CC BY
13
82
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2017. Т. 72. № 2. С. 82-86
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.322
МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ТЕТРАМЕРИЗАЦИОННОГО ДОМЕНА КАЛИЕВОГО КАНАЛА Kv10.2 ЧЕЛОВЕКА В РАЗЛИЧНЫХ ОЛИГОМЕРНЫХ СОСТОЯНИЯХ
В.Н. Новоселецкий*, А.Д. Волынцева, К.В. Шайтан, О.С. Соколова
Кафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 *e-mail: [email protected]
Потенциал-управляемый калиевый канал Kv10.2 экспрессируется в нервной системе, однако его функции и участие в развитии болезней человека остаются мало изученными. Мутации канала Kv10.2 были обнаружены при эпилептической энцефалопатии и аутизме. Моделирование пространственной структуры канала является важным инструментом для получения информации о молекулярных аспектах его функционирования и механизмах, ответственных за патогенез. В настоящей работе выполнено молекулярное моделирование спирального фрагмента C-концевого домена канала Kv10.2 человека (hEAG2) в димерной, тримерной и тетрамерной формах. Стабильность всех форм подтверждена расчётами методом молекулярной динамики. Выявлены контакты и взаимодействия, стабилизирующие структуру.
Ключевые слова: потенциал-управляемый калиевый канал Kv10.2, олигомеризация, лей-циновая застёжка, суперспираль, молекулярное моделирование, молекулярная динамика
Потенциал-управляемые калиевые каналы контролируют перенос ионов K+ через клеточную мембрану и играют ключевую роль в возбудимых и невозбудимых клетках. Канал Kv10.2 (кодируемый геном KCNH5) принадлежит семейству ether-a-go-go (EAG) и экспрессируется в нервной системе [1].
Мутации каналов семейства EAG вызывают нарушение синаптической пластичности и памяти [2]. Нарушения функционирования канала Kv10.2 наблюдались при развитии эпилептической энцефалопатии и аутистических расстройствах [3], а также в процессе возникновения и развития опухолей [2]. Несмотря на предпринятые попытки исследования канала Kv10.2, его функционирование в нервной системе и вовлеченность в развитие заболеваний человека остаются недостаточно изученными [3, 4].
Анализ гена KCNH5, клонированного незадолго до завершения проекта "Геном человека" [5, 6], показал, что канал Kv10.2 обладает топологией, сходной с другими калиевыми потенциал-управ-ляемыми каналами (Kv): шесть трансмембранных спиралей в каждой из четырёх субъединиц. Структура цитоплазматического домена потенциал-управ-ляемых каналов сильно варьирует между различными семействами [7]. C-концевой домен необходим для корректной сборки тетрамерного канала [8], причём межспиральные взаимодействия определяют не только стабильность, но и селективность муль-тимеризации [9]. Показано, что С-концевой домен канала Kv7.1, гомологичного семейству EAG, имеет две функциональные части, причём проксимальная половина ответственна за экспрессию, сво-
рачивание и проницаемость канала, а дистальная — за направление сворачивания и специфичность связывания с партнерами [10].
Информация о пространственной структуре мембранных белков, в т.ч. ионных каналов, а также их комплексов с различными лигандами является важным условием для понимания механизмов функционирования этих белков. До недавнего времени структура калиевых каналов семейства ЕЛО была неизвестна, хотя и был предпринят ряд попыток моделирования [3, 11—13]. Теперь же ситуация коренным образом изменилась, поскольку была расшифрована структура большей части гомологичного канала Ку10.1 (ЕЛО1) [14], которая может быть использована для моделирования взаимодействия каналов семейства ЕЛО с блокаторами [15]. В то же время, структура протяженного С-концевого участка канала ЕЛО2 (723—988 а.о.) по-прежнему остается неизвестной. Ранее мы показали, что полноразмерные каналы Ку10.2 образуют кластеры, которые солокализуются с актиновым цитоскелетом [7]. Недавно мы установили, что каналы Ку10.2 с удаленным М-концевым доменом также способны к кластеризации [16]. Логично предположить, что во взаимодействии с актином принимают участие С-концевые фрагменты каналов.
Для того, чтобы понять, как спиральные фрагменты С-концевого домена канала Ку10.2 олиго-меризуются в составе полноразмерного канала, мы провели моделирование структуры этого фрагмента в димерной, тримерной и тетрамерной формах. Для анализа стабильности полученных олигомеров
использовали расчеты методом молекулярной динамики (МД), что позволило установить контакты и взаимодействия, стабилизирующие структуру оли-гомеров. Результаты проведенной работы могут быть использованы для анализа влияния возникающих мутаций на структуру и функционирование канала EAG2.
Материалы и методы
Построение идеальных a-спиралей, сборка пучков параллельных спиралей и визуализация структур выполнены в программе Maestro (Schrodinger, LLC). Расчеты методом МД выполнены в программе Gromacs [17] с использованием силового поля CHARMM22. Конформеры извлечены из равновесного участка траектории с шагом 100 пс. Для каждого конформера выполнены расчеты параметров суперспиралей с помощью программы TWISTER [18] и энергии взаимодействия с помощью программ APBS [19] и FoldX [20]. Для предсказания олиго-мерного состояния суперспирали на основе ее аминокислотной последовательности использован веб-сервис LOGICOIL [21].
Результаты и обсуждение
C-концевой спиральный фрагмент внутриклеточного домена канала Kv10.2 (EAG2) содержит пять гептадных повторов, характерных для суперспиралей (рисунок, А). Для анализа степени оли-гомеризации этого фрагмента мы использовали методы молекулярного моделирования. Структурные модели фрагмента в конформации a-спирали были построены de novo, а затем объединены с образованием димера, тримера и тетрамера. Для полученных моделей была проведена оптимизация и последующий расчет методом МД в водном растворе в течение 15 нс. Во всех случаях произошло образование стабильных левозакрученных суперспиралей (рисунок, Б, В, Г).
Геометрические параметры суперспиралей являются характеристиками плотности их упаковки и стабильности. Мы сопоставили параметры модельных суперспиралей с параметрами аналогичных суперспиралей, пространственная структура которых известна: димерной формой тропомиозина (pdb-код 3u1a [22]), а также тримерной (pdb-код 3hfe [23]) и тетрамерной (pdb-код 3bj4 [10]) формами C-концевого спирального фрагмента калиевого канала Kv7.1 (табл. 1). Хорошее соответствие радиусов модельных суперспиралей радиусам суперспиралей в экспериментально полученных структурах говорит о достижении плотной упаковки модельных спиралей в процессе расчета. В то же время такие параметры суперспирали, как шаг и вычисляемое на его основе число остатков на виток, в модельных суперспиралях демонстрируют значительно большие значения по сравнению с экспериментально полученными. Гораздо большим
Рисунок. Структура С-концевого спирального фрагмента внутриклеточного домена канала Ку10.2 (ИЕЛ02) (908—948 а.о.). Первичная структура и обозначения остатков по суперспиральному регистру (гидрофобные остатки и соответствующие позиции, преимущественно а и d, показаны жирным шрифтом) (А). Остатки R и Е из мотива R-h-x-x-h-E (см. текст) отмечены ромбами. Представлены общий вид пространственной структуры (Б, В, Г), ионные и водородные связи остатков Л^927 и 01и932 (Д, Е, Ж) и контакты остатков Мй928 и Leu931 (З, И, К) для димерной, тримерной и тетрамерной суперспиралей соответственно. В обозначении остатков первая буква соответствует субъединице
оказывается и разброс этих параметров, причиной которого, по-видимому, является несимметричность отдельных конформеров модельных суперспиралей, вызванная значительной подвижностью суперспиралей в процессе расчёта. Как и в случае с тример-ной и тетрамерной формами канала Ку7.1, меньший шаг суперспирали позволяет предположить, что тримерная форма канала Ку10.2 имеет более плотную закрутку вокруг оси суперспирали. Между тем параметры индивидуальных а-спиралей (число остатков на виток, шаг спиралей и т.п.) во всех моделях являются практически идентичными.
Поддержание стабильности олигомерной структуры суперспиралей обеспечивается большим количеством полярных и ионных взаимодействий и гидрофобных контактов. Последние обусловлены гидрофобными остатками мотива "лейциновой застежки" (Ьеи910, Уа1913, Ьеи917, 11е921, Ьеи924, Ме1928, Ьеи931, Уа1935, Ьеи939, Ьеи942) (рисунок, Л), и их стремление минимизировать свои контакты
Таблица 1
Параметры ряда суперспиралей, рассчитанные с помощью программы TWISTER, и значения энергия взаимодействия (ккал/моль) в олигомерах C-концевого спирального фрагмента канала Kv10.2 в расчёте на одну субъединицу, рассчитанные с помощью программ
APBS и FoldX (среднее ± стандартное отклонение)
Димеры Тримеры Тетрамеры
Kv10.2 Тропомиозин Kv10.2 Kv7.1 Kv10.2 Kv7.1
Геометрические параметры суперспиралей
Радиус суперспирали (А) 5,0 ± 0,4 4,7 ± 0,6 6,5 ± 0,2 6,2 ± 0,2 7,3 ± 0,7 7,5 ± 0,2
Число остатков на виток суперспирали 90 ± 80 100 ± 20 120 ± 80 85 ± 12 180 ± 100 125 ± 20
Шаг суперспирали (А) 140 ± 120 150 ± 30 180 ± 120 125 ± 20 270 ± 150 181 ± 20
Геометрические параметры спиралей
Радиус спирали (А) 2,27 ± 0,12 2,29 ± 0,03 2,3 ± 0,2 2,29 ± 0,04 2,28 ± 0,08 2,30 ± 0,03
Число остатков на виток спирали 3,65 ± 0,12 3,62 ± 0,05 3,7 ± 0,2 3,62 ± 0,05 3,66 ± 0,09 3,61 ± 0,05
Значения энергии в расчёте на одну субъединицу
APBS -22 ± 10 -39 ± 13 -36 ± 13
FoldX -32 ± 4 -35 ± 5 -45 ± 6
с полярным растворителем является движущей силой олигомеризации. Водородные и ионные связи образуются между заряженными остатками спиралей, в число которых входят О1и912, Lys914, О1и916, Lys918, 01и920, Л^927 и О1и932 (рисунок, А). Нужно заметить, что образование таких связей в димерах бывает стерически затруднено ввиду расположения объёмных гидрофобных остатков между заряженными (Рисунок, Д, З).
Непосредственной характеристикой, позволяющей оценить стабильность той или иной олиго-мерной формы, является энергия взаимодействия в олигомере в расчёте на один мономер. Результаты расчёта этой энергии, выполненные с помощью программ ЛРВ8 [19] и Fo1dX [20] (табл. 1), не позволяют отдать предпочтение какой-либо из форм. Представляется достоверной лишь меньшая энергия взаимодействия в димере по сравнению с тетраме-ром, что согласуется с большей экспонированно-стью гидрофобных остатков и затрудненным образованием водородных и ионных связей между спиралями в димере.
Аналогичный результат на качественном уровне может быть получен на основе анализа самой аминокислотной последовательности (табл. 2). Меньшая степень олигомеризации в сочетании с меньшей длиной вовлеченной а-спирали ранее была обнаружена и для аналогичного фрагмента канала КУ7.1 [23].
Ранее предполагалось, что признаком склонности спиралей к тримеризации является наличие мотива R-h-x-x-h-E (где R — остаток аргинина, И — гидрофобный остаток, х — произвольный остаток, Е — остаток глутамата), консервативного среди суперспиралей, для которых характерно тримерное
состояние [24] (рисунок, А). В то же время, к настоящему времени известно как минимум две структуры, содержащие мотив R-h-x-x-h-E и закристаллизованные в тетрамерном состоянии — это структуры фрагмента канала Ку7.1 (pdb-код 3Ьд4 [10]) и Ку7.4 (pdb-код 2отс [25]).
Таблица 2
Зависимость предсказываемой степени олигомеризации ^концевого спирального фрагмента канала &10.2 от порогового значения вероятности суперспирализации (по данным веб-сервиса LOGICOIL)
Значение порога Вероятная длина спирали, вовлеченной в суперспирализацию, а.о. Наиболее вероятные состояния
Первое Второе
10% 44 Тетрамер Параллельный димер
50% 37 Тетрамер Тример
90% 28 Тример Антипараллельный димер
Проведенное в данной работе моделирование показывает, что C-концевой спиральный фрагмент канала Kv10.2 (EAG2) может образовывать стабильные димерные, тримерные и тетрамерные супер-i спирали, причём наибольший вклад в их стабилиза-i цию вносят гидрофобные контакты. Созданная нами модель выявляет детали взаимодействия субъединиц и может быть использована для выявления 5 роли аминокислотных замен, наблюдаемых в ряде патологий. Отметим, что для определения степени , олигомеризации цитоплазматических участков каналов семейства EAG необходимо расшифровать 5 структуру полноразмерного канала.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (грант №14.616.21.004 от 09.10.15, про-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Saganich M.J., Vega-Saenz de Miera E., Nadal M.S., Baker H., Coetz.ee W.A., Rudy B. Cloning of components of a novel subthreshold-activating K(+) channel with a unique pattern of expression in the cerebral cortex // J. Neurosci. 1999. Vol. 19. N 24. P. 10789-10802.
2. Asher V., Sowter H., Shaw R., Bali A., Khan R. Eag and HERG potassium channels as novel therapeutic targets in cancer // World J. Surg. Oncol. 2010. Vol. 8. N 1. P. 113.
3. Yang Y., Vasylyev D.V., Dib-Hajj F., Veeramah K.R., Hammer M.F., Dib-Hajj S.D., Waxman S.G. Multistate structural modeling and voltage-clamp analysis of epilepsy/ autism mutation Kv10.2-R327H demonstrate the role of this residue in stabilizing the channel closed state // J. Neurosci. 2013. Vol. 33. N 42. P. 16586-16593.
4. Wulff H., Pardo L.A., Castle N.A. Voltage-gated potassium channels as therapeutic targets // Nat. Rev. Drug Discov. 2009. Vol. 8. N 12. P. 982-1001.
5. Ju M., Wray D. Molecular identification and characterisation of the human eag2 potassium channel // FEBS Lett. 2002. Vol. 524. N 1-3. P 204-210.
6. Schonherr R., Gessner G., Lober K., Heinemann S.H. Functional distinction of human EAG1 and EAG2 potassium channels // FEBS Lett. 2002. Vol. 514. N 2-3. P. 204-208.
7. Karlova M.G., Pischalnikova A.V., Ramonova A.A., Moisenovich M.M., Sokolova O.S., Shaitan K.V. In vitro fluorescence assay to study the folding of Kv ion channels // Biophysics. 2011. Vol. 56. N 2. P. 243-249.
8. Ludwig J., Owen D., Pongs O. Carboxy-terminal domain mediates assembly of the voltage-gated rat ether-á-go-go potassium channel // EMBO J. 1997. Vol. 16. N 21. P. 6337-6345.
9. Jenke M., Sánchez. A., Monje F., Stühmer W., Weseloh R.M., Pardo L.A. C-terminal domains implicated in the functional surface expression of potassium channels // EMBO J. 2003. Vol. 22. N 3. P. 395-403.
10. Wiener R., Haitin Y., Shamgar L., Fernández-Alonso M.C., Martos A., Chomsky-Hecht O., Rivas G., Attali B., Hirsch J.A. The KCNQ1 (Kv7.1) COOH terminus, a multi-tiered scaffold for subunit assembly and protein interaction // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283. N 9. P. 5815-5830.
11. Ju M., Wray D. Molecular regions responsible for differences in activation between heag channels // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. Vol. 342. N 4. P. 1088-1097.
12. Stevens L., Ju M., Wray D. Roles of surface residues of intracellular domains of heag potassium channels // Eur. Biophys. J. 2009. Vol. 38. N 4. P. 523-532.
13. Sokolova O.S., Shaitan K.V., Grizel A.V., Popina-ko A.V., Karlova M.G., Kirpichnikov M.P. Three-dimensional structure of human voltage-gated ion channel kv10.2 studied by electron microscopy of macromolecules and molecular modeling // Russ. J. Bioorganic Chem. 2012. Vol. 38. N 2. P. 152-158.
ект RFMEFI61615X0044) с использованием ресурсов суперкомпьютерного комплекса МГУ имени М.В. Ломоносова [26].
14. Whicher J.R., MacKinnon R. Structure of the voltage-gated K+ channel Eagl reveals an alternative voltage sensing mechanism // Science. 2016. Vol. 353. N 6300. P. 664-669.
15. Novoseletsky V.N., Volyntseva A.D., Shaitan K.V., Kirpichnikov M.P., Feofanov A.V. Modeling of the binding of peptide blockers to voltage-gated potassium channels: Approaches and evidence // Acta Naturae. 2016. Vol. 8. N 2. P. 35-46.
16. Glukhov G.S., Popinako A.V., GrizelA.V., Shaitan K.V., Sokolova O.S. The structure of a human voltage-gated potassium Kv10.2 channel which lacks a cytoplasmic pas domain // Biophysics. 2016. Vol. 61. N 4. P. 591-595.
17. Van Der Spoel D., Lindahl E., Hess B., Groenhof G., Mark A.E., Berendsen H.J.C. GROMACS: Fast, flexible, and free // J. Comp. Chem. 2005. Vol. 26. N 16. P. 1701-1718.
18. Strelkov S.V., BurkhardP. Analysis of a-helical coiled coils with the program TWISTER reveals a structural mechanism for stutter compensation // J. Struct. Biol. 2002. Vol. 137. N 1-2. P. 54-64.
19. Baker N.A, Sept D., Joseph S., Holst M.J., McCam-mon J.A. Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. Vol. 98. N 18. P. 10037-10041.
20. Schymkowitz J., Borg J., Stricher F., Nys R., Rousseau F., Serrano L. The FoldX web server: an online force field // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33. Suppl. 2. P W382-W388.
21. Vincent T.L., Green P.J, Woolfson D.N. LOGICOIL -multi-state prediction of coiled-coil oligomeric state // Bio-informatics. 2013. Vol. 29. N 1. P 69-76.
22. Rao J.N., Rivera-Santiago R., Li X.E., Lehman W., Dominguez R. Structural analysis of smooth muscle tropomyosin a and P isoforms // J. Biol. Chem. 2012. Vol. 287. N 5. P. 3165-3174.
23. Xu Q., Minor D.L. Crystal structure of a trimeric form of the K(V)7.1 (KCNQ1) A-domain tail coiled-coil reveals structural plasticity and context dependent changes in a putative coiled-coil trimerization motif // Protein Sci. 2009. Vol. 18. N 10. P. 2100-2114.
24. Kammerer R., Kostrewa D., Progias P., Honnappa S., Avila D., Lustig A., Winkler F.K., Pieters J., Steinmetz M.O. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005. Vol. 102. N 39. P. 13891-13896.
25. Howard R.J., Clark K.A., Holton J.M., Minor D.L. Structural insight into KCNQ (Kv7) channel assembly and channelopathy // Neuron. 2007. Vol. 53. N 5. P. 663-675.
26. Sadovnichy V., Tikhonravov A., Voevodin V., Opana-senko V. "Lomonosov": Supercomputing at Moscow State University // Contemporary High Performance Computing: From Petascale toward Exascale / Ed. J.S. Vetter. Boca Raton: Chapman & Hall/CRC, 2013. P. 283-307.
Поступила в редакцию 30.01.2017 Принята в печать 02.03.2017
MOLECULAR BIOLOGY
MOLECULAR MODELING OF TETRAMERIZATION DOMAIN OF HUMAN POTASSIUM CHANNEL Kv10.2 IN DIFFERENT OLIGOMERIC STATES
V.N. Novoseletsky*, A.D. Volyntseva, K.V. Shaitan, O.S. Sokolova
Department of Bioengineering, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1-12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: [email protected]
Voltage-gated potassium channel Kv10.2 is expressed in the nervous system, but its functions and involvement in the development of human disease remain poorly understood. Mutant forms of Kv10.2 channel were found in patients with epileptic encephalopathy and autistic features. Molecular modeling of the channel spatial structure is an important tool for gaining knowledge about the molecular aspects of the channel functioning and mechanisms responsible for the pathogenesis. In the present work, we performed molecular modeling of the helical fragment of the human Kv10.2 (hEAG2) C-terminal domain in dimeric, trimeric and tetrameric forms. The stability of all forms was confirmed by molecular dynamics simulation. Contacts and interactions, stabilizing the structure, were identified.
Keywords: voltage-gated potassium channel Kv10.2, oligomerization, leucine zipper, coiled coil, molecular modeling, molecular dynamics.
Сведения об авторах
Новоселецкий Валерий Николаевич — канд. физ-мат. наук, доц. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-57-38; e-mail: [email protected]
Волынцева Алёна Дмитриевна — мл. науч. сотр. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-57-38; e-mail: [email protected]
Шайтан Константин Вольдемарович — докт. физ-мат. наук, проф., зам. зав. кафедрой биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-57-38; e-mail: [email protected]
Соколова Ольга Сергеевна - докт. биол. наук, проф. кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-57-38; e-mail: [email protected]
