CC BY
76
Молекулярные и клеточные механизмы действия финголимода
А. В. НИКИТИН
Москва
Molecular and Cellular Mechanisms of Fingolimod Action
A. V. NIKITIN
Moscow
Представлены данные о механизме действия, эффективности и безопасности препарата финголимод. Дальнейшее изучение молекулярных, биохимических и клеточных механизмов действия фармакологических регуляторов трансдукции сигналов фосфолипидных медиаторов является важной основой для создания новых иммуномодуляторов и противоопухолевых средств.
Ключевые слова: аутоиммунные заболевания, иммунодепрессанты, финголимод.
The data on the mechanism of action, efficacy and safety of the drug fingolimod are presented. Further study of the molecular, biochemical and cellular mechanisms of action of pharmacological regulators of phospholipid mediators' signal transduction is an important basis for developing new immunomodulators and antitumor agents.
Key words: autoimmune diseases, immunosuppressants, fingolimod.
Разработка новых средств иммунодепрессив-ной терапии для трансплантологии и лечения аутоиммунных заболеваний является актуальной задачей современной фармакологии. В течение последних десятилетий были установлены основные механизмы внутриклеточной трансдукции сигналов, регулирующих клеточную пролиферацию и дифференцировку, определены молекулярные мишени действия медиаторов и вторичных мессенджеров. Это позволило создать ряд эффективных иммунодепрессантов (сиролимус, такролимус, эверолимус и др.), нашедших применение в клинике.
Выяснение в последние 10 лет основных механизмов действия фосфолипидных медиаторов, в частности сфингозин-1-фосфата (81Р), как важных биологически активных веществ, привело к созданию иммунодепрессанта финголимода (РТУ720), применяемого для трансплантации органов и впоследствии рекомендованного для лечения рассеянного склероза. Этим аутоиммунным заболеванием в настоящее время во всем мире страдают более 2,5 миллионов человек, что определяет высокую актуальность разработки средств лечения этой патологии. Финголимод
© Коллектив авторов, 2013
Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. Редакция журнала
(первое пероральное лекарственное средство для лечения рассеянного склероза) был разрешён в 2010 году FDA для снижения частоты рецидивов и прогрессирования тяжёлых симптомов рецидивирующих форм рассеянного склероза [1].
Финголимод — 2-амино-2-(2-[4-октилфе-нил] этил-1,3-пропандиола гидрохлорид — был получен в результате химической трансформации иммунодепрессанта мириоцина (ISP-1, термози-моцидина), выделенного из энтомопатогенного гриба Isaria sinclairii. Биодоступность финголимода после перорального приёма превышает 90%. После перорального приёма финголимода в дозах 0,125—5 мг в день его концентрация в плазме крови возрастает линейно. Свыше 99% введённого препарата связывается с белками плазмы крови. Амфифильная природа финголимода определяет его большой объём распределения в различных тканях организма, в том числе в мозге. Финголи-мод является пролекарством, которое под действие киназы SphK2 и, в меньшей степени, киназы SphK1 превращается в активную фосфорилиро-ванную форму финголиода [2, 3]. Финголимод проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и фосфорилируется эндогенными SphK в ЦНС. Фосфорилированный финголимод под действием сфингозинфосфатазы обратно превращается в финголимод, который далее необратимо метаболизируется ферментами цитохрома Р450, в
ОБЗОРЫ
основном CYP4F2, и в меньшей мере CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4 и CYP4F12 в неактивные метаболиты карбоновой кислоты, которые затем экс-кретируются с мочой.
Основной молекулярный механизм действия финголимода состоит в его связывании с рецепторами биологически активного лизофосфолипида S1P. S1P образуется из сфингомиелина в результате последовательных реакций, катализируемых сфингомиелиназой, церамидазой и сфингозинки-назой (SphK), которая существует в виде 2 изо-ферментов SphK1 и SphK2, отличающихся по кинетическим характеристикам, распределению в тканях и регуляторным функциям. Эритроциты являются основным источником S1P в плазме крови. S1P может также образовываться в результате активации тромбоцитов и свертывания крови, в тучных, эндотелиальных клетках, фибробла-стах и клетках ЦНС.
S1P участвует в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки, реорганизации цитос-келета, поддерживает жизнеспособность клеток, регулирует хемотаксис, клеточную подвижность, адгезию и образование межклеточных щелевых контактов. S1P регулирует реакции иммунитета, тонус гладкой мускулатуры сосудов, целостность эндотелиального барьера, морфогенез, функции сердечно-сосудистой и нервной систем. В организме S1P содержится в относительно высоких концентрациях в мозге, селезёнке, глазу, плазме крови и лимфе [4].
Внеклеточный S1P по паракринному и ауто-кринному механизмам взаимодействует с рецепторами S1P пяти типов, которые являются семейством рецепторов, сопряжённых с G-белками. Рецепторы S1P:, S1P2 и S1P3 широко представлены в различных органах и тканях, тогда как S1P4 экспрессированы, преимущественно в клетках лимфоидной ткани, а S1P5 — в селезёнке и олиго-дендроцитах (ОДЦ) ЦНС [5].
Взаимодействие S1P c мембранными рецепторами запускает сложную последовательность внутриклеточной трансдукции сигналов, регулирующих процессы жизнедеятельности клеток. Передача сигналов S1P может быть прервана в результате воздействия фосфогидролазы, дефосфори-лирующей S1P до сфингозина и/или вследствие фосфорилирования рецепторов S1P, что ведет к их разобщению с G-белком и последующей интерна-лизации рецепторов. Покоящиеся Т и В-лимфоци-ты экспрессируют S1P: и, в меньшей степени, S1P4 и S1P3. Профиль экспрессии этих рецепторов аналогичен у CD4+, CD8+ и CD4+CD25+ Т-лимфоци-тов. Взаимодействие S1P с S1P: играет ведущую роль в регуляции миграции лимфоцитов, особенно их выхода из лимфатических узлов в кровоток.
В норме экспрессия рецепторов S1P на Т-лимфоцитах периферической крови и лимфы (в
условиях относительно низких концентрации S1P) является сравнительно высокой. Экспрессия рецепторов S1P на Т-лимфоцитах возрастает, когда они попадают в лимфатические узлы, где концентрация S1P мала. Таким образом, экспрессия рецепторов S1P на рециркулирующих Т-лим-фоцитах характеризуется циклическими изменениями в зависимости от концентрации внеклеточного S1P. Активация Т-лимфоцитов под действием антигена снижает экспрессию S1P:. Повышение же экспрессии S1P: в ходе пролиферации и дифференцировки клеток восстанавливает чувствительность Т-лимфоцитов к градиенту концентрации S1P между лимфатическими узлами и кровотоком и стимулирует выход Т-лимфо-цитов в циркуляцию [6].
Финголимод связывается с высоким аффинитетом с 4 из 5 рецепторов S1P (S1P:, S1P3, S1P4 и S1P5), но не с S1P2, и непосредственно после связывания проявляет агонизм с рецептором. Однако затем финголимод вызывает нарушение фосфорилирования рецептора и его интернализацию. Рецептор в цитоплазме клетки взаимодеиствует с убиквитином и затем подвергается разрушению ферментами протеасом. ДанныИ механизм в итоге ведет к развитию физиологического антагонизма финголимода в отношении S1P [7]. В течение некоторого времени после связывания с финголимо-дом рецепторы ещё могут находиться в активном состоянии и осуществлять регуляторные функции посредством подавления активности аденилил-циклазы и фосфорилирования киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK1/2). Подавление экспрессии рецепторов S1P на лимфоцитах снижает чувствительность клеток к градиенту концентрации S1P между лимфатическими узлами и кровотоком, что ведёт к снижению числа лимфоцитов в грудном лимфатическом протоке, периферической крови и селезёнке.
По результатам клинических исследовании II и III фаз финголимода при лечении больных рассеянным склерозом препарат снизил число лимфоцитов периферической крови в среднем с 1,84х109 /л в начале исследования до 0,49х109 /л через 1 месяц лечения [8, 9]. Лимфопения, вызванная финголимод ом, является обратимоИ. Препарат не снижает абсолютного числа лимфоцитов, но вызывает их перераспределение между кровью и лимфатическими узлами. По данным исследования FREEDOMS, число лимфоцитов периферическои крови больных нормализовалось через 6 недель после отмены финголимода [8]. Финголимод, в основном, влияет на Т и В-лимфоциты, слабо или вообще не влияет на гра-нулоциты, моноциты, эозинофилы, эритроциты и тромбоциты. Препарат влияет на Т-лимфоциты в большеИ степени, чем на В-лимфоциты. Среди Т-лимфоцитов финголимод преимущественно
воздействует на CD4+ , чем CD8+ Т-лимфоциты, что проявляется в снижении отношения CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов. Финголимод избирательно подавляет рециркуляцию Т-лимфоци-тов, экспрессирующих рецептор CCR7, необходимый для «хоминга» Т-лимфоцитов, а также рецептор CD62L, экспрессированный в «наивных» Т-лимфоцитах, среди которых имеются также Т-лимфоциты, образующие интерлейкин-17 (ТЫ7-лимфоциты). Эти клетки связаны с патогенезом рассеянного склероза и эффективностью его лечения с применением интерферона-^. Лечение больных рассеянным склерозом финголи-модом в дозе 0,5 мг в день в течение 6 месяцев вызывало стойкое снижение числа CD45+, CD4+ , CD8+ и CD19+ Т-лимфоцитов и отношения CD4 +/ CD8+ Т-лимфоцитов. Финголимод существенно не влиял на уровни большинства цитокинов у больных [10]. Финголимод в 2,5 раза снизил число иммуноцитов в спинномозговой жидкости (СМЖ) больных рассеянным склерозом через 4 месяца лечения [11]. При этом отмечено более выраженное снижение числа CD4+ по сравнению с CD8+ Т-лимфоцитами. Наряду с этим наблюдалось снижение числа В и пре-В-лимфоцитов в СМЖ, но не крови больных. Число NK-клеток при этом не изменялось. Средние концентрации S1P снизились с 2,12 нмоль/л до 0,71 нмоль/л в СМЖ и с 399,73 нмоль/л до 310,62 нмоль/л в крови [11]. Лечение финголимодом вызвало снижение в 10 раз числа CD4+CCR7+yd, но не CD4-CCR7- уд Т-лимфоцитов. Степень снижения числа уд Т-лимфоцитов была меньше по сравнению с ав Т-лимфоцитами, связанными с адаптивным иммунитетом, что вело к снижению отношения уд/ав Т-лимфоцитов, у больных, получавших финголимод. уд Т-лимфоциты периферической крови больных, леченных финголи-модом, проявляли повышенную цитотоксич-ность и снижали образование и секрецию интерлейкина-17 (ИЛ-17) и интерферона-у (ИФ-у) Т-лимфоцитами in vitro по сравнению с контролем [12]. Таким образом, финголимод повышал число уд Т-лимфоцитов, способных ограничивать активность Th1 и Th2 эффекторных Т-лимфоцитов, что может быть новым иммунологическим механизмом действия препарата [12].
В нейронах и их предшественниках экспрес-сированы S1Pb S1P3 и, в меньшей степени, S1P2. Нокаут гена S1P1 или комбинированный нокаут генов SphK1 и SphK2 у мышей вызывали тяжёлые нарушения нейрогенеза, апоптоз клеток, снижали пролиферацию нейробластов, что вело к возникновению дефектов невральной трубки. S1P/ S1P: повышали пролиферацию и дифференци-ровку стволовых клеток нервной системы и их миграцию в очаги экспериментальных поражений спинного мозга. Воздействие фоосфорили-
рованного S1P in vitro на кортикальные нейроны и нейроноподобные эмбриональные стволовые клетки зависимо от концентрации повышало фо-сфорилирование ERK1/2 и транскрипцию мРНК фактора транскрипции CREB и мозгового нейро-трофического фактора BDNF [13]. В ОДЦ экс-прессируется S1P5 и, в меньшей степени, S1P:, S1P2 и S1P3.
Воздействие фосфорилированного финголи-мода в низких концентрациях на ОДЦ in vitro стимулировало их дифференцировку, тогда как S1P в высоких концентрациях, напротив, подавлял миграцию и дифференцировку предшественников ОДЦ. Фосфорилированный финголимод оказывал протективное действие в отношении апопто-за ОДЦ в бессывороточной среде, при отсутствии глюкозы, факторов роста, при воздействии про-воспалительных цитокинов или вследствие активации микроглии.
Астроциты по современным представлениям играют ведущую роль в патогенезе рассеянного склероза. Активация металлопротеиназ астроци-тов является важным фактором повышения проницаемости ГЭБ. Астроциты экспрессируют молекулы адгезии, секретируют хемокины и способствуют инфильтрации тканей клетками-эффекторами воспаления. Секреция фактора-а некроза опухолей (ФНО-а) и лимфотоксина-а введет к гибели ОДЦ и повреждению аксонов. Астроциты экспрессируют S1P:, S1P3 и меньше другие рецепторы S1P. Экспрессия S1P: и S1P3 повышена в очагах поражения ЦНС у больных рассеянным склерозом. Введение S1P мышам ин-тракраниально вызывало у них астроглиоз, тогда как фосфорилированный финголимод in vitro подавлял образование провоспалительных цитоки-нов в культуре астроцитов.
Влияние финголимода на ремиелиниза-цию является еще одним важным фактором его терапевтического действия. На моделях рассеянного склероза было показано стимулирующее действие препарата на ремиелини-зацию. Финголимод снижал гибель ОДЦ и разрушение миелина, вызванных лизофосфа-тидилхолином в срезах мозжечка. Полагают, что финголимод предотвращает гибель вновь образующихся олигодендроцитов и способствует ремиелинизации. Финголимод усиливает микроглиоз в нервной ткани, что также способствует ремиелинизации. С другой стороны, положительное влияние финголимода на ремиелинизацию не подтверждалось на моделях купризоновой демиелинизации спинного мозга крыс, что свидетельствует о том, что действие финголимода может зависеть от микроокружения очагов демиелинизации [14]. Финголимод повышал число дендритных клеток и моноцитов в периферической крови боль-
ОБЗОРЫ
ных рассеянным склерозом, снижал образование ФНО-а и ИЛ-12 в дендритных клетках. Финголимод in vitro подавлял образование ИФ-Y в стимулированных липополисахаридом дендритных клетках и моноцитах [15].
Иммунодепрессивное действие финголи-мода связано с повышенным риском инфекционных осложнений у больных, что отражено в рекомендациях FDA по применению препарата [1]. В настоящее время нет данных о повышенном риске развития злокачественных новообразований, связанных с применением финголимода, однако в экспериментах показана возможность снижения противоопухолевого иммунитета. Трансгенные мыши, экспресси-рующие Т-клеточные рецепторы, распознающие опухолеспецифические антигены миело-мы МОРС 315 и В-клеточной лимфомы F 9, были устойчивы к развитию этих опухолей после их подкожной инокуляции. При этом после инокуляци активировались CD4+ Т-клетки, которые затем приобретали Th1 фенотип, мигрировали в опухоли и секретировали ИФ-у. Эти процессы вели к усилению макрофагаль-ной инфильтрации и эрадикации опухолевых клеток. Финголимод подавлял отторжение опухолей, препятствуя миграции CD4+ Т-кле-ток в опухоли и активации макрофагов. Однако в этих экспериментах финголимод был использован в дозах 1—2 мг/кг/день, значительно превосходящих его терапевтические дозы у человека [16].
Финголимод и его метаболиты существенно подавляют транспортную активность Р-глико-протеина в капиллярах и способствуют снижению выведения и повышению накопления лекарственных препаратов в ткани мозга. Финголимод в 5 раз повышал накопление вера-памила, лоперамида и паклитакселя в перфузи-руемом мозге крыс по сравнению с контролем. Этот новый механизм действия финголимода может быть использован для повышения транспорта лекарственных препаратов через ГЭБ и накопления их в ЦНС [17].
Побочное действие финголимода во многом обусловлено его влиянием на рецепторы S1P. S1P:, S1P2 и S1P3 являются основными типами рецепторов в сердечно-сосудистой системе. Взаимодействие финголимода с рецепторами S1P предсердий ведет к активации калиевых каналов, активируемых G-белками, гиперполяризации клеточной мембраны, снижению возбудимости и частоты потенциалов действия в кардиомиоци-тах. У человека этот эффект связан с S1P:. По результатам клинических исследований FREEDOMS и TRANSFORMS отмечено снижение частоты сердечных сокращений (максимально на 8 ударов в мин) у больных, получавших финголи-
мод в дозе 0,5 мг в день [18]. Финголимод может вызывать зависимое от дозы нарушение атрио-вентрикулярной проводимости. Среднее время удлинения интервала P—R составило 4,5 мс и 11 мс (атриовентрикулярная блокада I степени) у больных, получавших препарат в дозах 0,5 мг и 1,25 мг в день соответственно. Эндотелиальные клетки экспрессируют в основном S1P: и, в меньшей степени S1P2 и S1P3. Действие финголимода на эндотелиальные клетки носит разнонаправленный характер и может вести как к повышению, так и к снижению барьерных функций эндотелия. Воздействие финголимода на S1P3 вызывает сокращение гладкомышечных клеток сосудов, однако стимулирует образование оксида азота в эндотелии, поэтому интегральный эффект финголимода обусловлен взаимодействием этих разнонаправленных процессов. По данным фазы III клинических исследований, финголимод вызывал незначительное повышение систолического и диастолического артериального давления в первые 6 месяцев лечения. Влияние финголимода на дыхательную систему проявляется в кашле (у 5—10% больных, получавших препарат по сравнению с 4—8% в контроле), диспноэ (у 2—7% леченных больных по сравнению с 2—5% в контроле), снижении объёма форсированного выдоха на 3,1% у леченых больных и 2,0% в контроле), диффузионной способности для СО (на 3,8% в дозе 0,5 мг и 2,7% в контроле). Финголимод может вызывать обратимое повышение активности печеночных ферментов, преимущественно аланинами-нотрансферазы. Возрастание активности аспарта-таминотрансферазы и повышение концентрации билирубина в сыворотке крови является редким. По результатам клинических исследований повышение активности аланинаминотрансферазы в 3 раза и более и в 10 раз и более отмечалось у 8 и 0,2% больных соответственно, получавших препарат в дозе 0,5 мг. Финголимод в дозах 0,5 мг и 1,25 мг вызывал развитие макулярного отёка у 0,3 и 1,1% больных соответственно [13].
Изучение механизмов действия финголимода и связи «структура—активность» в ряду его аналогов привели к разработке антагониста рецепторов S1P 1-(гидроксиметил)-3-(3-октилфе-нил)циклобутана (VPC03090). В экспериментах было установлено противоопухолевое действие препарата на карциному Льюиса и карциному молочных желез 4Т1 у мышей, что позволяет рассматривать его в качестве потенциального противоопухолевого средства [19].
Дальнейшее изучение молекулярных, биохимических и клеточных механизмов действия фармакологических регуляторов трансдукции сигналов фосфолипидных медиаторов является важной основой для создания новых иммуномо-дуляторов и противоопухолевых средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. NDA 02257-FDA approved labeling text for Gilenya (fiingolimod) capsules/ September 21, 2010.http://www.accessdata.fda.gov.
2. Billich A., Bonmancin F, Devay P. et al. Phosphorilation of the immunomodulatory drug FTY720 by sphingosine kinase. J Biol Chem 2003; 278: 47408—47415.
3. Paugh S.W., Payne S.G., Barbour S.E. et al. The immunosupressant FTY720 is phosphorilated by sphingosine kinase type 2. FEBS Lett 2003; 554: 189—193.
4. Spiegel S, Milstein S. Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signalling lipid. Nat Res Mol Cell Biol 2003; 4: 397—407.
5. Ishii I., Fukushima N, Ye X., Chung J. Lysophospholipid receptors: signalling and biology. Annu Rev Biochem 2004; 73: 321—354.
6. Schwab S.R., Pereira J.P., Matloullian M. et al. Lymphocyte sequestration through S1P lyase inhibition and disruption S1P gradients. Science 2005; 309: 1735—1739.
7. Oo M.L., Thangada S., Wu M-T. et al. Immunosupressive and anti-angiogenic sphingosine-1-phosphate receptor-1 agonists induce ubiq-uitinylation and proteasomal degradation by internalized S1P1 receptors. Nat Chem Biol 2009; 5: 428—434.
8. Kappos L.,Radue E-W, O, Konnor P. et al. A placebo-controlled trial of oral fingolimod in relapsing multiple sclerosis. N Eng J Med 2010; 362: 387—401.
9. Cohen J.A., Barkhof F, Comi G. et al. Oral fingolimod or intramuscular interferon for relapsing multiple sclerosis. N Eng J Med 2010; 362: 402—415.
10. Dehmel T, Opgenoorth B.,Hartung H. et al. The effect of fingolimod on peripheral blood mononuclear cell phenotypes: a prospective study (P02.122). Neurology 2012, 78 (Meeting abstracts 1): P02.122.
11. Sehr T, Hainke U, Thomas K. et al. Differential immunological changes in peripheral and CNS compartments during fingolimod therapy in MS (P02.087). Neurology 2012, 78 (Meeting abstracts 1): P02.087.
12. Darlington P., Ouamara N, Stonebridge I. et al. Fingolimod treatment in multiple sclerosis increases the ability of circulating yd T cells to regulate pro-inflammatory Th1 and Th2 T cell responses (S31.003). Neurology 2012, 78 (Meeting abstracts 1): S31.003.
13. Cohen J.A., Chun J. Mechanisms of fingolimod's efficacy and adverse effects in multiple sclerosis. Ann Neurol 2011; 69: 759—777.
14. Kipp M, Amor S. FTY720 on the way from the base camp to the summit of the mountain: relevance for remyelination. Mult Scller 2012; 18: 258—262.
15. Thomas K, Sehr T, Hainke U. et al. Differential effects of natalizumab and fingolimod on the innate immune system of MS patients (P04.125). Neurology 2012, 78. (Meeting abstracts 1): P04.125.
16. Lorvik K.B., Bogen B, Corthay A. Fingolimod blocks immunosurveil-lance of myeloma and B-cell lymphoma resulting in cancer development in mice. Blood 2012; 119: 2176—2177.
17. Cannon R.E., Pearle J.C., Hawkins B.T. et al. Targeting blood-brain barrier sphingolipid signalling reduces basal P-glycoprotein activity and improves drug delivery to the brain. Proc Natl Acad Sci. USA 2012; 109: 15930—15935.
18. Di Marco J.P., O'Connor P., Cohen J.A. et al. First dose effect of fingolimod: pooled safety data from two phase 3 studies (TRANSFORMS and FREEDOMS) (P830). Mult Scler 2010; 16: Suppl 10.
19. Kennedy P.C., Zhu R, Huang T. et al. Characterization of a sphingo-sine-1-phosphate receptor antagonist prodrug. J Pharmacol Exp Ther 2011; 338: 879—889.
