CC BY-ND
39
ЯНВАРЬ №1 (226)
33
МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ РИККЕТСИЙ, АНАПЛАЗМ И ЭРЛИХИЙ В ИКСОДОВЫХ КЛЕЩАХ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
И РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН
С.Н. Шпынов1,2, Н.В. Рудаков1,2, P.-E. Fournier3, D. Raoult3
MOLECULAR TYPING OF RICKETTSIAE, ANAPLASMAE AND EHRLICHIAE IN TICKS IN THE RUSSIAN FEDERATION AND THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN
S.N. Shpynov, N.V. Rudakov, P.-E. Fournier, D. Raoult
'ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, 2ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Омск,
'Université de la Méditerranée, Marseille, France
На территории РФ в иксодовых клещах генотипированы (ПЦР-секвенирование) 13 al-протеобактерий, среди них: Rickettsia sibirica — «классический» патоген, R. heilongjiangensis, R. slovaca, R. helvetica, R. aeschlimannii, R. raoultii и Anaplasma phagocytophilum — недавно описанные патогены человека. ДНК R. aeschlimannii и R. raoultii выявлена в иксодовых клещах на территории Республики Казахстан.
Ключевые слова: молекулярное титрование, риккетсии, анаплазмы, эрлихии, Российская Федерация, Республика Казахстан.
13 al-proteobacteria were genotyping (PCR-sequencing) in hard ticks in the Russian Federation, including Rickettsia sibirica — «classic» pathogen, R. heilongjiangensis, R. slovaca, R. helvetica, R. aeschlimannii, R. raoultii and Anaplasma phagocytophilum — described as human pathogens in recent decades. DNA of R. aeschlimannii and R. raoultii was found in hard ticks in the Republic of Kazakhstan. Keywords: molecular typing, rickettsiae, anaplasmae, ehrlichiae, Russian Federation, Republic of Kazakhstan.
Введение. Представители семейств Rickettsia-ceae (в составе родов Rickettsia и Orientia) и Anaplasmataceae (рода Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia и Wolbachia) из порядка Rickettsiales являются а1-протеобактериями и принадлежат к классу Proteobacteria.
В последние годы появились данные о распространении представителей родов Rickettsia, Anaplasma и Ehrlichia в иксодовых клещах на некоторых территориях Российской Федерации
(Rydkina E. et al., 1999; Alekseev A.N. et al., 2001; Telford 3 S.R. и др. 2002; Morozova O.V. et al., 2002; Eremeeva et al., 2006; Иголкина и др., 2006; Нефедова и др., 2008; Chausov et al., 2009; Рар и др., 2010 и др.).
ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора и Средиземноморский университет (Марсель, Франция) осуществили совместные молекулярно-биологические исследования иксодовых клещей, собранных
34
ЗНиСО ЯНВАРЬ №1 (226)
с территорий Российской Федерации (РФ) и Республики Казахстан (РК) на наличие a1-протеобактерий из родов Rickettsia, Anaplasma и Ehrlichia.
Материал и методы. Имаго иксодовых клещей четырех родов (Dermacentor, Ixodes, Haemaphysalis и Hyalomma) в количестве 940 экземпляров были собраны с растительности в апреле—мае 2000—2003 гг. на 11 административных территориях РФ (Воронежская, Оренбургская, Челябинская, Тюменская, Омская и Новосибирская области, Ставропольский, Алтайский, Красноярский и Приморский края, Республика Бурятия) и 3 территориях РК (Карагандинская, Алма-Атинская и Восточно-Казахстанская области).
Идентификация клещей была осуществлена по морфологическим признакам (Померанцев Б.И., 1950; Филиппова Н.А. 1977). Исследование иксодовых клещей осуществлялось индивидуально.
Фрагмент ompA гена, специфичный для всех риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) 590 пар оснований (п.о.) был ампли-фицирован и секвенирован с использованием праймеров Rr190.70p и Rr190.701n (Fournier PE et al., 1998). Две пары праймеров CS1d — CS535r и CS409d — RP1258n были использованы для амплификации гена цитрат синтетазы (gltA) (Roux et al., 1997). ДНК анаплазм и эрлихий была ам-плифицирована в ПЦР с применением пары праймеров 16SEHRD/16SEHRR амплифици-рующей фрагмент 345 п.о. 16S рРНК известных анаплазм и эрлихий (Parola et al., 2001).
ПЦР осуществляли в термоциклере Peltier PTC-200 (MJ Research, Inc, Watertown, MA) как описано (Roux et al., 1997). В качестве положительного контроля использовали ДНК Rickettsia montanensis и Ehrlichia canis, в качестве отрицательного контроля — дистиллированную воду. Положительные ПЦР-продукты были очищены с применением QIAquick PCR purification kit (Qiagen) и секвенированы с использованием d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) на автоматическом секвенаторе ABI 3100 PRISM (Applied Biosystems). Полученные нуклеотидные последовательности были идентифицированы в режиме прямого доступа в GenBank.
Результаты и обсуждение. Проведенный скрининг позволил выявить в иксодовых клещах несколько видов патогенных для человека микроорганизмов, среди них «классический» патоген — Rickettsia sibirica и риккетсии, отнесенные к «новым» патогенам: «R. heilongjiangensis», R. slovaca, R. helvetica, R. aeschlimannii, а так же A. phagocytophilum.
ДНК R. sibirica была выявлена у 4 из 33 экземпляров клещей Dermacentor nuttalli, собранных на территории Красноярского края (сбор D. nuttalli был осуществлен только на этой административной территории) в очагах клещевого риккетсиоза (КР). Ранее этот вид риккетсий был
генотипирован в 12 % клещей D. nuttalli, собранных в очагах КР на территории Республики Алтай (Rydkina et al., 1999).
«R. heilongjiangensis» была выявлена у 7 из 91 (7,7 %) экземпляра клещей Haemaphysalis concinna, собранных на территориях Алтайского (4 из 20), Красноярского (2/56/3,57 %) и Приморских (2 из 15) краев. Этот вид риккетсий также обнаружен в 1 из 33 экземпляров клещей D. nuttalli, собранных на территории Красноярского края. В Хабаровском крае в 2002 г. у 13 пациентов с клинической картиной, напоминающей КСТ, в образцах крови и биоптатах с места первичного аффекта была генотипирована «R. heilongjiangensis» (Mediannikov et al., 2004).
ДНК R. slovaca выявлена в двух пробах клещей D. marginatus, собранных в Европейской части РФ на территориях Ставропольского края (1 из 3 проб) и Воронежской области (1 из 2 проб). R. slovaca недавно отнесена к патогенным для человека риккетсиям, вызывает синдром «TIBOLA» — (от англ.-«tick-borne lymphadenopathy»), характеризующийся первичным аффектом в волосистой части головы и увеличением затылочных лимфоузлов (Raoult et al., 1997).
При исследовании 122 экземпляров клещей Ixodes persulcatus, собранных на территории Омской области, в 1 (0,82 %) пробе была генотипирована риккетсия, имеющая 99,7 % соответствия по гену gltA с R. helvetica. R. helvetica была впервые описана в Швейцарии в 1979 г. (Burgdorfer et al., 1979) и в дальнейшем была генотипирована в клещах этого рода в ряде стран Европы, однако ее патогенность для человека была продемонстрирована только в 1997 г. (Fournier et al., 2000).
ДНК риккетсии, имеющей высокую степень гомологии с R. aeschlimannii по gltA (99,8 %) и ompA (99,8 %) генам, впервые выявлена в Европейской части РФ в Ставропольском крае (R. aeschlimannii штамм Stavropol) в 8 из 40 исследованных экземпляров клещей Hyalomma marginatum marginatum. В Алма-Атинской области РК Rickettsia aeschlimannii была обнаружена в 2 из 36 экземпляров клещей Haemaphysalis punctata. Первое документальное подтверждение инфекции, вызываемой R. aeschlimannii, было получено у пациента, вернувшегося во Францию из Марокко (Raoult et al., 2002).
В результате проведенного скрининга рик-кетсий в иксодовых клещах на территории РФ удалось установить географическое распространение R. raoultii (геновариант RpA4, DnS14 и DnS28). R. raoultii (геновариант RpA4) была впервые выявлена в клещах R. pumilio в Астраханской области (Rydkina et al., 1999). ДНК Rickettsia raoultii (геновариант RpA4) была выявлена в клещах D. reticulatus на территории Воронежской и Челябинской областей, в клещах D. marginatus и D. reticulatus на территориях Оренбургской, Омской и Новосибирской областей. На территории Алтайского края эта риккетсия была выявлена в клещах D. reticulatus, D. marginatus, H. concinna и I. persulcatus.
ЯНВАРЬ №1 (226)
35
R. raoultii (геновариант DnS14 и DnS28) была впервые выявлена в Республике Алтай в клещах D. nuttalli (Rydkina et al., 1999). ДНК R. raoultii (геновариант DnS14) была выявлена в клещах D. marginatus на территории Оренбургской области и Алтайского края, в клещах D. nuttalli на территории Красноярского, Приморского краев и Республики Бурятия, в клещах D. silvarum на территории Приморского края и Республики Бурятия. Находки ДНК R. raoultii (геновариант DnS28) были ограничены территориями Красноярского края и Республики Бурятия, где эта риккетсия обнаружена в клещах D. nuttalli и D. silvarum соответственно.
В Республике Казахстан R. raoultii RpA4 была генотипирована в Карагандинской области в клещах D. niveus и D. marginatus, там же R. raoultii DnS14 была выявлена в клещах D. niveus. В Восточно-Казахстанской области R. raoultii RpA4 была выявлена в клещах D. marginatus.
R. raoultii была недавно описана (Mediannikov et al., 2008) и включила в себя три генотипа рик-кетсий, описанных ранее: Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 (Rydkina et al., 1999). В последние годы выяснено не только широкое распространение этих риккетсий в Европе, но и их вероятная роль в возникновении синдрома TIBOLA (Parola et al., 2009).
Ранее отсутствовали данные о выявлении риккетсий в клещах рода Ixodes в РФ. Нами впервые выявлен новый вид риккетсий в клещах I. persulcatus, собранных на различных территориях РФ (Shpynov et al., 2003). Эта риккетсия имела 98 % соответствия по гену 16S рибосомаль-ной РНК и 96 % гомологии по гену gltA (номера GenBank AF503168 и AF503167 соответственно) с R. canadensis. «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» имеет широкое распространение на территории РФ в зоне тайги и лесостепи. Этот риккетсиаль-ный агент был обнаружен у 81 из 317 (25,5 %) исследованных клещей I. persulcatus, собранных на территориях Челябинской, Тюменской, Омской и Новосибирской областей, Алтайского, Красноярского и Приморского краев. Новый генотип риккетсий, имеющий 86 % соответствия по гену ompA с R. tamurae, был выявлен в клещах этого вида на территории Алтайского и Красноярского краев.
Проведенные исследования позволили установить, что на территории РФ в иксодовых клещах имеют распространение четыре представителя семейства Anaplasmataceae, два из них относятся к роду Anaplasma — A. phagocytophilum и A.bovis, два к роду Ehrlichia — E. muris и «Ehrlichia-like» 'Schotti variant', который генетически наиболее близок к C. ruminantium и группе моноци-тарных эрлихий (Dumler et al., 2001). В клещах I. persulcatus были выявлены A. phagocytophilum (Алтайский и Приморский край), E. muris (Тюменская, Омская, Новосибирская области и Ал-
тайский край) и «Ehrlichia-like» 'Schotti variant' (Омская область), а A. bovis (Приморский край) была генотипирована в клещах H. concinna. Три из четырех вышеперечисленных видов бактерий являются признанными патогенами теплокровных, передающимися клещами. Четвертый — «Ehrlichia-like» 'Schotti variant' был описан при исследовании клещей I. ricinus, собранных в природных очагах гранулоцитарного эрлихиоза в Нидерландах, данные о его патогенности для теплокровных отсутствуют (Schouls et al., 1999).
Нуклеотидная последовательность, имеющая 100 % гомологии с ДНК некультивируемой бактерии «Montezuma», была выявлена в клещах I. persulcatus, собранных на территориях Омской и Новосибирской областей, Алтайского и Приморского краев. На основании изучения нуклео-тидных последовательностей 16S рРНК этот микроорганизм был отнесен к порядку Rickettsiales (Медянников О.Ю. и др., 2004).
Заключение. В результате выполненного молекулярно-биологического скрининга установлено присутствие 13 а1-протеобактерий из родов Rickettsia, Anaplasma и Ehrlichia в иксодовых клещах, собранных на территориях Российской Федерации и Республики Казахстан. Среди выявленных а1-протеобактерий R. sibirica является «классическим» патогеном, R. heilongjiangensis, R. slovaca, R. helvetica, R. aeschlimannii, R. raoultii и A. phagocytophilum были описаны как патогены человека в различных регионах мира в последнее десятилетие.
Необходимо продолжение исследований по молекулярно-биологической идентификации в иксодовых клещах возбудителей инфекционных заболеваний человека в различных регионах Российской Федерации и Республики Казахстан с учетом выявления в клещах ряда «новых» патогенов, список которых пополняется.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fournier P.-E, Roux V, Raoult D. Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein rOmpA //Int J Syst Bacteriol.- 1998, Jul.- № 48, Pt 3. P. 839—849.
2. Parola P., Inokuma H., Camicas J. L., Brouqui P., Raoult D. Detection and identification of spotted fever group Rickettsiae and Ehrlichiae in African ticks //Emerg Infect Dis.- 2001. N 7. 1014—1017.
3. Roux V., Rydkina E., Eremeeva M., Raoult D. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae // Int J Syst Bacteriol.,1997. N 47. P. 252—261.
Контактная информация:
Шпынов Станислав Николаевич, тел.: 8-3812-62-93-29, e-mail: [email protected]
Contact information: Shpynov Staniclav, phone: 8-3812-62-93-29, e-mail: [email protected]
