T, Yamada Y, Saito K, Fujiwara H, Sekikawa K, Seishima M. Improved myocardial ischemia/reperfusion injury in mice lacking tumor necrosis factor-alpha. J Am Coll Cardiol. 2002;39(7):1229-1235. https://doi.org/10.1016/s0735-1097(02)01738-2

53. Deswal A, Bozkurt B, Seta Y, Parilti-Eiswirth S, Hayes FA, Blosch C, Mann DL. Safety and efficacy of a soluble P75 tumor necrosis factor receptor (Enbrel, etanercept) in patients with advanced heart failure. Circulation. 1999;99(25):3224-3226. https://doi.org/10.1161/01.cir.99.25.3224

54. Mann DL, McMurray JJ, Packer M, Swedberg K, Borer JS, Colucci WS, Djian J, Drexler H, Feldman A, Kober L, Krum H, Liu P, Nieminen M, Tavazzi L, van Veldhuisen DJ, Waldenstrom A, Warren M, Westheim A, Zannad F, Fleming T. Targeted anticytokine therapy in patients with chron-

ic heart failure: results of the Randomized Etanercept Worldwide Evaluation (RENEWAL). Circulation. 2004;109(13):1594-1602. https://doi. org/10.1161/01.CIR.0000124490.27666.B2 55. Chung ES, Packer M, Lo KH, Fasanmade AA, Willerson JT; Anti-TNF Therapy Against Congestive Heart Failure Investigators. Randomized, double-blind, placebo-controlled, pilot trial of infliximab, a chimeric monoclonal antibody to tumor necrosis factor-alpha, in patients with moderate-to-severe heart failure: results of the anti-TNF Therapy Against Congestive Heart Failure (ATTACH) trial. Circulation. 2003;107(25):3133-3140. https://doi.org/10.1161/01.CIR.0000077913.60364.D2

56. Parichatikanond W, Luangmonkong T, Mangmool S, Kurose H. Therapeutic Targets for the Treatment of Cardiac Fibrosis and Cancer: Focusing on TGF-beta Signaling. Front Cardiovasc Med. 2020;7:34. https://doi.org/10.3389/fcvm.2020.00034

57. Vainio LE, Szabo Z, Lin R, Ulvila J, Yijola R, Alakoski T, Piuhola J, Koch WJ, Ruskoaho H, Fouse SD, Seeley TW, Gao E, Signore P, Lipson KE, Magga J, Kerkela R. Connective Tissue Growth Factor Inhibition Enhances Cardiac Repair and Limits Fibrosis After Myocardial Infarction. JACC Basic Transl Sci. 2019;4(1):83-94. https://doi.org/10.1016/j. jacbts.2018.10.007

References: