CC BY
37
Микробиологический мониторинг гнойных осложнений у ожоговых больных и молекулярно-генетические особенности метициллинорезистентных Staphylococcus aureus (MRSA)
О. Е. ХОХЛОВА'2, О. В. ПЕРЬЯНОВА'2, И. В. ВЛАДИМИРОВ3, В. А. МАЦКЕВИЧ3, Н. К. ПОТКИНА2, Д. Н. КАПШУК', Л. Н. КОПЫТКО3, В. В. ГОСТЕВ4, С. В. СИДОРЕНКО4, Я. ИВАО5, Т. ЯМАМОТО25
' Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого МЗ РФ, Красноярск
2 Российско-Японский центр микробиологии, метагеномики и инфекционных заболеваний, Красноярск
3 Краевая клиническая больница, Красноярск
4 Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург
5 Международный медицинский образовательно-исследовательский центр (IMERC) Ниигата, Япония
Microbiological Monitoring of Purulent Complications in Burn Patients
and Molecular Genetic Features of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)
O. E. KHOKHLOVA'2, O. V. PERYANOVA'2, I. V. VLADIMIROV3, V. A. MATSKEVICH3, N. K. POTKINA2, D. N. KAPSHUK', L. N. KOPYTKO3, V. V. GOSTEV4, S. V. SIDORENKO4, YA. IWAO5, T. YAMAMOTO25
' Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F.Voino-Yasenetski, Krasnoyarsk
2 Russia-Japan Center of Microbiology, Metagenomics and Infectious Diseases, Krasnoyarsk
3 Regional Clinical Hospital, Krasnoyarsk
4 Children's Scientific and Clinical Center for Infectious Diseases of the Federal Medical Biological Agency, St. Petersburg
5 International Medical Educational Research Center (IMERC) Niigata, Japan
Цель исследования — изучение микрофлоры гнойных осложнений, её антибиотикорезистентности и молекулярно-генети-ческих особенностей MRSA у ожоговых больных. Материал и методы. Исследована микрофлора биоптатов, раневого отделяемого у 145 пациентов с термическими ожогами в первые сутки и на 10—50-е сутки пребывания в краевом ожоговом центре ККБ в 2013—2016 гг. Изучены молекулярно-генетические особенности 12 штаммов MRSA, изолированных от разных ожоговых больных. Использованные методы — бактериологический, ПЦР, М-ПЦР, секвенирование, PFGE, реакция агглютинации. Результаты. В первые сутки госпитализации при посеве биоптата, раневого отделяемого ожоговых больных рост микроорганизмов выявлен в 25,5% случаев, доминировали грамположительные микроорганизмы, в частности MSSA (37,8%). На 10—50-е сутки госпитализации рост получен в 93,2% случаев, доминировала грамотрицательная микрофлора (53,4%), при этом значительную роль играют Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp. (38,0%), характеризующиеся высокой степенью резистентности к ант имикробным препаратам: доля XDR — 18%, доля PDR — 67%. На 10—50-е сутки госпитализации также значительную роль играют стафилококки (38,7%), при этом доля MRSA — 62,2%. Установлена циркуляция одного клона MRSA у ожоговых больных — ST239/spa3(t037)/agr//SCCmecIII.1.1.2(IIIA)/CoaIV, характеризующегося множественной резистентностью к антимикробным препаратам.
Ключевые слова: ожоговые больные, микрофлора гнойных осложнений, антибиотикорезистентность, метициллинорези-стентные Staphylococcus aureus, генотипирование.
The aim of the study was to research the microflora of suppurative complications, its antibiotic resistance, and the molecular genetic features of MRSA in burn patients. Material and methods. The microflora of biopsy specimens, wound fluid from 145 patients with thermal burns was investigated on the first day and on the 10—50th days of stay in the burn center of the Regional Clinical Hospital in 2013—2016. The molecular genetic features of 12 strains of MRSA isolated from different burn patients have been studied. Methods used: bacteriological, PCR, M-PCR, sequencing, PFGE, agglutination reaction. Results. On the first day of hospitalization, when biopsy specimen and wound fluid were taken, microbial growth was detected in 25.5% of cases, gram-positive microorganisms, in particular MSSA (37.8%), dominated. On the 10—50th days of hospitalization, growth was obtained in 93.2% of cases, Gram-negative microflora (53.4%) dominated, with a significant role played by Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. (38.0%), characterized by a high degree of resistance to antimicrobial drugs: XDR — 18%, PDR — 67%. On the 10—50th days of hospitalization, a significant role was played by staphylococci (38.7%), while the proportion of MRSA was 62.2%. Circulation of one MRSA clone in burn patients — ST239/spa3(t037)/agr//SCCmecIII.1.1.2(IIIA)/CoaIV, characterized by multiple resistance to antimicrobial agents, was established.
Keywords: burn patients, microflora of purulent complications, antibiotic resistance, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, genotyping.
© Коллектив авторов, 2017
Адрес для корреспонденции: 660022 ул. Партизана Железняка, 1. ВО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России
Инфекционные осложнения у ожоговых больных по-прежнему являются актуальной медицинской и социальной проблемой [1]. Утрата защитного барьера кожи и иммуносупрессия, связанные с ожоговой травмой, приводят к развитию гнойно--воспалительных осложнений. По сравнению с другими группами пациентов, нуждающихся в интенсивной терапии, у пациентов с ожогами показатели инфекционных осложнений одни из самых высоких [2—6].
В Национальном отчёте по ожоговым больным США (NBR) приводятся данные о трёх главных осложнениях у пациентов с ожогами, таких как пневмония, флегмона и инфекции мочевы-водящих путей [7]. При этом, наиболее частыми осложнениями у ожоговых пациентов, не находящихся на искусственной вентиляции лёгких, являются локальные воспалительные осложнения такие как гнойное расплавление аутодерматранс-плантатов, нагноение области донорского забора, флебиты, флегмона, а так же постиньекционные абсцессы [7, 8]. По результатам исследований установлено, что на долю инфекционных осложнений приходится 30—75% всех смертельных исходов [9, 10]. У пациентов с ожоговыми ранами в 8,5—11 раз повышается риск смертности в случае, если инфекционные осложнения вызваны микроорганизмами с множественной лекарственной устойчивостью [11].
В США в последние годы одними из лидирующих возбудителей инфекционных осложнений у ожоговых больных являются метициллиночувст-вительные Staphyloccocus aureus (MSSA) (19,6% от всех обследованных), Enterococcus faecalis (12,5%), метициллинорезистентные S.aureus (MRSA) (11,0%) и Pseudomonas aeruginosa (10,7%) [12]. В России ведущими возбудителями инфекционных осложнений у ожоговых пациентов также являются S.aureus (35,7%), при этом доля MRSA составляет до 82% и P.aeruginosa (33,3%) [13—16].
Изучение молекулярно-генетических особенностей штаммов MRSA, изолированных от ожоговых больных г. Красноярска, ранее не проводилось.
Для проведения адекватной эмпирической антибиотикотерапии и прогноза резистентности важно регулярно вести мониторинг микрофлоры и изучать её молекулярно-генетические особенности как на уровне страны, региона, так и на локальном уровне.
Цель исследования — изучение микрофлоры гнойных осложнений, её антибиотикорезистент-ности и молекулярно-генетических особенностей MRSA у ожоговых больных.
Материал и методы
Обследованы 145 пациентов с термическими ожогами IIIA, ШБ и IV степенью, поступившие в отделение анестезиологии-реанимации №4 краевого ожогового центра ККБ в 2013—2016 гг. Возраст пациентов — 14—64 лет, из них 112
мужчин (70%) и 33 женщины (30%). Забпр материала пт пжп-говьк больньк прпизвпдился в первые 48 ч пребывания в ста-ципнаре и далее пп мере непбxпдимпсти. Mатеpиалами для ис-следпвания служили бипптат, раневпе птделяемпе.
Ппсев бипптата, раневпгп птделяемпгп прпизвпдили пп метпду Gould для пценки этиплпгическпй рпли выделенный: микрппрганизмпв на кпмплекс питательным сред — крпвянпй агар, желтпчнп-сплевпй агар, xpпм-агаp. Идентификацию ис-следyемыx культур прпвпдили на пснпвании мпрфп-тинктп-риальнык, культуральнык и бипxимическиx свпйств, исппль-зуя ппмимп рутинным метпдпв тест-системы Remel ^ША) для идентификации микрппрганизмпв.
Чувствительнпсть микрппрганизмпв к антибиотикам ппре-деляли диско-диффузионным метпдпм на агаре Mюллеpа—Xин-тпн с исппльзпванием дискпв OXOID (Великпбритания); чувст-вительнпсть стафилпкпккпв к пксациллину и другим антими-крпбным препаратам (Sigma-Aldrich, ОША) прпвпдили метпдпм скрининга и метпдпм серийным разведений в агаре Mюлле-ра—Хинтон в спптветствии с междунарпдными реюмендациями CLSI, EUCAST. Для внyтpилабоpатоpного кпнтрпля ппределе-ния антибиптикпчувствительнпсти и метициллинпрезистентнп-сти исппльзпвали референс-штаммы из юллекции АТСС Прп-дукцию БЛPC у энтерпбактерий ппределяли феиптипическим метпдпм «двойныx дискпв» на среде Mюллеpа—Хингон с ис-ппльзпванием дискпв OXOID и дискпв кпмпании MAST, спдер-жащж ингибиторы БЛPC и AmpC. Прпдукцию MБЛ прпвпдили метпдпм инактивации карбапенемпв (CIM).
Анализ микрпфлпры и антибиптикпчувствительнпсти псуществляли с ппмпщью прпграммы WHONET v.5.6. Нулевую гипптезу пб птсутствии различий между набпрпм впзбуди-телей в разные сутки пребывания в стаципнаре прпверяли с исппльзпванием критерия х2.
Тптальную ДHK штаммпв S.aureus пплучали термическим метпдпм 99°C 15 мин. Ппдтверждение принадлежнпсти к MRSA прпвпдили с ппмпщью ПЦP (гены nuc, mecA). Для генетическиx исследпваний MRSA микрппрганизмы культи-вирпвали в бульпне LB (Difco, Detroit, MI) при температуре 37°C дп фазы лпгарифмическпгп рпста. Отжиг праймерпв прпвпдили при 55°C в течение 60 с. Детекцию прпдуктов амплификации ПЦP прпвпдили с ппмпщью электрпфпреза в 1,5% агарпзнпм геле с исппльзпванием брпмистпгп этидия. В качестве кпнтрпля мплекулярнпй массы исппльзпвали 100 bp DNA ladder (Sigma-Aldrich, Яппния) и KAPA Universal DNA ladder (KAPA, CШA).
C ппмпщью ПЦP ппределяли 47 генпв патпгеннпсти: 3 лейкпцидина; 4 гемплизина; 2 белковыx цитплизина (psma, hld); 19 генпв стафилококковыx энтерптоксинпв (SE): tst, sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, sek, sel, sem, sen, seo, sep, seq, seu; 3 эксфплиатина; set, edin, ssl; 14 генпв адгезии; ACME-arcA и -opp-3C [17].
Mолекyляpное типирпвание штаммпв MRSA прпвпдили в спптветствии с междунарпдными стандартами [17]. MLST типирпвание пснпванп на изучении семи «генпв дпмашнего xо-зяйства» и ппределения аллельнпгп прпфиля (аллельный ж>-мер) с исппльзпванием вебсайта (http://www.mlst.net/). Данные были прпанализирпваны с ппмпщью прпграммнпгп пбес-печения eBURST. Spa типирпвание прпвпдили с ппмпщью секвенирпвания с ппследующим анализпм с исппльзпванием базы данный: eGenomics (http://tools.egenomics.com/) или Ridom SpaServer (http://spaserver.ridom.de/). SCCmec типирпвание (I—V типы) — с применением ÏUP, M-ПЦP. Cyбтипи-рпвание SCCmec прпвпдили в спптветствии с рекпмендация-ми [18, 19] (http://www.staphylococcus.net/). Детекцию регуля-тпрнпгп гена (agr) и ппределение принадлежнпсти к аллель-нпй группе прпвпдили с применением ÏUP. Kоагyлазотипи-рпвание (Coa) прпвпдили с исппльзпванием набпрпв, включа-ющиx различные стафилпкпккпвые антикпагулазные сывп-рптки (Denka Seiken, Tokyo, Japan) или пyтëм анализа результатов секвенирпвания гена coa. В качестве кпнтрпля исппльзпвали референтные штаммы.
В ПОМОЩЬ ПРАКТИКУЮЩЕМУВРАЧУ Таблица 1. Микрофлора гнойных осложнений у ожоговых больных, 2013—2016 гг.
Микроорганизмы _Количество (%)
1-е сутки 10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки 40-е сутки 50-е сутки
n=145 n=106 n=45 n=24 n=13 n=4
Моноинфекция 32 (69,6) 62 (63,3) 30 (71,4) 13 (56,5) 6(54,5) 1 (25)
Микст-инфекция 14 (30,4) 36 (36,7) 12 (28,6) 10 (43,5) 5 (45,5) 3 (75)
Enterobacteriaceae 4(5,3) 23 (14,1) 9 (16,1) 4 (10,3) 3 (13) 6 (50)
E.coli 0 6 (3,7) 0 0 0 0
Enterobacter spp. 2(2,7) 2 (1,2) 1 (1,8) 1 (2,6) 0 1 (8,3)
Proteus spp. 1(1,3) 7 (4,3) 3(5,4) 0 2 (8,7) 3 (25)
Klebsiella pneumoniae 1 (1,3) 8 (4,9) 5 (8,9) 3(7,7) 1 (4,3) 2 (16,7)
НГОБ 19 (25,7) 61 (37,6) 21 (37,5) 14 (35,8) 12 (52,2) 3 (25)
Pseudomonas spp. 11 (14,9) 29 (17,9) 17 (30,4) 9 (23,1) 9(39,2) 2 (16,7)
Acinetobacter spp. 8(10,8) 32 (19,7) 4(7,1) 5 (12,7) 3(13,0) 1 (8,3)
Грамположительные 43 (69) 76 (47,1) 26 (46,4) 20 (51,3) 8 (34,8) 2 (16,7)
Enterococcus spp. 2(2,7) 9 (5,6) 1 (1,8) 0 3(13,0) 1 (8,4)
Streptococcus spp. 1(1,3) 1 (0,6) 0 1 (2,6) 0 0
S.aureus MSSA 28 (37,8) 28 (17,3) 6(10,6) 3(7,7) 0 0
S.aureus MRSA 7 (9,6) 27 (16,8) 17 (30,4) 12 (30,7) 4 (17,5) 1 (8,3)
S.epidermidis MSSE 5 (6,8) 6 (3,7) 1 (1,8) 1 (2,6) 1 (4,3) 0
S.epidermidis MRSE 0 4 (2,5) 0 2 (5,1) 0 0
Corynebacterium spp. 8(10,8) 1 (0,6) 1 (1,8) 1 (2,6) 0 0
Грибы 0 2 (1,2) 0 1 (2,6) 0 1 (8,3)
Candida spp. 0 2 (1,2) 0 1 (2,6) 0 1 (8,3)
Всего 74 (100) 162 (100) 56 (100) 39 (100) 23 (100) 12 (100)
Примечание. n - число обследованных; НГОБ - неферментирующие грамотрицательные бактерии.
Бактериальную ДНК для гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE) расщепляли с помощью SmaI с последующим электрофорезом в 1,2% агарозном геле с применением маркерной ДНК (Lambda ladder; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, США), как было представлено ранее [20]. Плаз-мидный профиль штаммов MRSA был изучен с помощью модифицированного метода, предложенного [21] с применением лизостафина и Plasmid Midi Kit (QIAGEN Sciences, Токио). Данные о частоте встречаемости MRSA различных генетических вариантов были анализированы с помощью теста Фишера. Уровень значимости — p<0,05.
Исследования одобрены Этическим Комитетом при КрасГМУ, №28/2010.
Результаты исследования
У ожоговых больных при посеве биоптатов, раневого отделяемого в первые сутки исследования рост был получен в 25,5% случаев в этиологически значимом количестве. Доля ассоциаций микроорганизмов в биоптате, раневом отделяемом составила 30,4% (табл. 1). При исследовании биоптата, раневого отделяемого у ожоговых больных в первые сутки в составе микрофлоры преобладали грамположительные микроорганизмы, выделенные в 69% случаев и представленные преимущественно Staphylococcus spp, а также Enterococcus spp. и Corynebacterium spp. (табл. 1). На долю нефермен-тирующих грамотрицательных бактерий (НГОБ) приходилось 25,7% случаев, при этом среди них доминировали P.aeruginosa. Среди представителей семейства Enterobacteriaceae (5,3%) доминировали Enterobacter spp. Дрожжеподобные грибы р. Candida выделены не были. Наиболее частыми ас-социантами в первые сутки госпитализации являются MSSA и P.aeruginosa (21,4%); MSSA и мети-циллиночувствительные Staphylococcus epidermidis
(28,6%); MRSA и Corynebacterium spp. (21,4%); P.aeruginosa и Proteus vulgaris (14,3%).
Ha 10—50-е сутки пребывания в стационаре ожоговых больных при посеве биоптатов, раневого отделяемого рост был получен в 92,7% случаев. Доля ассоциаций микроорганизмов составила 62,9% (см. табл. 1). В составе микрофлоры преобладали грамотрицательные микроорганизмы, выделенные в 53,4% случаев. На долю НГОБ приходилось 38,0%, при этом среди них доминировали P.aeruginosa и Acinetobacter baumannii. Среди представителей семейства Enterobacteriaceae (15,4%) доминировали Klebsiella pneumoniae и Proteus spp. Грамположительные микроорганизмы выделены в 45,2% случаев и представлены преимущественно Staphylococcus spp. (38,7%), а также Enterococcus spp. (4,8%) (см. табл. 1). Дрожжеподобные грибы р. Candida выделены в 1,0% случаев.
Наиболее частыми ассоциантами гнойных осложнений у ожоговых больных на 10—50-е сутки пребывания в стационаре являются A.baumannii, K.pneumoniae и MRSA (25,8%), P.aeruginosa, K.pneumoniaeи A.baumannii (15,2%); P.aeruginosa и A.baumannii (15,2%); P.aeruginosa и K.pneumoniae (15,2%); MRSA и P.aeruginosa (15,2%); K.pneumoniae и MRSA (6,1%); A.calcoaceticus, Candida albicans и K.pneumoniae (1,0%).
При исследовании чувствительности к антимикробным препаратам изолятов микроорганизмов сем. Enterobacteriaceae, выделенных из биоптатов, раневого отделяемого от ожоговых больных в первые сутки, установили 100% чувствительность к ампициллину, цефтриаксону, цефта-зидиму, амоксициллину/клавулановой кислоте,
амикацину, гентамицину, ципрофлок-сацину, карбапенемам (рис. 1).
На 10—50-е сутки пребывания в стационаре ожоговых больных чувствительность к антимикробным препаратам изолятов микроорганизмов сем. Enterobacteriaceae значительно снизилась — 100% штаммов резистентны к ампициллину, цефтриаксону, цефазо-лину, амоксициллину/клавулановой кислоте; 22,2% штаммов чувствительны к амикацину; 18,2% — к ципрофлокса-цину; 72,7% — к меропенему и 100% чувствительны к имипенему (рис. 1).
Среди K.pneumoniae уровень XDR — 33,3%, MDR — 66,7%; среди Proteus spp. — 25 и 75%, соответственно.
Основным механизмом резистентности представителей сем. Enterobacte-riaceae является продукция бета-лакта-маз расширенного спектра действия. Среди энтеробактерий доля продуцентов БЛРС составила 53% (K.pneumoniae — 100%, Proteus spp. — 50%).
При исследовании чувствительности к антимикробным препаратам НГОБ, выделенных из биоптатов, раневого отделяемого от ожоговых больных в первые сутки, установили 100% чувствительность к цефоперазону/сульбактаму; 66,7% штаммов — к тикарциллину/кла-вулановой кислоте; 50% штаммов — к цефоперазону, тобрамицину; 70% штаммов — к амикацину, имипенему; 75% штаммов — к меропенему (рис. 1).
На 10—50-е сутки пребывания в стационаре ожоговых больных чувствительность к антимикробным препаратам штаммов НГОБ, значительно снизилась — чувствительность к цефалос-поринам и ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам проявляли менее 10% штаммов; 16,7% штаммов чувствительны к амикацину; 5,7% — к ципрофлоксацину; 18,6 и 26,3% штаммов — к меропенему и ими-пенему соответственно (рис. 1). При оценке полученных данных антибиотикорезистентности выделенные изоляты P.aeruginosa и A.baumannii являлись полирезистентными.
Среди Abaumannii XDR составили 20%, PDR — 67%; среди P.aeruginosa 17 и 66% соответственно. Резистентность к карбапенемам штаммов P.aeruginosa и Abaumannii обусловлена продукцией МБЛ, доля которых составила 37%. Среди штаммов P.aeruginosa доля продуцентов МБЛ составила 19%, а среди представителей рода Acinetobacter — 33%.
Рис. 1. Результаты чувствительности к антибактериальным препаратам (%).
а - представителей сем. Enterobacteriaceae; б - неферментирующих грамотрицательных бактерий (Pseudomonas spp., Acinetobacter spp.); с - штаммов Enterococcusspp.
При исследовании чувствительности к антимикробным препаратам штаммов Enterococcus spp., выделенных из биоптатов, раневого отделяемого от ожоговых больных в первые сутки, установили 100% резистентность к гентамицину, ципрофлоксацину; 50% штаммов чувствительны к хлорамфениколу и 100% — к ампициллину, ван-комицину (рис. 1). На 10—50-е сутки пребывания в стационаре ожоговых больных чувствительность к антимикробным препаратам штаммов Enterococcus spp. снизилась — 100% штаммов резистентны к апициллину, гентамицину, ци-профлоксацину; 25% штаммов чувствительны к
Таблица 2. Характеристика MRSA, выделенных от ожоговых больных в 2013—2015 гг.
Молекулярно- Определяемые Штаммы MRSA,
генетические гены изолированные
характеристики вирулентности от ожоговых больных (n=12)
CC- 8
ST" 239
spa 3 (t037)
SCCmec' III.1.1.2 (IIIA)
agr 1
coa IV
Токсины:
Лейкоцидины
lukPVSF —
lukE-lukD +
lukM —
Гемолизины
hla, hlg, hlg-v +
hlb (split) (+)
Белковые цитолизины
psma, hld +
Энтеротоксины
sea —
tst +
sec,sep —
seb, sed, see, seh, set —
SapI5 (sek, seq) +
sej, seu —
egc* —
Эксфолиатины
eta, etb, etd —
Адгезины:
c12ag' +
cna +
bbp —
Резистентность
Имипенем (МПК, мкг/мл) 64
Оксациллин (МПК, мкг/мл) >128
Ампициллин (МПК, мкг/мл) 32—64
Ванкомицин (МПК, мкг/мл) 0,5
Аминогликозиды 12/12
Тетрациклины 12/12
Макролиды 12/12
Линкозамиды 12/12
Фторхинолоны 12/12
Рифампицин 12/12
Хлорамфеникол 12/12
Сульфаметоксазол 12/12
Примечание. n=12 - число штаммов, выделенных от разных ожоговых больных, CC- - клональный комплекс, ST" - сиквенс тип, SCCmec* - тип стафилококковой хромосомной кассеты, egc* - кластер генов seg, sei, sem, sen, seo, кодирующих синтез энтеротоксинов, c12ag' -кластер генов icaA, icaD, eno, fnbA, fnbB, ebpS, clfA, clfB, fib, sdrC, sdrD, sdrE, кодирующих синтез адгезинов.
хлорамфениколу; 100% чувствительны к ванко-мицину (рис. 1).
Установили, что доля MRSA в первые сутки составила 20%, доля метициллинорезистентных S.epi-dermidis (MRSE) — 0%. На 10—50-е сутки пребывания ожоговых пациентов в стационаре доля MRSA — 62,2%, доля MRSE — 40,0%. Принадлежность к MRSA подтвердили с помощью ПЦР.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 К М
Рис. 2. Результаты ПЦР для определения гена tst, кодирующего синтез токсина синдрома токсического шока у штаммов MRSA, выделенных от ожоговых больных. Примечание. 9, 10 - номера разных штаммов MRSA, выделенных от разных ожоговых больных; 1-8, 11-14 - номера разных штаммов MRSA, выделенных от здоровых бактерионосителей MRSA; К - контрольный штамм ОС3, М -маркер ДНК (100 п.н., 150 п.н., 200 п.н., 300 п.н., 400 п.н., 500 п.н., 600 п.н., 800 п.н., 1000 п.н., 1200 п.н., 1600 п.н., 2000 п.н., 3000 п.н., 4000 п.н., 5000 п.н.) KAPA Universal DNA ladder (KAPA, США).
Для оценки генетического разнообразия изоля-тов было проведено генотипирование штаммов MRSA. Все выщеленныге штаммы MRSA быши PVL-негативными. Выявлено наличие одного клона MRSA, распространённого среди ожоговыгх больных (табл. 2). Штаммы MRSA быши отнесены к генотипу ST239/spa3(t037)/agr1/SCCmecIn.1.1.2(IILA)/CoaIV. Тип SCCmec III.1.1.2 (IIIA), аналогичен Бразильскому клону (штамм HU25 [23]). В отличие от других ST239 вариантов, выщеленные штаммы имели ген tst, кодирующего синтез токсина синдрома токсического шока (рис. 2). По остальным признакам штаммы быши схожи с линией MRSA ST239, имели в составе ДНК гены lukED, гены, кодирующие гемолизины, гены, кодирующие суперантигены (sek and seq) и гены, кодирующие адгезины, в т.ч. коллаген-адгезин (cna). Штаммы MRSA, выщеленныге от ожоговых больных характеризовались множественной лекарственной устойчивостью — быши резистентны к аминогликозидам, макролидам, линкозами-дам, фторхинолонам, рифампицину, хлорамфениколу, сульфаметоксазолу; имели высокий уровень МПК к оксациллину и имипенему (табл. 2). Высокий уровень резистентности к рифампицину (MnK>128 мкг/мл) также является отличительным признаком. Важность мониторинга уровня устойчивости к рифампицину обусловлена тем, что по принципу параллельного ущерба этот признак исследователи рассматривают как предиктор формирования снижения чувствительности к гли-копептидам [22]. Все выделенные штаммы MRSA сохраняли чувствительность к ванкомицину (MnK, 0,5 мкг/мл), тейкопланину, линезолиду, мупироцину, триметоприму, фузидиевой кислоте.
У всех штаммов MRSA выявили наличие крупной плазмиды размером 2,9 т.п.н.
По результатам гель-электрофореза в пульсирующем поле установили полную генетическую однородность штаммов MRSA, выделенных от разных ожоговых больных.
Обсуждение
Гнойные осложнения в ожоговых центрах возникают в 30—50% случаев и являются одной из значимых проблем. Основной задачей лечения ожоговых больных является скорейшее восстановление кожных покровов, однако присоединение инфекции, приводящее к гнойному расплавлению аутодерматрансплантов, является фактором усугубляющим общее тяжёлое состояние пациента и в конечном итоге приводит к прогресси-рованию явлений ССВО и нарастанию СПОН. Множественная лекарственная устойчивость, а также резистентность к антисептическим препаратам микроорганизмов-возбудителей гнойных осложнений у ожоговых больных определяет их выживаемость в ране и проявляется в формировании толстого фибринозного налёта. Удаление налёта с обширной раневой поверхности приводит к субъективному улучшению состояния пациента, снижению температуры, улучшению самочувствия, уменьшению явлений энцефалопатии. Применение физических методов дебридмента раневой поверхности с использованием современных антисептиков, значительно уменьшает частоту локальных инфекционных осложнений.
По результатам исследования биоптатов, раневого отделяемого ожоговых больных в первые сутки госпитализации рост микроорганизмов получен в 25,5% случаев, доминировали грамположитель-ные микроорганизмы, в частности MSSA (37,8%).
На 10—50-е сутки госпитализации ожоговых больных рост микроорганизмов выявлен в 93,2% случаев; установлено изменение структуры возбудителей гнойных осложнений с увеличением доли полирезистентных микроорганизмов. Грамотри-цательная микрофлора (53,4%) занимает одно из ведущих мест в возникновении гнойных осложнений. При этом значительную роль играют НГОБ родов Pseudomonas и Acinetobacter — 38,0% от общего числа клинически-значимых штаммов, что является серьёзной проблемой, поскольку они ха-
ЛИТЕРАТУРА
1. Church D, Elsayed S., Reid O, Winston B, Lindsay R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev 2006; 19: 403—434.
2. Alexander J.W. Mechanism of immunologic suppression in burn injury. J Trauma 1990; 30 (12 Suppl): S70—75.
3. Griswold J.A. White blood cell response to burn injury. Semin Nephrol 1993; 13: 409—415.
4. Hansbrough J.F., Field T.O. Jr, Gadd M.A., Soderberg C. Immune response modulation after burn injury: T cells and antibodies. J Burn Care Rehabil 1987; 8: 509—512.
5. Heideman M, Bengtsson A. The immunologic response to thermal injury. World J Surg 1992; 16: 53—56.
рактеризуются высокой степенью резистентности к антимикробным препаратам — доля XDR — 18%, доля PDR — 67%. На 10—50-е сутки госпитализации также значительную роль играют стафилококки (38,7%), при этом MRSA составляют 20,9% от общего числа клинически значимых штаммов, а доля MRSA среди выделенных штаммов S.aureus значительно возросла (62,2%). Полученные данные свидетельствуют о превалировании микробных ассоциаций мульти- (MDR), экстремально резистентных возбудителей (XDR), а также панрезистентных микроорганизмов (PDR), что необходимо учитывать при планировании и проведении эмпирической терапии.
Значительно возросшую долю резистентных микроорганизмов у ожоговых больных на 10—50-е сутки можно объяснить длительностью антибио-тикотерапии, что является селекционным фактором и присоединением госпитальных штаммов. По результатам генотипирования, изучения профиля генов, кодирующих факторы вирулентности, антибиотикорезистентности штаммов MRSA, выделенных от разных ожоговых больных, установлена их полная генетическая однородность, что, вероятно, свидетельствует об их госпитальном происхождении.
Наличие в ране MRSA в ассоциации c A.bau-mannii и P.aeruginosa в этиологически значимом количестве приводит практически к тотальному лизису пересаженных аутодерматрансплантатов.
Доминирующими клонами MRSA в России являются ST239/spa3(t037)/SCCmecIIIA, ST239/ spa351(t030)/SCCmecIII и ST8/spa1(t008)/SCCmecIV
[23]. В г. Красноярске распространённым вариантом линии ST239 является уникальный вариант ST239Kras, характеризующийся наличием гена tst, кодирующего токсин синдрома токсического шока
[24]. Штаммы MRSA, выделенные от ожоговых больных, совпадают по характеристикам с распространённым в г. Красноярске уникальным вариантом ST239Kras. Штаммы MRSA, выделенные от ожоговых больных, характеризуются большим набором факторов вирулентности, антибиотикорезистент-ности, что значительно отягощает течение гнойных осложнений.
Выражение признательности. Мы благодарим Вей-Чун Хунг и Акихито Нишияма (Япония) за помощь в проведении данного исследования.
6. Lederer J.A., Rodrick M.L., Mannick J.A. The effects of injury on the adaptive immune response. Shock 1999; 11: 153—159.
7. Jason P. Heard J.P., McDonald K.M., Xing Y, Kluesner K.M, Liao J. et al. Regional and National Review of Factors Associated With Burn Wound Cellulitis. Journal of Burn Care & Research 2015; 36: 1: 23—32.
8. Винник Ю.С., МаркеловаH.M., Тюрюмин B.C. Современные методы лечения гнойных ран. Сибирское медицинское обозрение. — 2013. — № 1. — С. 18—24. / Vinnik YU.S, Markelova N.M., Tyuryumin V.S. Sovremennye metody lecheniya gnojnyh ran. Sibirskoe medicinskoe obozrenie 2013; 1: 18—24. [in Russian]
9. Jeschke M.G., Pinto R, Kraft R, Nathens A.B., Finnerty C.C., Gamelli R.L. et al. Morbidity and survival probability in burn patients in modern burn care. Crit CareMed 2015; 43: 808—815.
10. Mann E.A., Baun M.M., Meininger J.C, Wade C.E. Comparison of mortality associated with sepsis in the burn, trauma, and general intensive care unit patient: A systematic review of the literature. Shock 2012; 37: 4-16.
11. Alp E, Coruh A., Gunay G.K., Yontar Y, Doganay M. Risk factors for nosocomial infection and mortality in burn patients: 10 years of experience at a university hospital. J Burn Care Res 2012; 33: 379—385.
12. Collier J., Gottlieb L.J., Alverdy J.C. Stochasticity among Antibiotic-Resistance Profiles of Common Burn-Related Pathogens over a Six-Year Period Zachary. Surgical infections 2017; 18: 3: 327—335.
13. Сабирова E.B., Гординская H.A., Абрамова H.B., Некаева Е.С. Антиби-отикорезистентность нозокомиальных штаммов Staphylococcus spp., выделенных в ожоговом центре в 2002—2008 гг. Клин микробиол антимикроб химиотер. — 2010. — Т. — 12. — №1. — С. 77—81. / Sabirova E.V., Gordinskaya N.A., Abramova N.V., Nekaeva E.S. Antibiotikorezistentnost' nozokomial'nyh shtammov Staphylococcus spp., vydelennyh v ozhogovom centre v 2002—2008 gg. Klin mikrobiol antimikrob himioter. — 2010. — T. — 12. — №1. — S. 77—81. [in Russian]
14. Воробьева O.H., Денисенко Л.И., Жилина Н.М. Этиология гнойно-септических процессов у ожоговых больных Бюллетень СО РАМН. — 2010. — Т. 30. — № 6. — С. 57—63. / Vorob'eva O.N., Denisenko L.I., ZHilina N.M. EHtiologiya gnojno-septicheskih processov u ozhogovyh bol'nyh Byulleten' SO RAMN 2010; 30: 6: 57— 63. [in Russian]
15. Самарцев B.A., Еньчева Ю.А., Кузнецова M.B., Карпунина Т.И. Особенности инфицирования ожоговых ран Новости хирургии. — 2014. — Т. 22. — № 2. — С. 199—206. / Samarcev V.A.,. En'cheva YU.A, Kuznecova M.V., Karpunina T.I. Osobennosti inficirovaniya ozhogovyh ran Novosti hirurgii 2014; 22: 2: 199—206. [in Russian]
16. Туркутюков В.Б., Ибрагимова Т.Д., Шмагунова Е.В. Этиология гнойно-септических осложнений при ожоговой травме и мониторинг чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Тихоокеанский медицинский журнал. — 2012. — № 4. — С. 70—72. / Turkutyukov V.B., Ibragimova T.D., SHmagunova E.V. EHtiologiya gno-jno-septicheskih oslozhnenij pri ozhogovoj travme i monitoring chu-vstvitel'nosti mikroorganizmov k antibiotikam. Tihookeanskij medicin-skij zhurnal. — 2012. — № 4. — S. 70—72. [in Russian]
17. Takano T, Hung W.C., Shibuya M. et al. A new local variant (ST764) of the globally disseminated ST5 lineage of hospital-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) carrying the virulence determi-
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Хохлова Ольга Евгеньевна — к.б.н., доцент кафедры микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича, сотрудник Российско-Японского центра микробиологии, метагеноми-ки и инфекционных заболеваний ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России, Красноярск
Перьянова Ольга Владимировна — к.б.н., зав. кафедрой микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича, руководитель Российско-Японского центра микробиологии, метагено-мики и инфекционных заболеваний ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России, Красноярск
Владимиров Иван Владимирович — врач-хирург краевого ожогового центра КГБУЗ «Краевой клинической больницы», Красноярск
Мацкевич Владимир Адамович — зав. отделением, врач-анестезиолог-реаниматолог краевого ожогового центра КГБУЗ «Краевой клинической больницы», Красноярск Поткина Надежда Константиновна — научный сотрудник Российско-Японского центра микробиологии, мета-геномики и инфекционных заболеваний ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России, Красноярск
Капшук Дарья Николаевна — преподаватель кафедры микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России, Красноярск
nants of community-associated MRSA. Antimicrob Agents Chemother 2013; 57: 1589-1595.
18. International working group on the classification of staphylococcal cassette chromosome elements (IWG-SCC). Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 4961-4967.
19. Kondo Y, Ito T., Ma X.X., Watanabe S, Kreiswirth B.N., Etienne J., Hiramatsu K. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51: 264-274.
20. Iwao Y., Khokhlova O.E., Takano T., Hung W.C., Isobe H., Peryanova O.V. et al. Fatal pneumonia in HIVinfected patients from a novel ST239 methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying the toxic shock syndrome toxin-1 gene in Krasnoyarsk, Siberian Russia. Jpn J Infect Dis 2012; 65: 184-186.
21. Kado and Liu Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol 1981; 145: 1365-1373.
22. Tocmee B.B., KaaimozopcKan O.C., ÏoneHKo Ë.H., HepneHbKOH T.B., HayMeHKO 3.C., Bopornmoea T.M. u dp. AHTn6n0THK0pe3HCTeHTH0CTb MeTHôHëëHHope3HCTeHTHbix Staphylococcus aureus, ôHpêyaèpyroùHX b Pocchhckoh ÖeäepaöHH. Ahthôhothkh h XHMHOTep. — 2015. — T. 60. — № 1-2. — C. 3—9. / Gostev V.V., Kalinogorskaya O.S., Popenko L.N., CHernenkaya T.V., Naumenko Z.S., Voroshilova T.M. i dr. Antibiotikorezistentnost' meticillinrezistentnyh Staphylococcus aureus, cirkuliruyushchih v Rossijskoj Federacii. Antibiotiki i himioter. — 2015. — T. 60. — № 1-2. — S. 3—9. [in Russian]
23. PoMaHoe A.B., HepHoeE.A., SüdeAbwmeÜH M.B. MoaeKyaapHaa anHäe-
MHOaOrHa BHyTpHÔOabHHqHblX 3OëOTHCTbIX CTaÔHëOKOKKOB b CTaöH-
OHapax paçamHbix peraOHOB Pocchh. MOaeKyaapHaa MeäHöHHa. — 2013. — № 4. — C. 55—64. / Romanov A.V., CHernov E.A., EHjdel'shtejn M.V. Molekulyarnaya ehpidemiologiya vnutribol'nichnyh zolotistyh stafilokokkov v stacionarah razlichnyh regionov Rossii. Molekulyarnaya medicina. — 2013. — № 4. — S. 55—64.
24. Khokhlova O.E., Hung W-C, Wan T-W. et al. Healthcare- and Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Fatal Pneumonia with Pediatric Deaths in Krasnoyarsk, Siberian Russia: Unique MRSA's Multiple Virulence Factors, Genome, and Stepwise Evolution. PloS ONE 2015; 1: 1—30.
Копытко Людмила Николаевна — зав. бактериологической лабораторией КГБУЗ «Краевая клиническая больница», Красноярск
Гостев Владимир Валерьевич — к.б.н., научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии и эпидемиологии ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург
Сидоренко Сергей Владимирович — д.м.н., профессор, руководитель отдела молекулярной микробиологии и эпидемиологии ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург Ивао Ясухиса — PhD, научный сотрудник, Международного медицинского образовательно-исследовательского центра (IMERC) Ниигата, Япония
Ямамото Татсуо — профессор, руководитель Российско-Японского центра микробиологии, метагеномики и инфекционных заболеваний ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России, руководитель Международного медицинского образовательно-исследовательского центра (IMERC) Ниигата, Япония
