CC BY
6М.И. Лесюк1, О.Ю. Конева2, Е.А. Ровба2, А.М. Слуквин2
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ СТЕРЛЯДИ (ACIPENSER RUTHENUS L.)
1ОАО «Рыбхоз «Полесье», Республика Беларусь, 225734, Брестская обл., Пинский р-н, п/о П. Загородский, д. Вяз 2ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Осетровые - это древняя группа хрящевых видов рыб, ценнейшая в пищевом отношении, которая на протяжении 350 млн. лет своей эволюции практически не подверглась крупным морфологическим изменениям [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]. Высокие цены на данный вид рыбной пищевой продукции, интенсификация промысла, браконьерство, усиление антропогенного пресса на среду обитания осетровых привели к тому, что большинство видов находятся под угрозой исчезновения и демонстрируют наиболее низкую численность за всю историю их изучения, а некоторые из них почти исчезли [2, 8, 9, 10]. Во всем мире значительные усилия и исследования фокусируются на возобновлении численности осетровых рыб, разрабатываются методы их искусственного воспроизводства, товарного выращивания, выполняются исследования и разрабатываются программы по сохранению и увеличению численности природных популяций, а также проводятся мероприятия по реинтродукции, исчезающих популяций осетровых в бывшие ареалы их обитания [1, 2, 3, 11, 12, 13, 14, 15].
В настоящее время в водотоках Беларуси остался единственный представитель осетровых - стерлядь (Ас1рвтвг ги^впш L.). Если в первой половине ХХ века в бассейне реки Днепр в пределах Беларуси стерлядь была довольно многочисленной промысловой рыбой, то в настоящее время вылавливается единичными экземплярами. С 1981 года стерлядь включена в Красную книгу Беларуси, категория I (CR) - популяция вида, имеющего очень низкую численность, или как вид, находящийся под угрозой исчезновения [8].
Дефицит товарной рыбной продукции осетровых на рынке Беларуси восполнялся импортом из Российской Федерации. С целью сокращения импорта осетровых и для расширения видового разнообразия выращиваемой отечественными рыбоводными хозяйствами товарной рыбной продукции, в 2000 г. на территорию Республики Беларусь была завезена стерлядь из волжского региона Российской Федерации (ГУДП «Конаковский завод товарного осетроводства») [3, 16]. Со временем в ряде хозяйств ОАО «Рыбхоз «Полесье», ОАО «Рыбхоз «Селец», ОАО «Рыбхоз «Волма» и др. были сформированы маточные стада стерляди, налажено ее искусственное воспроизводство, а также получение рыбопосадочного материала и товарной рыбы.
Возможность вселения выращиваемой стерляди в водотоки Беларуси наталкивалась на международные обязательства по сохранению биоразнообразия из-за существовавшей опасности нанесения вреда со стороны вселенца для местной малочисленной днепровской популяции стерляди, находящейся на грани исчезновения. Поэтому возникла необходимость в установлении происхождения завезенной популяции стерляди. По просьбе специалистов ОАО «Рыбхоз «Полесье» Пинского района Брестской области в 2008-2009 гг. в рамках хозяйственного договора нами были выполнены идентификационные молекулярно-генетические исследования производителей стерляди с использованием микросателлитных маркеров. Из 240 особей маточного стада стерляди в 2008 г. было изучено 24 экз. (или 10% от численности маточного поголовья).
Задачей настоящей работы являлось продолжение начатых в 2008 г. молекулярно-генетических исследований стерляди по проверке гипотезы ее днестровско-днепровского происхождения с использованием микроса-теллитного метода на увеличенной выборке
маточного стада, сформированного в ОАО «Рыбхоз «Полесье».
В результате проведенных исследований было установлено, что завезенная из волжского региона стерлядь имеет днестровско-днепровское происхождение [16].
Материалы и методы
Материалом для исследования полиморфизма по микросателлитным локусам послужила выборка из 24-х особей производителей стерляди, взятых в 2009 г. в ОАО «Рыб-
хоз «Полесье» Пинского района Брестской области.
Количество изученных особей производителей стерляди приведено в табл. 1.
Таблица1
Выборки производителей стерляди весной 2009 г.
№ п/п Место отбора проб Дата отбора проб Число исследованных особей, шт. Пол Возраст особей
1 Маточный пруд №16 23.04.2009 г. 12 ? девятигодовик
2 Маточный пруд №16 23.04.2009 г. 12 в -«-
Итого 24 - -
Для молекулярно-генетических исследований прижизненно отбирали и фиксировали в 96%-ом этаноле тканевые пробы плавников, затем проводили выделение из них ДНК. Образцы отмывали от спирта дистиллированной водой, после чего от каждого образца плавника отрезали небольшой участок ткани (3*3 мм) и помещали в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл. Затем к каждому образцу приливали 500 мкл лизирующего буфера (10 мМ Ъ^-НС1, рН=7,5; 10 мМ №2ЭДТА, рН=8,0; 50 мМ ШС1; 2% SDS), 30 мкл протеиназы К (20 мг/ мл) и 30 мкл 1М ДТТ. Образцы помещали в термостат на 18 часов при 37 °С.
Для очистки ДНК к лизату добавляли по 500 мкл фенол-хлороформной смеси, центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 12 минут, водную фазу (аккуратно, не задевая осадок) переносили в чистую пробирку (повторяли дважды). Для более полной очистки ДНК к супернатанту добавляли 500 мкл хлороформа, центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 12 минут, водную фазу переносили в чистую пробирку. Далее в целях уменьшения потерь ДНК продукта добавляли по 35 мкл 5 М ШС1.
ДНК осаждали охлажденным [до -20°С] 96%-ным этанолом, центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 12 мин. Избавлялись от надосадка. Осадок промывали в 1 мл 70% этанолом, центрифугировали при 10 000 об./ мин в течение 12 мин. Затем осадок высушивали при комнатной температуре и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера.
Концентрацию и чистоту выделенной ДНК определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro UV/ Visible (Biochrom Ltd., Великобритания). Спектрофотометрический анализ степени загрязнения полученных препаратов ДНК белками, проведенный на основе соотношения коэфициентов поглощения А260/А280 с учетом фоновой компенсации при 320 нм для введения поправки на буферные растворы с высоким поглощением, подтвердил высокую степень очистки полученных препаратов ДНК. Среднее соотношение коэффициентов поглощения А260/А280 составило 1,71. Концентрация ДНК в препаратах, выделенных из плавников стерляди, в среднем составила 6,42 мг/мл.
Целостность полученной ДНК проверяли электрофоретически в 2%-ном агарозном геле (SeaKem LE Agarose, LONZA) с использованием ТВЕ-буфера. Ниже приведено изображение полученного геля с препаратами выделенной
Для выполнения молекулярно-генетических исследований был использован микросател-литный метод изучения ДНК по четырем микросателлитным локусам: LS-68, LS-19, LS-39 и Аох-45, по которым зарубежными исследователями был выявлен полиморфизм
При проведении наших исследований ПЦР выполняли на амплификаторе MyCycler™ (Bio-Rad, США). Реакционная ПЦР-смесь объемом 25 мкл содержала ПЦР-буфер 10х (c KCl) (Primtech); 3,3 мМ MgCl2, раствор dNTP's 10x; ~ 0,4 мкМ каждого праймера; 0,06 ед./мкл Taq ДНК-полимеразы (Primtech) и 1мкл ДНК рыб. Температурный режим амплификации представлен в табл. 3 Продукты амплификации (10 мкл реакцион-
ДНК (рис. 1). На изображении видны четкие одиночные полосы, а также заметно отсутствие шлейфа из ДНК. Вышеизложенные характеристики свидетельствуют о высокомолярной целостности ДНК.
среди 5 различных популяций стерляди из рек Днепр, Днестр, Волга, Кама и Дунай [9, 17].
Последовательность праймеров, использованных ими при проведении исследований представлена в табл. 2.
ной смеси) разделяли в 2,5%-ном агарозном геле (SeaKem LE Agarose, LONZA) в TBE-буфере. Гель окрашивали этидиум бромидом.
Частоту каждого аллеля по определенному локусу вычисляли как процент от общего количества аллелей по данному локусу. Все математические вычисления производили в программе Statistica 6.0. Обработку и анализ гелей производили в программе Quantity One 4.4.0.
Рис. 1. Агарозный гель с препаратами выделенной ДНК
Таблица 2
Последовательность праймеров к исследуемым микросателлитным локусам
Название праймера Последовательность
LS-19F 5'-CATCTTAGCCGTCTGGGTAC-3'
LS-19R 5'-CAGGTCCCTAATACAATGGC-3'
LS-39F 5'-TTCTGAAGTTCACACATTG-3'
LS-39R 5'-ATGGAGCATTATTGGAAGG-3'
LS-68F 5'-TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC-3'
LS-68R 5'-AGCCCAACACAGACAATATC-3'
Aox-45F 5'-TTGTTCAATAGTTTCCAACGC-3'
Aox-45R 5-TGTGCTCCTGCTTTTACTGTC-3'
Таблица 3
Температурный режим амплификации
Шаг Температура, °С Продолжительность Количество циклов
I 94 5' 1
Денатурация 94 1'
II Отжиг 55 30'' 33
Элонгация 72 30''
III 72 5' 1
IV 4 До ® 1
Результаты и обсуждение
Анализ полученных результатов молекулярно-генетических исследований стерляди в 2009 г. проводили по тем же четырем микросателлитным ло-кусам LS-68, LS-19, LS-39 и Аох-45, что и в 2008 г У анализируемых образцов с частотой 21,31% был обнаружен аллель (140) по локусу
LS-68, характерный только для днестровской популяции стерляди (присутствовал у 54% исследуемых особей), и с частотой 9,84% аллель (235) по тому же локусу, характерный только для днепровской популяции стерляди (присутствовал у 25% особей) (рис. 2).
Рис. 2. Агарозный гель продуктов амплификации по микросателллитному локусу
LS-68 у стерляди
Также у исследуемых образцов с частотой 27,58% присутствовал аллель (150) по локусу LS-19, характерный только для днестровской
популяции (отмечен у 33% особей) (рис. 3). Данные аллели отсутствовали у особей стерляди, принадлежащих к волжской популяции [17].
Рис. 3. Агарозный гель продуктов амплификации по микросателлитному локусу
LS-19 у стерляди
Для локуса LS-39, по сведениям польских и украинских ученых, не выявлено специфических аллелей у различных популяций стерляди [17]. На рис. 4 приведено изображение геля со спектром продуктов амплификации по локусу LS-39. По данному локусу кроме аллелей, выявленных в исследованиях зарубежных ученых, также было подтверждено наличие аллеля в 148 п.о., который был продемонстри-
рован нами в предыдущих исследованиях по идентификации стерляди [8]. В наших исследованиях данный аллель встречался с частотой 9,38% (у 12,5% особей). Также нами был выявлен еще один аллель в 152 п.о., который ранее не был описан и встречался с частотой 16,62% (у 21% исследуемых особей). Возможно, данные аллели (148, 152) характерны для популяции стерляди Днестра и Днепра.
Рис. 4. Агарозный гель продуктов амплификации по микросателлитному локусу
LS-39 у стерляди
По локусу Аох-45 зарубежными учеными [17] были отмечены специфические аллели, характерные для популяций стерляди из Волги и Днестра. Для днестровской популяции был специфичен аллель в 118 п.о., а для волжской - в 121 п.о.
В наших исследованиях по локусу Аох-45 был обнаружен аллель в 120 п.о., который встречался с частотой 20,56% (33,33% особей) (рис. 5). Однако представляется затруднительным отнести этот аллель к одному из двух маркеров, так как разница в три нуклеотида трудно вычленяема.
■I
Рис. 5. Агарозный гель продуктов амплификации по микросателлитному локусу
Aox-45 у стерляди
Таким образом, результаты повторных молекулярно-генетических исследований, полученные в 2009 г., подтвердили гипотезу днестровско-днепровского происхождения стерляди, завезенной в 2000 году из ГУДП «Конаковский завод товарного осетроводства» (Российская Федерация) в ОАО «Рыбхоз «Полесье» Пинского района Брестской области. Установлено, что аллели в 140 и 235 п.о. по локусу LS-68, аллель в 150 п.о. по локусу LS-19 являются специфичными для популяций стерляди Днестра и Днепра. Аллели 148 и 152 п.о. по локусу LS-39, возможно, также могут быть использованы для идентификации популяций днестровской и днепровской стерляди. Считаем, что использование локу-са Аох-45 в дальнейших исследованиях при идентификации популяционного происхожде-
ния стерляди является нецелесообразным.
В табл. 4-7 представлены обобщенные за два года (2008-2009 гг.) результаты генетической идентификации производителей стерляди в ОАО «Рыбхоз «Полесье». Исследованиям подвергнуто 20% маточного стада.
Как свидетельствуют данные, представленные в табл. 4, у анализируемых нами образцов, отобранных у 48 экз. производителей стерляди, по локусу LS-68 были обнаружены два специфических аллеля: (140), характерный только для днестровской популяции стерляди, с частотой 23,66% (присутствовал у 64,58% исследуемых особей) и (235), по тому же локусу, характерный только для днепровской популяции стерляди, с частотой 9,16% (присутствовал у 25% исследуемых особей).
Таблица 4
Обобщенные результаты генетической идентификации у 48 экземпляров стерляди
(Ларвтвг т^впт L.) по локусу LS-68
Локус Частота аллелей, % Количество особей, %
LS-68 140 23,66 64,58
235 9,16 25,0
Для локуса LS-19 был обнаружен специфи- днестровской популяции стерляди, с частотой ческий аллель (150), характерный только для 27,94% (отмечен у 39,58% особей) (табл.5).
Таблица 5
Обобщенные результаты генетической идентификации у 48 экземпляров стерляди
(Ларвтвг т^впт L.) по локусу LS-19
Локус Частота аллелей, % Количество особей, %
LS-19 150 27,94 39,58
По локусу LS-39 нами был обнаружен аллель (148) с частотой 13,33% (присутствовал у 20,85% особей) и аллель (152) с частотой 6,66% (отмечен у 10,42% особей) (табл.6).
Считаем, что обнаруженные нами аллели по локусу LS-39, также характерны для популяции стерляди Днестра и Днепра.
Таблица 6
Обобщенные результаты генетической идентификации у 48 экземпляров стерляди
(Ларвтвг т^впт L.) по локусу LS-39
Локус Частота аллелей, % Количество особей, %
LS-39 148 13,33 20,85
152 6,66 10,42
Как свидетельствуют данные, представленные в табл. 7, для локуса Аох-45 нами был обнаружен аллель (120), который встречался с частотой 8,33% (присутствовал у 18,75% исследуемых особей). По данным польских и украинских ученых, именно по этому локусу были отмечены специфические аллели, по отдельности характерные для популяций стерляди Волги и Днестра (для днестровской популяции оказал-
ся специфичен аллель в 118 п.о., для волжской - в 121 п.о.) [17]. Однако, обобщив массив полученных данных за 2 года, мы считаем, что данный аллель не может быть использован при идентификации принадлежности стерляди к той или иной популяции (Днестр, Волга), так как затруднительно дать точную оценку, к какому молекулярному маркеру следует отнести обнаруженный аллель, по разнице в три нуклеотида.
Таблица 7
Обобщенные результаты генетической идентификации у 48 экземпляров стерляди
(Ларвтвг т^впт L.) по локусу Аох-45
Локус Частота аллелей, % Количество особей, %
Аох-45 120 8,33 18,75
Заключение
Результаты повторных генетических исследований подтвердили, что завезенный в 2000 г. из ГУДП «Конаковский завод товарного осетроводства» (Российская Федерация) и выращенный до производителей в ОАО «Рыбхоз «Полесье» (Республика Беларусь) рыбопоса-дочный материал стерляди не принадлежал к волжской популяции стерляди (Каспий-
ский бассейн), а относился к популяциям рек Днестра и Днепра (Черноморский бассейн). На основании полученных нами за два года обобщенных данных, установлено, что аллели в 140 и 235 п.о. по локусу LS-68, аллель в 150 п.о. по локусу LS-19 можно рассматривать как специфические для стерляди Днестра и Днепра. Аллели (148 и 152) по локусу LS-39,
возможно, также могут быть использованы для идентификации популяций днестровской и днепровской стерляди.
Установлено также, что микросателлитные маркеры ДНК являются эффективным средством в определении популяционной принадлежности осетровых.
Полученные факты, свидетельствующие о днестровско-днепровском происхождении стерляди в одном из рыбоводных хозяйств республики, открывают реальные перспективы для выполнения работ по реинтродукции, выращиваемой в белорусском хозяйстве стерляди в реки бассейна Днепра и Днестра с целью
восстановления численности популяций, находящихся под угрозой исчезновения и занесенных в Красные книги Республики Беларусь, Российской Федерации, Украины и Молдовы.
Считаем, что для разработки практических рекомендаций по интродукции стерляди из рыбоводных хозяйств в реки трансграничных регионов бассейнов Днепра и Днестра необходимо проведение широкомасштабного международного проекта по генетической инвентаризации маточных стад стерляди в рыбоводных хозяйствах всех стран-участниц, а также изучению мест выпуска стерляди в естественные ареалы обитания.
Список использов
1. Барулин, Н.В. Аквакультура осетровых рыб / Н.В. Барулин, А.И. Лашкевич // Интенсивные рыбные технологии [Электронный ресурс]. - 2007. - Режим доступа: http://www. nft.by/index.php?name=Pages&op=page&pid= 10&pagenum=1. - Дата доступа: 25.08.2010.
2. Васильева, Л.М. Биологические и технологические особенности товарной аква-культуры осетровых в условиях Нижнего Поволжья. - Астрахань, 2000. - 189 с.
3. Кончиц, В., Мамедов, Р. Осетроводство в Беларуси. Состояние и перспективы // Сб. науч. статей посвящ. 60-летию научно-исследоват. рыбох. станции. - Кишинев, 2005. - С. 38-40.
4. Рожкован, К.В. Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii (Brandt, 1896) и Huso dauricus (Georgii, 1775): Автореферат дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук Рожкован, К.В.: 03.00.15 / К.В. Рожкован; Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН. - Владивосток, 2008. - 22 с.
5. Рожкован, К.В., Челомина, Г.Н., Ра-чек, Е.И. Идентификация межвидовых гибридов осетровых рыб методом RAPD-PCR анализа // Сб. науч. тр. Молекулярная и прикладная генетика: Международная научная конференция «Современные проблемы генетики». - Минск, 2005. -Том 1. - С. 110.
6. Шандиков, Г. Русский осетр и его родственники / Г. Шандиков // Электронный
нных источников
журнал: Экспедиция. - 2004. - №1 (2). -Режим доступа: http://www.qzhyh.com/04/be-luga.html. - Дата доступа: 25.08.2010.
7. Krieger, J. Evidence for a Slowed Rate ofMo-lecular Evolution in the Order Acipenserriformes / J. Krieger, P A. Fuerest // Mol. Biol. Evol. / Department of Molecular Genetics and Department of Evolution, Ecology and Organismal Biology, The Ohio State University. - Ohio, 2002. -Vol. 19, №6. - P. 891-897.
8. Красная Книга Республики Беларусь. Животные. - Минск: Бел. энцыклапедыя, 2004. - С. 181-182.
9. Coad, B.W. Species Account - Acipenseri-dae / B.W. Coad // Freshwater Fishes of Iran. -2009. - Vol. 1. - P. 1-13.
10. Ludwig, A. First evidence of hybridization between endangered sterlets (Acipenser ru-thenus) and exotic Siberian sturgeons (Acipenser baerii) in the Danube River / A. Ludwing, S. Lippold, L. Debus // Biol Invasions. - 2009. -Vol. 11. - P. 753-760.
11. Козлов, В.И. Технология выращивания осетровых рыб / Л.С. Абрамович, В.И. Козлов // Товарное осетроводство. М.,1980. -С. 70-73.
12. Kolman, R., Kapusta, A. Actual status and active protection of sturgeon fish populations endangered by extinction / R. Kolman, A. Ka-pusta. - Wyd. IRS. - 2008. - 310 p.
13. Timoshkina, N. Intraspecific genetic polymorphism of Russian Sturgeon Acipenser gueldenstaedtii / N. Timoshkina, A. Barmint-seva, A. Usatov, N. Mugue // Animal Genetic. -
2009. - Vol. 45. - P. 1098-1106.
14. Timoshkina, N. Molecular-genetic markers in studies of intra- and Intrerspecies polymorphism in surgeon (Acipenseriformes) / N. Timoshkina, D. Vodolazhskii, A. Usatov // Ekologicheskaya Genetika. - 2010. - Vol. 8, №1. - P. 12-24.
15. Fopp-Bayat, D. Microsatellite DNA variation in the Siberian sturgeon, Acipenser baeri (Actinopterygii, Acipenseriformes, Acipenseri-dae), cultured in a polish fish farm / D. Fopp-Bayat // Acta ichtyologica et piscatoria. - 2010. -Vol. 40, №1. - P. 21-25.
16. Слуквин, А.М., Конева, О.Ю., Лесюк, М.И. Генетическая идентификация
стерляди (Acipenser ruthenus L.), выращенной в ОАО «Рыбхоз «Полесье» Пинского района Брестской области, по микросателлитным маркерам // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - Минск, 2009. -Том 9. - С. 146-152.
17. Fopp-Bayat, D., Kolman, R., Tretyak, A., Woznicki, P. Microsatellite DNA analysis of sterlet (Acipenser ruthenus Brandt) from five European river drainage areas. Actual status and active protection of sturgeon fish populations endangered by extinction [Aktualny stan i aktywna ochrona naturalnych populacji ryb jesiotrowatych zagrozonych wygini^ciem] / R. Kolman, A. Ka-pusta. Wyd. IRS. - 2008. - P. 223-234.
Дата поступления статьи 27 октября 2011 г.
