МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАКА ЛЕГКОГО Н1299 ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВЫСОКИМИ ДОЗАМИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

PU) CheckfonjPdates

https://doi.org/10.35401/2500-0268-2021-23-3-19-23 © В.И. Вошедский *, П.Г. Сакун, Е.А. Дженкова, А.А. Пушкин, А.О. Ситковская, И.В. Межевова, С.Г. Власов, Т.С. Рогова

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАКА ЛЕГКОГО Н1299 ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВЫСОКИМИ ДОЗАМИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии, г. Ростов-на-Дону, Россия

ЕЗ * В.И. Вошедский, Национальный медицинский исследовательский центр онкологии, 344037, Ростов-на-Дону, 14-я

линия, 63, [email protected] Поступила в редакцию 20 февраля 2021 г. Исправлена 20 апреля 2021 г. Принята к печати 15 мая 2021 г.

Цель исследования Материал и методы

Результаты

Выводы

Ключевые слова:

Цитировать:

Изучить копийность генов-компонентов сигнальных каскадов, вовлеченных в репарацию ДНК, регуляцию клеточного цикла и апоптоза при воздействии высоких доз ионизирующего излучения. Исследование проведено на культуре клеток немелкоклеточного рака легкого Н1299. Клеточные линии культивировали в инкубаторе Binder (Германия) 24 ч (при 37 °C, 5% СО2), а затем разделили группы на терапевтическую и контрольную. Первая группа облучалась на линейном ускорителе NovalisTx, Varian дозами от 18 до 24 Гр, вторая не подвергалась облучению. Во время исследования осуществляли: контроль жизнеспособности клеток, оценку апоптотической активности, затем проводили амплификацию каждой из проб в двух повторностях. Определение относительной копий-ности генетических локусов осуществляли методом Real-Time qPCR (RT-qPCR). При сравнении относительной копийности в генетических локусах культуры клеток немелкокле-точного рака легкого Н1299 после воздействия высокой дозой ионизирующего излучения было обнаружено статически достоверное снижение относительной копийности генов CASP3 и RBBP8, что может свидетельствовать о снижении потенциала каспаза-опосредованной репопуляции опухоли и повышении радиочувствительности опухолевых клеток.

Воздействие высоких доз ионизирующего излучения приводит к губительному воздействию на опухолевые клетки и позволяет преодолеть один из механизмов радиорезистентности - репопуля-цию опухолевых клеток.

немелкоклеточный рак легкого, метастатическое поражение головного мозга, лучевая терапия, радиохирургия, культура клеток, комплексная терапия

Вошедский В.И., Сакун П.Г., Дженкова Е.А., Пушкин А.А., Ситковская А.О., Межевова И.В., Власов С.Г., Рогова Т.С. Молекулярные изменения в культуре клеток рака легкого Н1299 при воздействии высокими дозами ионизирующего излучения. Инновационная медицина Кубани. 2021;(3):19-23. https://doi.org/10.35401/2500-0268-2021-23-3-19-23

© Vitaly I. Voshedskiy *, Pavel G. Sakun, Elena A. Genkova, Anton A. Pushkin, Anastasia O. Sitkovskaya, Irina V. Mezhevova, Stanislav G. Vlasov, Tatyana S. Rogova

MOLECULAR ALTERATIONS IN THE CULTURE OF LUNG CANCER CELLS H1299 AFTER EXPOSURE TO HIGH DOSES OF IONIZING RADIATION

National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russian Federation

"Vitaly I. Voshedskiy, National Medical Research Centre for Oncology, 63, 14th Line st, Rostov-on-Don, 344037, [email protected]

Received: February 20,2021. Received in revised form: April 20,2021. Accepted: May 15,2021.

Objective To study the copy number of genes-components of signaling cascades involved in DNA repair, cell cycle

regulation and apoptosis under the influence of high doses of ionizing radiation.

Material and Мethods The study was carried out on a culture of H1299 non-small cell lung cancer cells. Cell lines were cultured in a Binder incubator (Germany) for 24 h (at 37 °C, 5% CO2), and then the groups were divided into therapeutic and control. The first one was irradiated with a NovalisTx, Varian linear accelerator at doses from 18 to 24 Gy, the second was not exposed to radiation. During the study, we monitored cell viability and evaluated apoptotic activity, then each sample was amplified in two iterations. During the study, cell viability was monitored, apoptotic activity was assessed, and then each sample was amplified in two replicates. The relative copy number of genetic loci was determined by Real-Time qPCR (RT-qPCR).

Results When comparing the relative copy number in the genetic loci of the H1299 non-small cell lung cancer cell

culture after exposure to a high dose of ionizing radiation, a statistically significant decrease in the relative copy number of the CASP3 and RBBP8 genes was found, which may indicate a decrease in the potential of caspase-mediated tumor repopulation and an increase in the radiosensitivity of tumor cells.

@ Статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0.

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 License.

Conclusion Exposure to high doses of ionizing radiation leads to a detrimental effect on tumor cells and allows to

overcome one of the mechanisms of radioresistance - tumor cell repopulation.

Keywords: non-small cell lung cancer, metastatic brain lesion, radiation therapy, radiosurgery, cell culture, complex

therapy

Cite this article as: Voshedskiy V.I., Sakun P.G., Genkova E.A., Pushkin A.A., Sitkovskaya A.O., Mezhevova I.V., Vlasov S.G., Rogova T.S. Molecular alterations in the culture of lung cancer cells H1299 after exposure to high doses of ionizing radiation. Innovative Medicine of Kuban. 2021;(3):19-23. https://doi.org/10.35401/2500-0268-2021-23-3-19-23

ВВЕДЕНИЕ

Рак легких (РЛ) во всем мире занимает первое место в структуре смертности от злокачественных новообразований как у мужчин, так и у женщин. Около 1,6 миллиона человек ежегодно умирают от рака легких, а общая 5-летняя выживаемость составляет всего 15% [1, 2]. В структуре общей заболеваемости злокачественными новообразованиями в России РЛ входит в тройку ведущих (9,4%), а среди мужского населения занимает первое место (16,3%) [3].

РЛ является заболеванием пожилых людей, средний возраст трети пациентов составляет 75 лет, причем многие больные имеют значительные сопутствующие заболевания вследствие влияния различных факторов в течение жизни [4]. В связи с чем лечение таких пациентов представляет сложную задачу. Основным методом лечения ранних стадий РЛ является хирургический, однако примерно 25% пациентов с ранней стадией немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) не являются кандидатами на операцию, которая остается основным методом терапии из-за тяжелых сопутствующих заболеваний. Этот факт требует поиска новых терапевтических подходов для такой категории больных [4].

Перспективным направлением лечения пациентов с ранней стадией РЛ является стереотаксическая гипофракционированная лучевая терапия (SBRT). Принципиальным отличием SBRT от традиционной лучевой терапии является применение существенно больших доз во время каждого сеанса.

Неотъемлемой частью комплексного лечения генерализованных больных с НМРЛ является стере-отаксическая радиохирургия (SRS), которая продемонстрировала свою высокую эффективность при лечении больных с метастатическим поражением головного мозга [18]. Большие дозы ионизирующего излучения при SBRT обладают более мощным биологическим воздействием и приводят к высоким показателям местного контроля опухоли. По данным проспективных исследований, 3-летний локальный контроль составил примерно 90% при SBRT НМРЛ I стадии [6-13].

Успешное применение ионизующего воздействия при радиотерапевтическом лечении связано, главным образом, с возможностью активирования механизмов клеточной гибели. Считается, что основным механиз-

мом при воздействии ионизующего излучения является апоптоз. Он инициируется нарушениями внеклеточного микроокружения, которые обнаруживаются рецепторами плазматической мембраны, сигнализируются и реализуются исполнительными каспазами, главным образом CASP3.

Основным способом оценки молекулярных процессов, происходящих в опухолевых клетках, является анализ изменения копийности генов (Copy Number Variation или CNV). Копийность генов - вид генетического полиморфизма, возникающий в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации. Результатом вариации может явиться уменьшение или повышение числа копий определенного гена, и, следовательно, изменение экспрессии продукта гена-белка или не кодирующей РНК. CNV представляют собой критические генетические события, которые способствуют развитию и прогрессированию злокачественных новообразований у человека [13].

Точная характеристика числа копий генов позволит раскрыть процессы, происходящие в опухолевой клетке при воздействии на нее высокими дозами лучевой терапии. На основании вышеизложенных данных целью нашего опыта стало исследование относительной копийности генетических локусов, ответственных за репарацию ДНК, регуляцию клеточного цикла и апоптоза.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на культуре немелкокле-точного рака легкого Н1299. Во флаконы Т75 с поверхностью культивирования 75 см2 (Corning, USA) пассировали клетки Н1299 по 5^106 кл/фл в среду DMEM (Gibco, USA) с добавлением 10%-й эмбриональной бычьей сыворотки (Биолот, Россия), 0,5%-го гентамицина (Биолот, Россия). Клеточную линию культивировали 24 ч в инкубаторе Binder (Германия) при 37 °C, 5% СО2. Облучение клеточной линии Н1299 осуществлялось на линейном ускорителе NovalisTx, Varian дозами от 18 до 24 Гр с шагом 1 Гр, контроль оставался без облучения. Экспозицию проводили в течение 24 ч при 37 °C, 5% СО2. Жизнеспособность клеток определяли в автоматическом анализаторе EVE (NanoEntec, Корея) окрашиванием трипановым синим 0,4%-м (NanoEntec, Корея). Оцен-

ку апоптотической активности проводили на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США) с использованием Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharminogen, США).

Геномную ДНК экстрагировали из культур немел-коклеточного рака легкого Н1299 с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия) и станции автоматического выделения нуклеиновых кислот QIAcube Connect (Qiagen, Германия). Концентрацию полученных препаратов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® (Invitrogen, США) с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, США). Для проведения Real-Time qPCR концентрацию образцов ДНК норма-лизовывали до величины 2 нг/мкл.

Определение относительной копийности генетических локусов проводили методом Real-Time qPCR (RT-qPCR). Принцип метода заключается в одновременной амплификации гена-мишени и референтного гена в опытной и контрольной пробах. Вывод об изменении копийности гена делается на основании анализа соотношения сигналов, продуцируемых ампликонами изучаемой и референсных последовательностей. В качестве референсных локусов использовались ACTB, B2M и GAPDH. Стабильность референсных локусов проверялась с использованием пакета «GENorm». Относительная величина определялась методом AACt [16]. Каждые 15 мкл ПЦР-смеси для анализа содержали 10 нг геномной ДНК, 0.2 mM dNTP's, по 500 нМ прямого и обратного праймеров для референтных генов или гена-мишени, 2 mM MgCl2, ПЦР-буфер, 0.05и/ц1 HS Taq ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами (Евроген, Россия). В качестве красителя использовали EvaGreen (Invitrogen, США). Амплификация каждой из проб осуществлялась в двух повторностях. Первичные данные RT-qPCR получали

с использованием программного обеспечения BioRad CFX Manager ver 3.1.

Количественная RT-PCR амплификация проводилась с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе: 95 °C 3 мин, и 40 циклов при 95 °C 10 сек., 58 °C 30 сек. и 72 °C 30 сек. (чтение оптического сигнала FAM для красителя EvaGreen). Для оценки специфичности ПЦР-продукты подвергались плавлению в диапазоне температур 65-95 °C, инкремент - 0,5 °C. Прямой и обратный праймеры для каждого локуса были разработаны с использованием референтных последовательностей ДНК NCBI GenBank [17].

Статистический анализ проводился с использованием пакетов среды R. Наличие значительной разницы между средними показателями копийности исследуемых генов в экспериментальных условиях оценивали с помощью одностороннего теста ANOVA. Для расчета попарных сравнений между группами применяли парный T-тест с корректировкой p-значения методом Бенджамини-Хохберга.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В опыте была определена копийность генов-компонентов сигнальных каскадов, вовлеченных в репарацию ДНК, регуляцию клеточного цикла и апоп-тоза: AKT1, ATM, BIRP1, BRCA1, BRCA2, CDKN1B, CCND1, RBBP8, RAD50, TP53, XRCC4, BAX, CASP7, CASP8, CASP3, CASP9, C-FLIP, MDM2, BCL2.

При сравнении относительной копийности в генетических локусах культуры клеток немелкоклеточно-го рака легкого Н1299 обнаружено статически достоверное изменение относительной копийности генов CASP3 и RBBP8.

Снижение копийности гена CASP3 (рис. 1) после воздействия высокой дозы ионизирующего излуче-

Рисунок 1. Изменение относительной копийности гена CASP3

Figure 1. Change in the relative copy number of the CASP3 gene

Рисунок 2. Изменение относительной копийности гена RBBP8

Figure 2. Change in the relative copy number of the RBBP8 gene

ния может свидетельствовать о снижении потенциала каспаза-опосредованной репопуляции опухоли и повышает радиочувствительность опухоли, что согласуется с данными литературы [15].

CtIP/RBBP8 в настоящее время более известен своей ролью в репарации двухцепочечного разрыва ДНК и стабильности генома. CtIP является взаимодействующим партнером белкового комплекса датчика повреждения ДНК Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN), который распознает двухцепочечные разрывы ДНК. CtIP участвует в этих путях, поддерживающих начальные этапы обработки ДНК, а также в рекрутировании дополнительных белков репарации ДНК. Снижение копийности гена RBBP8 после воздействия высокой дозы ионизирующего излучения (рис. 2) может свидетельствовать о снижении потенциала репарации ДНК, что доказывает высокую эффективность подобного воздействия.

ВЫВОДЫ

Высокие дозы ионизирующего излучения приводят к губительному воздействию на опухолевые клетки и позволяют преодолеть один из механизмов радиорезистентности - репопляцию опухолевых клеток.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2008. CA Cancer J Clin. 2008;58(2):71-96. PMID: 18287387. https:// doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-14-14-ed

2. Cancer fact sheet. World Health Organization. 2010. URL: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/

3. Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахза-довой Злокачественные новообразования в России в 2019 году (заболеваемость и смертность). - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2020; 252 с.

Kaprina AD, Starinsky VV, Shakhzadova AO, ed. Malignant neoplasms in Russia in 2019 (morbidity and mortality). National Medical Research Center of Radiology of the Russian Ministry of Health. 2020; 252 p.

4. Howlader N, Noone AM, Krapcho M, et al. SEER cancer statistics review, 1975-2014. National Cancer Institute. 2017. https://doi.org/10.1093/jnci/djx030

5. Donington J, Ferguson M, Mazzone P, et al. American college of chest physicians and society of thoracic surgeons consensus statement for evaluation and management for high-risk patients with stage I non-small cell lung cancer. Chest. 2012;142:1620-1635. PMID: 23208335. https://doi.org/10.1378/chest.12-0790

6. Hoyer M., Roed H., Hansen A.T., et al. Prospective study on stereotactic radiotherapy of limited-stage non-small-cell lung cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2006;66(4):S128-S135. https://doi.org/10.1016/j.ijrobp.2006.01.012

7. Fakiris AJ, McGarry RC, Yiannoutsos CT, et al. Stereotactic body radiation therapy for early-stage non-small-cell lung carcinoma: four-year results of a prospective phase II study. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009;75:677-682. PMID: 19251380. https://doi.org/10.1016/j.ijrobp.2008.11.042

8. Baumann P, Nyman J, Hoyer M, et al. Outcome in a prospective phase II trial of medically inoperable stage I non-small-cell lung cancer patients treated with stereotactic body

radiotherapy. J Clin Oncol. 2009;27(20):3290-3296. https://doi. org/10.1016/s8756-3452(09)79376-4

9. Timmerman R, Paulus R, Galvin J, et al. Stereotactic body radiation therapy for inoperable early stage lung cancer. JAMA. 2010;303(11):1070-1076. PMID: 20233825. PMCID: PMC2907644. https://doi.org/10.1001/jama.2010.261

10. Ricardi U, Filippi AR, Guarneri A, et al. Stereotactic body radiation therapy for early stage non-small cell lung cancer: results of a prospective trial. Lung Cancer. 2010;68:72-77. PMID: 19556022. https://doi.org/10.1016/j.lungcan.2009.05.007

11. Bral S, Gevaert T, Linthout N, et al. Prospective, risk-adapted strategy of stereotactic body radiotherapy for early-stage non-small-cell lung cancer: results of a phase II trial. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2011;80(5):1343-1349. https://doi.org/10.1016/). ijrobp.2010.04.056

12. Nagata Y, Hiraoka M, Shibata T, et al. Prospective trial of stereotactic body radiation therapy for both operable and inoperable T1N0M0 non-small cell lung cancer: Japan Clinical Oncology Group study JC0G0403. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2015;93(5):989-996. PMID: 26581137. https://doi.org/10.1016/). ijrobp.2015.07.2278

13. Sun B, Brooks ED, Komaki RU, et al. 7-year follow-up after stereotactic ablative radiotherapy for patients with stage I non-small cell lung cancer: results of a phase 2 clinical trial. Cancer. 2017;123(16):3031-3039. PMID: 28346656. PMCID: PMC5544582. https://doi.org/10.1002/cncr.30693

14. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Гудуе-ва Е.Н. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка. Молекулярная биология. 2015;49(4):658-666.

Kit OI, Vodolazhsky DI, Kutilin DS, Gudueva EN. Change in copy number of genetic loci in stomach cancer. Molecular Biology. 2015;49(4):658-666.

15. Huang Q, Li F, Liu X, et al. Caspase 3-mediated stimulation of tumor cell repopulation during cancer radiotherapy. Nat Med. 2011:17(7):860-866. PMID: 21725296. PMCID: PMC3132290. https://doi.org/10.1038/ nm.2385.

16. Кит О.И., Пушкин А.А., Росторгуев Э.Е., Тимош-кина Н.Н., Кузнецова Н.С., Кавицкий С.Э., Нальгиев А.М. (2019). Дифференциальная экспрессия 15-ти генов в глиаль-ных опухолях различной степени злокачественности. Современные проблемы науки и образования. 2019;5:66-66.

Kit OI, Pushkin AA, Rostorguev EE, Timoshkina NN, Kuznetsova NS, Kavitsky SE, Nalgiev AM. Differential expression of 15 genes in glial tumors of various degrees of malignancy. Modern problems of science and education. 2019;5:66-66. (In Russ.)

17. Кит О.И., Водолажский Д.И., и др. CNV генов в качестве биомаркера и терапевтической мишени при раке желудка. Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2017;4(2):196-2.

Kit O.I., Vodolazhsky D.I., Tatimov M.Z, et al. CNV genes as a biomarker and therapeutic target in gastric cancer. Proceedings of higher educational institutions. North Caucasian region. Natural Sciences. 2017;4(2):196-2. (In Russ.)

18. Кит О.И., Вошедский В.И., Сакун П.Г., и др. Опыт применения радиохирургического комплекса Novalis Tx в практике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. Южно-российский онкологический журнал. 2020; 1(4):32-37. https://doi. org/10.37748/2687-0533-2020-1-4-4

Kit OI, Voshedskii VI, Sakun PG, et al. Novalis Tx radiosurgical platform experience in National Medical Research Centre for Oncology of the Russian Ministry of Health. South Russian Journal of Cancer. 2020;1(4):32-37. https://doi.org/10.37748/2687-0533-2020-1-4-4

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Вошедский Виталий Игоревич, врач-радиотерапевт, НМИЦ онкологии (Ростов-на-Дону, Россия). https://orcid. о^/0000-0003-1405-8329

Сакун Павел Георгиевич, к. м. н., врач-радиотерапевт, НМИЦ онкологии (Ростов-на-Дону, Россия). https://orcid. о^/0000-0001-8061-6259

Дженкова Елена Алексеевна, д. б. н., доцент, Ученый секретарь, НМИЦ онкологии (Ростов-на-Дону, Россия). ^Ш^:// orcid.org/0000-0002-3561-098X

Пушкин Антон Андреевич, научный сотрудник лаборатории молекулярной онкологии, НМИЦ онкологии (Ростов-на-Дону, Россия). https://orcid.org/0000-0003-2385-6285

Ситковская Анастасия Олеговна, Вр ио. заведующей лаборатории клеточных технологий, НМИЦ онкологии (Ростов-на-Дону, Россия). https://orcid.org/0000-0002-6035-1756

Межевова Ирина Валентиновна, младший научный сотрудник Лаборатории клеточных технологий, НМИЦ онкологии (Ростов-на-Дону, Россия). https://orcid.org/0000-0002-7902-7278

Власов Станислав Григорьевич, аспирант, НМИЦ онкологии (Ростов-на-Дону, Россия) https://orcid.org/0000-0002-4680-8991

Рогова Татьяна Сергеевна, клинический ординатор, НМИЦ онкологии (Ростов-на-Дону, Россия). https://orcid. org/0000-0003-0074-0044

Финансирование

Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

AUTHOR CREDENTIALS

Vitaly I. Voshedskiy, Radiotherapist, National Medical Research Centre of Oncology (Rostov-on-Don, Russian Federation). https://orcid.org/0000-0003-1405-8329

Pavel G. Sakun, Cand. of Sci. (Med.), Radiotherapist, National Medical Research Centre of Oncology (Rostov-on-Don, Russian Federation). https://orcid.org/0000-0001-8061-6259

Elena A. Genkova, Dr. of Sci. (Biol.), Associate Professor, Scientific Secretary, National Medical Research Centre of Oncology (Rostov-on-Don, Russian Federation). https://orcid. org/0000-0002-3561-098X

Anton A. Pushkin, Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, National Medical Research Centre of Oncology of the Ministry (Rostov-on-Don, Russian Federation). https://orcid. org/0000-0003-2385-6285

Anastasia O. Sitkovskaya, Head of the Laboratory of Cell Technologies, National Medical Research Centre of Oncology (Rostov-on-Don, Russian Federation). https://orcid.org/0000-0002-6035-1756

Irina V. Mezhevova, Researcher, Laboratory of Cell Technologies, National Medical Research Centre of Oncology (Rostov-on-Don, Russian Federation). https://orcid.org/0000-0002-7902-7278

Stanislav G. Vlasov, Postgraduate Student, National Medical Research Centre of Oncology (Rostov-on-Don, Russian Federation). https://orcid.org/0000-0002-4680-8991

Tatyana S. Rogova, Resident Medical Practitioner, National Medical Research Centre of Oncology (Rostov-on-Don, Russian Federation). https://orcid.org/0000-0003-0074-0044

Funding: the study was not sponsored.

Conflict of interest: none declared.