Научная статья на тему 'Молекулярно-генетический анализ гена гемагглютинина штамма вируса гриппа а подтипа Н5, изолированного на юге Западной Сибири в 2003 году'

Молекулярно-генетический анализ гена гемагглютинина штамма вируса гриппа а подтипа Н5, изолированного на юге Западной Сибири в 2003 году Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
117
51
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА / ДИАГНОСТИКА

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Разумова Ю. В., Букин Ю. С., Беклемишев А. Б., Шестопалов A. M.

The hemagglutinin gene of influenza virus strain A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 (H5) isolated from mallard (Anas platyrhynchos) in the south of Western Siberia in 2003 was analyzed genetically. The analysis showed that strain A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 is low pathogenic and its hemagglutinin gene phylogenetically is far from hemagglutinin genes of highly pathogenic H5N1 viruses isolated in various regions of Eurasia, including in the south of Western Siberia in 2005. Results of the analysis come in accordance with the concept that till 2005 wild water-waders were the long-term reservoir of low pathogenic avian influenza viruses only.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Разумова Ю. В., Букин Ю. С., Беклемишев А. Б., Шестопалов A. M.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Молекулярно-генетический анализ гена гемагглютинина штамма вируса гриппа а подтипа Н5, изолированного на юге Западной Сибири в 2003 году»

УДК 578.832.1:578.5].083.2

Ю.В. Разумова, Ю.С. Букин, А.Б. Беклемишев, А.М. Шестопалов

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНА ГЕМАГГЛЮТИНИНА ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5, ИЗОЛИРОВАННОГО НА ЮГЕ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ В 2003 ГОДУ

ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Лимнологический институт СО РАН, Иркутск ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск

Проведен генетический анализ гена гемагглютинина штамма A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 (Н5), изолированного от кряквы (Anas platyrhynchos) на юге Западной Сибири в 2003 году. Анализ показал, что этот штамм является низкопатогенным и его ген гемагглютинина филогенетически отдален от генов гемагглютинина высокопатогенных вирусов сероти-па H5N1, изолированных во многих районах Евразии в 2003-2005 гг., в том числе и на юге Западной Сибири в 2005 году. Результаты анализа согласуются с общим представлением о том, что до 2005 года дикие водно-болотные птицы являлись долговременным резервуаром лишь низкопатогенных вирусов гриппа птиц.

Ключевые слова штамм вируса гриппа, диагностика

Введение

Вирусы гриипа А, циркулирующие среди птиц, принято называть вирусами гриппа птиц (ВГП). Основным природным резервуаром этих вирусов и их естественными хозяевами являются дикие птицы водно-болотной экологической группы [1, 2]. Проникая из природных биоценозов, ВГП вызывают вспышки заболевания среди домашних птиц. Случаи заболевания и гибели людей, заразившихся этими вирусами напрямую от птиц, указывают на непосредственную опасность этих вирусов для человека [3, 4]. В настоящее время особую актуальность приобретает изучение ВГП с подтипом гемагглютинина (НА) Н5, поскольку вирусы данного сероварианта вызвали беспрецедентные по масштабам эпизоотии среди сельскохозяйственных птиц во многих районах Евразии и ответственны за гибель более 150-ти человек [5] в мире.

В результате проведенного в 2003 году на юге Западной Сибири вирусологического обследования диких птиц, от кряквы (Anas platyrhynchos) был изолирован штамм вируса гриппа подтипа Н5 A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/ОЗ и определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена гемагглютинина этого штамма [6]. Целью настоящей работы явился молекулярно-генетический анализ гена НА изолированного штамма A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03.

Материалы и методы

Нуклеотидная последовательность (длиной 1326 н.о.) гена НА штамма A/Anas platyrhynchos/ Chany Lake/9/ОЗ доступна в международной

электронной базе данных GenBank под номером DQ007623.

Множественное сравнение нуклеотидных последовательностей генов НА различных штаммов вируса гриппа подтипа Н5 осуществляли при помощи компьютерной программы GeneDoc (ver. 2.6.02). Филогенетический анализ гена НА штамма A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 проводили методом «объединения ближайших соседей (neighbor-joining, NJ)» с помощью программы MEGA2. Для оценки достоверности группирования применяли бутстреп-тест.

Результаты и обсуждение

Одной из актуальных задач в изучении вирусов гриппа птиц является выяснение путей их географического распространения. Данные об эволюционных связях вирусов гриппа, циркулирующих среди птиц различных регионов, позволяют проследить за распространением возбудителя. Поэтому в работе проведен филогенетический анализ гена НА штамма вируса гриппа A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/ОЗ. В анализ были включены штаммы вирусов гриппа А, изолированные от птиц в различных районах мира и в различное время. Поскольку известно, что гены НА высокопатогенных вирусов гриппа А сероти-па H5N1, вызвавшие эпизоотии среди сельскохозяйственных птиц в южной и юго-восточной Азии в 1997 и 2003-2004 гг., а в 2005 году широко распространившиеся по территории Евразии (в том числе и на юг Западной Сибири) принадлежат к одной генетической ветви [4, 7, 8], то для представления данной ветви в анализ были включены

только 5 штаммов этой ветви, изолированные в период с 1996 по 2005 гг.

Филогенетическое дерево генов НА подтипа Н5 вирусов гриппа А представлено на рисунке 1. Поскольку признаком достоверности для узла дерева принято считать значение индекса бутстреп-

поддержики >70, выводы о группировании штаммов на филогенетическом дереве были сделаны только для таких узлов.

Как видно из рис. 1, все штаммы ВГП из Северной Америки образуют отдельную эволюционную ветвь (кластер I). Эта ветвь является одной из двух

0.02

Рис. 1. Филогенетическое дерево генов НА подтипа Н5 вируса гриппа А. Индексы бутстреп-поддержки указаны только для узлов, где значение этих индексов больше 70. Изучаемый штамм подчеркнут. Цифрами I- VI обозначены кластеры, описание которых приведено в тексте

основных ветвей, на которые разделяется дерево. Вторая ветвь представлена штаммами из Евразии и Африки (II). Такое группирование штаммов соответствует ранее описанному в литературе [9] разделению вирусов гриппа А, циркулирующих среди птиц, на две ветви: Североамериканскую и Евроазиатскую, к которой традиционно относят штамм из Южной Африки.

Изучаемый штамм А/Апав р^угЬупсЬов/ СЬапу Ьаке/9/03 относится к Евроазиатской ветви и образует кластер (III) со штаммами, выделенными в Европе в 2005 году. Следует отметить, что все штаммы, входящие в этот кластер, были изолированы от диких птиц и, согласно описанию, приведенному в СепВапк для этих штаммов, являются низкопатогенными. Этот кластер достоверно отличается от генетической ветви (IV), включающей только высокопатогенные штаммы серотипа Н5Ш, в том числе штамм, изолированный во время эпизоотии, вызванной этими вариантами, на юге Западной Сибири в 2005 году. Это позволяет предположить, что данные высокопатогенные варианты вируса гриппа А были занесены на юг Западной Сибири позже 2003 года. В тоже время, эволюционная близость между изучаемым штаммом и штаммами, изолированными от диких птиц двумя годами позже в Европе, свидетельствует о быстром распространении вирусов гриппа А между популяциями диких птиц юга Западной Сибири и европейского региона Евразии.

Анализируя полученное филогенетическое дерево в целом, можно заключить, что нет строгой закономерности в группировании штаммов по временному или географическому признаку. Так, на филогенетическом дереве (Рис. 1) можно выделить кластеры V и VI, которые включают штаммы, изолированные примерно в один период — с 2000 по 2004 гг. и с 1999 по 2005 гг. соответственно. В тоже время в оба эти кластера входят вирусы, изолированные в одном и том же географическом регионе (Швеция) и в одно и то же время (в 2002 году). Помимо штаммов из Европы, в один из этих кластеров (V) входят и штаммы из Южной Азии. Таким образом, можно заключить, что на территории Евразии одновременно циркулируют вирусы гриппа птиц подтипа Н5 различных генетических линий, причем циркуляция вариантов, относящихся к одной генетической линии, не ограничена каким-либо небольшим географическим регионом, а наблюдается на значительно удаленных друг от друга территориях (например, в Европе и южной Азии; в Европе и Западной Сибири). Вероятно, это является следствием широких межпопуляционных контактов диких птиц, обитающих на территории Евразии [10]. Следует

отметить, что существование нескольких генет] ческих ветвей вирусов гриппа, циркулирующг среди птиц, в которых образующие их штамм не группируются ни по географическому, ни г хронологическому признаку, было обнаружен также в пределах Североамериканской линии bi русов гриппа А [И].

У вирусов гриппа А подтипа Н5 гемагглюи нин является одним из ключевых белков, onpi деляющих патогенность этих вирусов. Так, oi новным маркером патогенности серовариантс Н5 служит аминокислотная последовательное! вблизи сайта протеолитического расщеплени субъединицы НА1 гемагглютинина, различая щаяся у низкопатогенных и высокопатогенны вариантов. Наличие сайтов гликозилирования позициях 126 и/или 236 субъединицы НА1 гема] глютинина вирусов гриппа А подтипа Н5 пре/ положительно облегчает репликацию этих вирз сов в курах [12, 13], увеличивая таким образо эпизоотическую опасность таких вариантов дл сельскохозяйственных птиц, и, следовательш потенциальную опасность для здоровья человек; Кроме того, присутствие сайта гликозилировани в указанных позициях свидетельствует, что виру какое-то время циркулировал среди кур.

В связи с изложенным в данной работе бы проведен анализ выведенной аминокислотно последовательности фрагмента субъединиц] НА1 (начиная с позиции 38) изучаемого штамм A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03. Анали показал, что аминокислотная последовательност вблизи сайта протеолитического расщеплени гемагглютинина, определяющая уровень пате генности вирусов гриппа А подтипа Н5, у этог штамма имеет структуру, характерную для низ копатогенных вариантов (Рис. 2). В выведвнно: аминокислотной последовательности штамм A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 потенци альные сайты гликозилирования были найдены позициях 165 и 286, но не было обнаружено таки сайтов в позициях 126 и 236 (Рис. 2). Следует от метить, что сайты гликозилирования в позиция 165 и 286 встречаются в подавляющем болыпинс тве вирусов гриппа подтипа Н5, изолированны от птиц.

Таким образом, анализ выведенной аминокис лотной последовательности гена НА штамма А Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 показал, чт< этот штамм является представителем низкопато генных вариантов вирусов гриппа А подтипа К циркулировавших только в популяциях естест венных хозяев. Это согласуется с тем фактом, чт< наиболее филогенетически близкие ему штамм! также являются низкопатогенными и были изо лированы от диких птиц.

40

60

80

A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03: NGKLCSLKGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDNPVNG A/Mallard/Bavaria/1/2005: NGKLCSLNGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDNPVNG

* 100 * 120 *

A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03: LCYPGDFNDYEELKHLLSSTNHFEKIQIIPKSSWSNHDASSGVSSACPYNG A/Mallard/Bavaria/1/2005: LCYPGDFNDYEELKHLLSSTNHFEKIQIIPRSSWSNHDASSGVSSACPYNG

* 160 * 180 * A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03: RSSFFRNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKL A/Mallard/Bavaria/1/20 05: RSSFFRNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKL

200 * 220 * 240

A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03: YQNPTTYVSVGTSTLNQRSVPEIATRPKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINF А/Mallard/Bavaria/1/2005: YQNPTTYVSVGTSTLNQRSVPEIATRPKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINF

* 260 * 280 * A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03: ESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSDLEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFH A/Mallard/Bavaria/1/2005: ESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSGLEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFH

300 * 320

A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03: NIHPLTIGECPKYVKSDRLVLATGLRNVPQ|RETR|G//L A/Mallard/Bavaria/1/2005: NIHPLTIGECPKYVKSDRLVLATGLRNVPQRETRG//L

Puc. 2. Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей фрагмента субъединицы НА1 штаммов вирусов гриппа А/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/ОЗ и A/Mallard/Bavaria/1/2005. Аминокислотная последовательность близ сайта протеолитического расщепления гемагглютинина, определяющая патогенность вирусов гриппа А подтипа Н5, показана в прямоугольнике. Двумя косыми чертами обозначен участок расщепления гемагглютинина. Потенциальные сайты гликозилирования гемагглютинина подчеркнуты. Отличающиеся аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом

Далее нами было проведено сравнение выведенной аминокислотной последовательности (позиции 38 — 320) субъединицы НА1 изучаемого штамма A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/ОЗ с первичными структурами соответствующих участков НА1 штаммов ВГП, использованных в филогенетическом анализе (Рис. 1). Сравнительный анализ показал, что аминокислотная последовательность НА1 у изучаемого штамма отличается от наиболее ей гомологичной последовательности НА1 штамма A/Mallard/ Bavaria/1/2005 (Рис. 1) тремя аминокислотными остатками (а.о): К45, К119 и D268 (Рис. 2). Однако, ни один из этих аминокислотных остатков в указанных позициях не является уникальным. Так, а.о. К в позиции 45 встречается в гемагглюти-нине всех штаммов из Северной Америки, включенных в анализ (A/Mallard/Wisconsin/169/75, A/Mallard/Ohio/556/1987, A/Ruddy turnstone/ NJ/2242/00, A/Shorebirds/DE/101/2004, puc. 1), но не у других, более эволюционно близких изучаемому штамму. Среди всех аминокислотных последовательностей НА1, включенных в анализ, а.о. К в позиции 119 имеется только у трех высокопатогенных штаммов серотипа H5N1, образующих отдельную группу в пределах кластера IV (штаммы A/Chicken/Indonesia/BL/2003, A/Bar-headed goose/Qinghai/67/2005 и А/Duck/ Novosibirsk/56/2005, рис. 1). Аминокислотный

остаток D в позиции 268 имеется только у штамма A/Tern/South Africa/61, который, хотя и принадлежит к евроазиатской линии, значительно эволюционно удален от изучаемого штамма А/ Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 (Рис. 1). Эти данные могут свидетельствовать в пользу конвергентной эволюции вирусов гриппа А, циркулирующих среди птиц.

Заключение

Вирусы гриппа А, циркулирующие в популяциях птиц, нередко называют «эволюционно статичными» [14] из-за высокой гомологии аминокислотных последовательностей их гемаг-глютининов по сравнению с вирусами гриппа А, циркулирующими среди млекопитающих [15]. Возможно, что высокая гомология гемагглютини-нов, выявленная у вирусов гриппа птиц, отчасти объясняется конвергентной эволюцией этих вирусов.

До недавнего времени дикие водно-болотные птицы считались долговременным резервуаром только низкопатогенных вирусов гриппа А подтипа Н5; были известны лишь единичные случаи изоляции высокопатогенных вирусов данного се-роварианта от этих птиц [2]. Только начиная со второй половины 2005 года высокопатогенные вирусы гриппа А серотипа H5N1 южно-азиатского происхождения были изолированы от диких водно-болотных птиц во многих регионах Евра-

зии, что свидетельствовало о проникновении данных вариантов вирусов в популяции естественных хозяев [5, 7].

Результаты проведенного нами молекулярно-генетического анализ гена гемагглютинина штамма вируса гриппа А подтипа Н5, изолированного в 2003 году на юге Западной Сибири, согласуются с общим представлением о том, что до 2005 года дикие водно-болотные птицы являлись долговременным резервуаром лишь низкопатогенных вирусов гриппа птиц.

GENETIC ANALYSIS OF HEMAGGLUTININ GENE OF INFLUENZA VIRUS STRAIN A/ANAS PLATYRHYNCHOS/CHANY LAKE/9/03 (H5) ISOLATED IN THE SOUTH OF WESTERN SIBERIA IN 2003 Yu.V. Razumova, Yu.S. Bukin, A.B. Beklemishev, A.M. Shestopalov

The hemagglutinin gene of influenza virus strain A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 (H5) isolated from mallard (Anas platyrhynchos) in the south of Western Siberia in 2003 was analyzed genetically. The analysis showed that strain A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 is low pathogenic and its hemagglutinin gene phylogenetically is far from hemagglutinin genes of highly pathogenic H5N1 viruses isolated in various regions of Eurasia, including in the south of Western Siberia in 2005. Results of the analysis come in accordance with the concept that till 2005 wild water-waders were the long-term reservoir of low pathogenic avian influenza viruses only.

Литература

1. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002 гг.) / Д.К. Львов, С.С Ямникова, И.Т. Федя-кина и др. // Вопр. вирусол. — 2004. — № 3. — С. 17-24.

2. Alexander D.J. A review of avian influenza in different bird species / D.J. Alexander // Vet. Microbiol.

- 2000. - Vol. 74. - № 1-2. - P. 3-13.

3. Horimoto T. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses / T. Horimoto, Y. Kawaoka // Clin. Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 14. - № 1. - P. 129-149.

4. Genesis of a highly pathogenic and potentially pan demic H5N1 influenza virus in eastern Asia / K.S. Li, Y Guan, J. Wang et al. // Nature. — 2004. — Vol. 430. — 6996. — P. 209-213.

5. World Health Organization website (2005). Available online: http://www.who.int/en.

6. Результаты мониторинга вируса гриппа A г популяциях диких птиц на юге Западной Сибирл (данные 2003 г.) / Ю.В. Разумова, М.Ю. Щелканов

C.И. Золотых и др. // Вопр. вирусол. — 2006. — №3.

- С.32-37.

7. Normile D. Avian influenza. Potentially more lethal variant hits migratory birds in China / D. Normile // Science. - 2005. - Vol. 309. - № 5732. - P. 231.

8. Изоляция штаммов вируса гриппа A/H5N1 от домашних и диких птиц в период эпизоотиии в Западной Сибири (июль 2005 г.) и их депонирование в государственную коллекцию вирусов (08 августа 2005 г.) / Д.К. Львов, М.Ю. Щелканов, П.Г. Дерябин и др. // Вопр. Вирусол. — 2006. — № 1. — С. 11-14.

9. Evolution of Н5 subtype avian influenza A viruses in North America / M. Garcia, D.L. Suarez, J.M. Crawford et al.//Virus Res. - 1997. -Vol. 51,- №2. -P. 115-124.

10. Миграции птиц Восточной Европы и Северной Азии. Пластинчатоклювые (Речные утки) / Ред. В.В. Бианки, И.Н. Добрынина. — М., 1997. — 318 с.

11. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation / E. Spackman, D.E. Stallknecht, R.D. Slemons, et al. // Virus Res. - 2005. - Vol. 114. - P. 89-100.

12. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties / M. Matrosovich, N. Zhou, Y. Kawaoka, R. Webster //J. Virology — 1999. -- Vol. 73.

— № 2. — P. 1146-1155.

13. Lee C.W. Effect of vaccine use in the evolution of mexican lineage H5N2 avian influenza virus / C.W Lee,

D.A. Senne, D.L. Suarez //J. Virology — 2004. — Vol. 78. № 15.-P. 8372-8381.

14. Influenza A viruses in feral Canadian ducks: extensive reassortment in nature / T.F. Hatchette, D. Walker, C. Johnson, et al. //J. Gen. Virol. — 2004. — Vol. 85 (Pt 8). - P. 2327-2337.

15. Suarez D.L. Evolution of avian influenza viruses / D.L. Suarez // Vet. Microbiol. — 2000. — Vol. 74. — P. 15-27.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.