CC BY
14недостаточно оцениваемая биологическая угроза южным регионам России. Журнал инфекгологии. 2011, 1 (3): 59-63.
7. European Centre for Disease Prevention and Control. Update on autochthonous dengue cases in Madeira, Portugal. Stockholm; 2013 (http:ecdc.europa.eu/eu/publications/ Publications/ dengue- madeira-risk-assessment-update.pdf.accessed 11 March 2016).
Поступила 29.03.17
Контактная информация: Малецкая Ольга Викторовна, д.м.н., проф.,
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15, р.т. (8652)26-03-83
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
О.Е.Хохлова''2, О.В.Перьянова1'2, О.П.Боброва3, В.В.Сергеева3, А.А.Модестов3, О.Г.Еремеева3, Н.К.Поткина2, Д.Н.Капшук1, А.В.Алабушева', T.Yamamoto2-4
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МЕТИЦИЛЛИН-РЕЗИСТЕНТНЫХ STAPHYLOCOCCUS AUREUS (MRSA) - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
'Красноярский государственный медицинский университет; 2Российско-японский центр микробиологии, метагеномики и инфекционных заболеваний, Красноярск; красноярский краевой клинический онкологический диспансер, Россия; "Международный медицинский образовательно-исследовательский центр, Ниигата, Япония
Цель. Изучение молекулярно-генетических особенностей MRSA, вызывающих гнойно-воспалительные осложнения у онкологических больных. Материалы и методы. В работе использованы бактериологический метод, молекулярно-генетические методы — ПЦР, М-ПЦР, секвенирование. Результаты. Доля MRSA среди стафилококковых инфекций у онкологических больных в 2003 — 2007 гг. составила 37,6%, а в 2010 — 2015 гг. возросла до 51,3%. При исследовании молекулярно-генетических особенностей выделенных штаммов MRSA установили наличие двух основных клонов: ST239/spa3(t037)/SCCmecIIIA и ST8/ spal(t008)/SCCmecIVc. Представители клонов отличались уровнем резистентности канти-бактериальным препаратам. Заключение. У онкологических больных в Красноярске выявлено распространение двух вариантов MRSA — ST239icras и ST8icras, соответствующих вариантам, распространенным в Красноярском крае.
Журн. микробиол., 2017, № 6, С. 15—20
Ключевые слова: MRSA, генотипирование, антибиотикорезистентность, онкологические больные
O.E.Khokhlova1-2, О.V.Peryanova12, O.P.Bobrova3, V.V.Sergeeva3, A.A.Modestov3, O.G.Eremeeva3, N.K.Potkina2, D.N.Kapshuk1, A.V.AIabusheva1, T.Yamamoto2i4
MOLECULAR AND GENETIC FEATURES OF THE METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS (MRSA) - CAUSATIVE AGENTS OF PURULENT DISEASES AT CANCER PATIENTS
'Krasnoyarsk State Medical University; 2Russia-Japan Center of Microbiology, Metagenomics and Infectious Diseases; 3Krasnoyarsk Regional Clinical Oncology Center, Russia; "International Medical Education and Research Center, Niigata, Japan
Aim. Study of the molecular and genetic features of the MRSA, causative agents of purulent diseases at cancer patients. Materials and methods. In the work were used — bacteriological method, molecular genetic methods (PCR, M-PCR, sequencing). Results. MRSA share among staphylococcal infections at cancer patients in 2003 — 2007 has made 37,6%, and in 2010 — 2015
has increased up to 51,3%. At a research of molecular and genetic features of the allocated MRSA strains, have established, existence oftwo main clones: ST239/spa3(t037)/SCCmecIIIAand ST8/ spal(t008)/SCCmecIVc. Representatives of clones differed in resistance level to antibiotics. Conclusion. In cancer patients in Krasnoyarsk, the distribution oftwo variants of MRSA— ST239i<ras and ST8icras, corresponding to the variants common in the Krasnoyarsk region, was revealed.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 6, P. 15-20
Key words: MRSA, genotyping, resistance, cancer patients
ВВЕДЕНИЕ
Устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) является одним из основных возбудителей, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью с начала 1960-х годов и вызывающий инфекции различной степени тяжести от абсцессов кожи и раневой инфекции до сепсиса, пневмонии, синдрома септического шока и других [7]. MRSA вызывают приблизительно 50% всех стафилококковых инфекций в стационарах России [2]. Традиционно MRSA являются причиной госпитальных инфекций (НА-MRSA). Другой класс MRSA, резистентность которого сформировалась во внебольничных условиях, выявлен в конце 1990-х годов (CA-MRSA) [3]. Молекулярные эпидемиологические исследования показали распространение нескольких основных госпитальных и внебольничных клонов MRSA в мире, различающихся по уровню вирулентности и антибиотикорезистент-ности [7].
Особой категорией пациентов являются онкологические больные, так как для них характерно снижение иммунологического ответа, наличие серьезных сопутствующих заболеваний, нарушение многих видов обмена [5]. Таким образом, риск развития инфекции, вызванной MRSA, у онкологических больных значительно повышен. Проведение рациональной терапии и профилактики невозможно без современных знаний об этиологии, молекулярно-генетиче-ских особенностях и антибиотикорезистентности возбудителей.
Целью работы явилось изучение молекулярно-генетических особенностей MRSA, вызывающих гнойно-воспалительные осложнения у онкологических больных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовано 4209 образцов от больных отделения анестезиологии-реанимации, торакального и хирургического отделений №1 Красноярского краевого клинического онкологического диспансера, прооперированных по поводу злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта (рак желудка, пищевода, поджелудочной железы, ободочной и прямой кишки) и рака легкого за период 2003 — 2015 гг. Материалом для исследования являлись бронхоальвеолярное содержимое и раневое отделяемое. Отбор материала производился объемно шприцем либо стандартным тампоном промышленного производства с использованием транспортной среды.
Посев бронхоальвеолярного содержимого, раневого отделяемого производили по методу Gould для оценки этиологической роли выделенных микроорганизмов на комплекс питательных сред — кровяной агар, желточно-соле-вой агар, хром-агар. Идентификацию исследуемых культур проводили на основании морфо-тинкториальных, культуральных и биохимических свойств,
используя помимо рутинных методов тест-системы Remel (США) для идентификации микроорганизмов.
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтона с использованием дисков OXOID (Великобритания). Чувствительность стафилококков к оксациллину (Sigma-Aldrich, США) проводили методом скрининга в соответствии с международными рекомендациями CLSI.
Для внутрилабораторного контроля определения антибиотикочувстви-тельности и метициллинорезистентности использовали референс-штаммы из коллекции АТСС (Staphylococcus aureus АТСС 25923). Обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы WHONET (ВОЗ).
Для генетических исследований MRSA микроорганизмы культивировали в бульоне LB (Difco, Detroit, MI) при температуре 37°С до фазы логарифмического роста.
Для определения принадлежности к MRSA исследовали гены nue и шесА с помощью ПЦР. Праймеры для выявления гена nue необходимы для дифференциации MRSA и MSSA от коагулазонегативных стафилококков. Режим амплификации включал начальный цикл 94°С 3 мин. Следующие этапы амплификации включали денатурацию ДНК при 94°С в течение 90 сек.; отжиг при 55°С в течение 60 сек.; синтез в течение 60 сек при 72°С (30 циклов) и завершающий цикл в течение 10 минут при 72°С. Детекцию продуктов амплификации ПЦР проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с использованием бромистого этидия. В качестве контроля молекулярной массы использовали 100 bp DNA ladder (Sigma-Aldrich, Япония) и КАРА Universal DNA ladder (КАРА , США).
С помощью ПЦР исследовали 47 генов патогенности: 3 лейкоцидина; 4 гемолизина; 2 белковых цитолизина (psma, hid); 19 генов стафилококковых энтеротоксинов (SE): tst, sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, sek, sei, sem, sen, seo, sep, seq, seu; 3 эксфолиатина; set, edin, ssl; 14 генов адгезии; ACME-arcA и —орр-ЗС [9].
Молекулярное типирование штаммов MRSA проводили в соответствии с международными стандартами [9]. MLST типирование основано на изучении семи «генов домашнего хозяйства» и определения аллельного профиля (ал-лельный номер) с использованием вебсайта (http://www.mlst.net/). Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения eBURST. Spa типирование проводили путем секвенирования с последующим анализом с использованием базы данных eGenomics (http://tools.egenomics.com/) или Ridom SpaServer (http://spaserver.ridom.de/). SCCmec типирование (I — Утипы) — с применением ПЦР, М-ПЦР. Субтипирование SCCmec проводили в соответствии с рекомендациями [4, 8] (http://www.staphylococcus.net/).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
У больных с опухолями ЖКТ и раком легкого при посеве промывных вод бронхов в 2003 — 2007 гг. и 2010 — 2015 гг. рост был получен в 64,1% и 82,7% соответственно, а при посеве раневого отделяемого в 2003 — 2007 гт. и 2010 — 2015 гг. — в 70,8% и в 74,5% случаев соответственно. Доля ассоциаций микроорганизмов в бронхоальвеолярном лаваже в 2003 — 2007 гг. и 2010 — 2015 гг. составила 40,2% и 65,1 % соответственно. Доля ассоциаций микроорганизмов в раневом отделяемом в 2003 — 2007 гг. и 2010 — 2015 гг. составила 38,3% и 63,7% соответственно.
Характеристика MRSA, выделенных от онкологических больных в 2013 — 2015 гг.
При исследовании патологических материалов у онкологических больных в 2003 — 2007 гг. в отделении анестезиологии-реанимации и торакальном отделении в составе микрофлоры преобладали грамположительные микроорганизмы, выделенные в 34,6 и 50,9% случаев соответственно и представленные Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Enterococcus spp. В хирургическом отделении в ранах доминировали представители семейства Enterobacteriaceae (45,5%), представленные в основном Escherichia coli.
В 2010 — 2015 гг. доминирующей микрофлорой ран в отделении анестезиологии-реанимации, торакальном и хирургическом отделениях являются грамположительные микроорганизмы, выделенные в 34,8%; 31,3% и 42,3% соответственно.
При исследовании раневого отделяемого и отделяемого дыхательных путей у онкологических больных в 2003 — 2007 гг. в отделении анестезиологии-реанимации доля MRSA составила 52,7%, а в 2010 - 2015 гг. — возросла до 61,3 %. В торакальном отделении доля MRSA в 2003 — 2007 гг. составила 24,9%, в 2010 - 2015 гг. - 43,3%. В хирургическом отделении доля MRSA в 2003 — 2007 гг. составила 35,1%, а в 2010 - 2015 гг. -49,4%.
У 4 штаммов MRSA, выделенных от разных онкологических больных в 2013 — 2015 гг., изучили молекулярно-генетиче-ские особенности (табл.). Все выделенные штаммы MRSA были PVL-негативными.
Выявлено наличие двух клонов MRSA, распространенных у онкобольных.
Три штамма MRSA (75%) относились к варианту ST239/ spa3(t037)/SCCmecIIIA, имели гены lukED, гены, кодирующие адгезины, гемолизины и ген TSST-1, кодирующий токсин синдрома токсического шока, а также гены sek seq, кодирующие энтеротоксины (табл., рис.). У данных штаммов выявлена уникальная для Бразильского клона комбинация генов tst, sek, sep, спа. Токсин синдрома токсического шока (TSST-1) ОТНОСИТСЯ комплекс, SГ - сиквенс тип, SCCmeC - тип стафило-К суперантигенам, Т.е. вызывает кокковой хромосомной кассеты, egc* — кластер генов seg, неспецифическую активацию sei' sem' sen> seo> кодирующих синтез энтеротоксинов, Т-лимфоцитов, что значительно ÄTK19rica^icaD' eno'fnbA'fnbB'ebpS'
vt- , lu^imiiuw.ппи clfA, clfB, fib, sdrC, sdrD, sdrE, кодирующих синтез адге-
утяжеляет течение заболевания, зинов.
Штаммы MRSA.
Молекулярно-генетические Определяемые вирулентности изолированные от разных онкобольных
характеристики (n=l) (n=3)
сс 8 8
ST" 8 239
spa 1 (t008) 3 (t037)
SCCmec* Токсины: IV.3.1.1 (IVc) III.1.1.2 (IIIA)
Лейкоцидины — -
lukpvSF + +
lukE-lukD — -
lukM
Гемолизины + +
hla, hlg, hlg-v (+) (+)
hlb (split)
Белковые цитолизины + +
psma, hid
Энтеротоксины + -
sea — +
tst - -
sec,sep - -
seb, sed, see, seh, set — +
SapI5 (sek, seq) - -
sej, seu — -
egc*
Эксфолиатины — -
eta, etb, etd
Адгезины: + +
cl2ag' - +
cna - —
Примечание. п=1и п=3 — число штаммов, выде
ленных от разных онкобольных, СС" — клональньн
Бразильский клон, относящийся к генотипу ST239 MRSA, широко распространен во всем мире, но обычно не имеет tst-гена. В отличие от других ST239 вариантов штаммы, изолированные в Красноярске, продуцировали токсин синдрома токсического шока.
Один штамм MRSA (25%) относился к варианту ST8/spal(t008) /SCCmecIVc. у таких штаммов установлено наличие генов lukED, генов, кодирующих адгезины. гемолизины, и они были положительными для гена sea, кодирующего энтеротоксин (табл., рис.).
По результатам исследования антибио-тикорезистентности установили, что представители варианта SCCmecIIIA отличались множественной лекарственной устойчивостью, в т.ч. в 100% случаев резистентны к аминогликозидам, макролидам, линкозамидам, фторхинолонам, сульфаме-токсазолу, рифампицину, тетрациклину и в 66.7% случаев к хлорамфениколу. В 100% случаев чувствительны к ванкомицину. линезолиду. Представители клона MRSA SCCmecIVc в 100% случаев резистентны к аминогликозидам, гетраци-клинам, макролидам, линкозамидам, хлорамфениколу. В 100% случаев чувствительны к фторхинолонам, сульфаметаксазолу, рифампицину, ванкомицину, линезолиду.
Доминирующими клонами MRSA в России являются ST239/spa3(t037)/ SCCmecIII, ST239/spa351(t030)/SCCmecIIlH ST8/spal(t008)/SCCmecIV[l, 6]. В европейской части России (Москва, Санкт-Петербург), в Кургане, на Дальнем Востоке России (Владивосток) более распространен вариант ST239/ spa351(t030)/SCCmecIII. 1.1.4 [11]. В Красноярске распространенным вариантом линии ST239 является уникальный вариант ST239jcias, характеризующийся наличием гена tst, кодирующего токсин синдрома токсического шока [6]. Второй клональной линией MRSA, распространенной в России и Красноярском крае, является линия MRSA ST8 [10]. В Красноярске выявлено распространение уникального клона MRSA ST8Kras, У которого spa тип (spal [t008]) соответствовал spa типу ST8 варианта, выявленного ранее в других регионах России, но отличался от штаммов, выделенных во Владивостоке (ST8spa826[t:unknown]). У вариантов ST8Kras, выделенныхв Красноярском крае, и ST8, выделенных во Владивостоке, выявлены SCCmecIV.3.1.1(IVc) и имеется ген sea [11].
Таким образом, установлено увеличение доли MRSA среди S. aureus вызывающих инфекционные осложнения у онкологических больных с 32,7% в 2003 — 2007 гг. до 52,5% в 2010 — 2015 гг. У онкологических больных в Красноярске выявлено распространение двух вариантов MRSA — ST239Kras и ST8Kras, различающихся чувствительностью к антибиотикам, что важно при подборе антибактериальной терапии. Варианты MRSA, выделенные от онкологических больных, соответствовали вариантам, распространенным в Красноярском крае.
M 1 2 3 4 I II III IV M
Результаты типирования SCCmec у штаммов MRSA, выделенных от онкологических больных.
Примечание: М — маркер ДНК (100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1200, 1Ь00, 2000, 3000, 4000, 5000 п.н.); 1—4 — штаммы MRSA, выделенные от 4 разных онкобольных; I—IV — контрольные штаммы, в т.ч. I — тип SCCmecI (MRSA4CTC10442), II — тип SCCmecII (MRSA N315), III - тип SCCmecIII (MRSA 85'/2082), IV - тип SCCmecIV (MRSA JCSC4788).
ЛИТЕРАТУРА
1. Романов А.В., Чернов Е.А., Эйдельштейн М.В. Молекулярная эпидемиология внутри-больничных золотистых стафилококков в стационарах различных регионов России. Молекулярная медицина 2013,4: 55-64.
2. Сухорукова М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Тимохова А.В., Эйдельштейн М.В., Дехнич А.В., Козлов Р.С. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Staphylococcus aureus в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011—2012 гг. Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2014,16 (4): 280-286.
3. DeLeo F.R., Otto М., Kreiswirth B.N. et al. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 2010, 375:1557-1568.
4. International working group on the classification of staphylococcal cassette chromosome elements (IWG-SCC). Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53: 4961-4967.
5. Kenneth V. I. et al. Tarrand current microbiology of surgical site infections in patients with cancer: a retrospective review. Infect. Dis. Ther. 2014, 3: 245-256
6. Khokhlova O.E., Hung W-C., Wan T-W. et al. Healthcare- and community-associated methi-cillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and fatal pneumonia with pediatric deaths in Krasnoyarsk, Siberian Russia: Unique M RSA's multiple virulence factors, genome, and stepwise evolution. PloS One. 2015, 1:1-30.
7. Klevens R.M., Morrison M.A., Nadle J. et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 2007, 298: 1763-1771.
8. Kondo Y., ItoT., MaX.X. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51: 264-274.
9. Takano Т., Hung W.C., Shibuya M. et al. A new local variant (ST764) of the globally disseminated ST5 lineage of hospital-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) carrying the virulence determinants of community-associated MRSA. Antimicrob. Agents Chemother. 2013, 57: 1589-1595.
10. Wan T-W., Khokhlova O.E., Iwao Y. et al. Complete circular genome sequence of successful ST8/SCCmecIV community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (OC8) in Russia: One-megabase genomic inversion, IS256's spread, and evolution of Russia ST8-IV. PLoS One. 2016,11 (10): 1-25.
11. Yamamoto Т., Takano Т., Higuchi W. et al. Comparative genomics and drug resistance of a geographic variant of ST239 methicillin-resistant Staphylococcus aureus emerged in Russia. PLoS One. 2012,7: e29187.
Поступила 20.03.17
Контактная информация: Хохлова Ольга Евгеньевна, к.б.н.,
660022, ул. Партизана Железняка, 1, р.т. (391)220-13-61
