CC BY
4УДК 577.21:597.442:575.17
Слуквин А.М.1, Конева О.Ю.1, Лесюк М.И.2
генетическая идентификация стерляди (ACIPENSER RUTHENUS l.), выращенной в оао
«рыбхоз «полесье» пинского района брестской области,
по микросателлитным маркерам
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2ОАО «Рыбхоз «Полесье», Республика Беларусь, 225734, Брестская обл., Пинский р/н, п/о П. Загородский, д. Вяз
Введение
Молекулярно-генетическая идентификация в настоящее время стала одним из важнейших доказательств внутривидовой принадлежности особей к той или иной популяции при осуществлении работ по реинтродукции исчезающих популяций в бывшие ареалы их обитания. В этих целях употребляются различные методы, в частности, методы определения полиморфизма структурных генов на основе изменчивости электрического заряда их продуктов - белков, а также методы выявления полиморфизма по сайтам рестрикции фрагментов ДНК (RFLP - restriction fragment length polymorphism). Однако белковый полиморфизм, как правило, ограничен, а рестрикт-ный анализ трудоемок. Высокий уровень полиморфизма внутри различных видов рыб, в том числе и у осетровых, удалось выявить по некоторым микросателлитным локусам [1].
Популяционная идентификация и контроль генетической изменчивости являются обязательными условиями успешного сохранения и использования различных популяций стерляди АЫрвтвг ги^впш Ь.
Целью настоящей работы являлась популяционная идентификация стерляди, выращенной в прудах ОАО «Рыбхоз «Полесье» путем проведения молекулярно-генетического анализа с использованием микросателлитного метода.
В задачи настоящей работы входили: получение и сравнительный анализ спектра амплико-нов у исследуемой стерляди при использовании праймеров к некоторым три- и тетрануклеотид-ным микросателлитным повторам; оценка эффективности использования микросателлитных маркеров для определения популяционной принадлежности особей стерляди.
Материал и методы
Материалом для исследования полиморфизма по микросателлитным локусам послужила выборка производителей и мальков стерляди, взятых в период нерестовой кампании 2008 г. в ОАО «Рыбхоз «Полесье» Пинского района Брестской области. В настоящий период в хозяйстве сформировано маточное стадо стерляди в количестве 224 экз. Производители выращены в прудах из двухгодовиков стерляди,
завезенных в 2000 г. из волжского бассейна (ГУДИ «Конаковский завод товарного осетроводства», г. Конаково, Тверская область, РФ). Из-за существовавшего ранее мнения, что это волжская, либо обская популяции стерляди, рыбу выращивали, преимущественно, в качестве товарной продукции.
Количество изученных рыб в ОАО «Рыбхоз «Полесье» приведено в таблице 1.
Таблица 1
Выборки производителей и личинок стерляди весной 2008 г.
№ п/п Место отбора проб Дата отбора проб Число исследованных рыб (шт.) Пол Возраст рыб
1 Инкубационный цех хозяйства 10.05.2008 14 ? восьмигодовик
2 Инкубационный цех хозяйства 10.05.2008 10 в -«-
3 Инкубационный цех хозяйства 25.05.2008 12 личинка
Материалом для сравнительного исследования полиморфизма микросателлитных локу-сов послужили также опубликованные данные по выборкам производителей стерляди из рек Кама, Днепр, Днестр, Волга, Дунай [2].
Для молекулярно-генетических исследований прижизненно отбирали и фиксировали в 96%-ом этаноле тканевые пробы плавников рыб. ДНК выделяли из законсервированных в спирте плавников стерляди Acipenser ш^пш Ь. Образцы отмывали от спирта дистиллированной водой, затем плавники измельчали ножницами, помещали в пробирки типа Эпендорф объемом 1,5 мл (препараты личинок стерляди брали целиком). Далее к образцам приливали 500 мкл лизирующего буфер (10 мМ Т^-НС1, рН=7,5; 10 мМ Ш2ЭДТЛ, рН=8,0; 50 мМ Ш-С1; 2% SDS), 30 мкл протеиназы К (20 мг/мл), 30 мкл 1 М ДТТ. Образцы помещали в термостат на 12 часов при 56°С. Далее к лизату добавляли фенол-хлороформную смесь, центрифугировали при 12 000 об./мин. в течение 15 минут, водную фазу переносили в чистую пробирку (повторяли дважды). Для более полной очистки ДНК к супернатанту добавляли хлороформ, центрифугировали при 12 000 об./ мин. в течение 10 минут, водную фазу переносили в чистую пробирку (перед экстракцией ДНК фенол-хлороформной смесью в пробирки добавляли 3М ацетат натрия (рН=7,5) до концентрации 0,3 М с целью уменьшения потерь ДНК во время фенольной экстракции).
ДНК осаждали охлажденным до -20°С 96%
этанолом, центрифугировали при 12 000 об./ мин. в течение 15 мин. Осадок промывали 70% этанолом, центрифугировали при 12 000 об./ мин. в течение 15 мин. Далее осадок высушивали при комнатной температуре и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера.
Концентрацию и чистоту выделенной ДНК определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro UV/Visible (Biochrom Ltd.). Спектрофотометрический анализ степени загрязнения полученных препаратов ДНК белками, проведённый на основе соотношения кооэфициентов поглощения А260/ А280 (норма в диапазоне 1,9-2,0) с учевведения поправки на буферные растворы с высоким поглощением, подтвердил высокую степень очистки полученных препаратов ДНК. Среднее соотношение коэффициентов поглощения А260/А280 составило 2,01±0,06. Концентрация ДНК в препаратах, выделенных их плавников стерляди, в среднем составила 5,66±1,50 мг/мл; в препаратах, выделенных из мальков стерляди - 1,74±0,69 мг/мл.
Целостность полученной ДНК проверяли электрофоретически в 2% агарозном геле (SeaKem LE Agarose, LONZA) в ТВЕ-буфере. Ниже приведено изображение полученного геля с препаратами выделенной ДНК (Рис. 1), свидетельствующее о высокомолекулярном целостном состоянии ДНК (видны одиночные четкие полосы, отсутствует шлейф из ДНК, говорящий о ее деградированном состоянии).
^ — - — « —г ^ ^ ff -- ó » от — —
t W Ь И И h-H 1 И »1 И i И ч И ' 1 * И \ М J t. 4 1 t *
Рис. 1. Агарозный гель с препаратами выделенной ДНК.
До некоторого времени при проведении молекулярно-генетических исследований полиморфизма ДНК у растений и животных использовали RAPD-маркеры (RAPD, Random Amplified Ро1уmorphism DNA markers) [3-6]. Метод основан на применении в качестве пары праймеров для полимеразной цепной реакции одной и той же последовательности в 10 нуклеотидов, т.е. в результате амплифицируются последовательности, заключенные между инвертированными повторами этого декануклеотида. Оказалось, что некоторые декануклеотиды позволяют получать высокополиморфные спектры ам-пликонов [3]. Сегодня этот метод используется реже. К его недостаткам относят доминантные/рецессивные взаимоотношения между аллельными вариантами ампликона (присутствие ампликона определенной длины может представлять и гомо- и гетерозиготное состояние локуса), «анонимность» амплифицируемых последовательностей в отношении их локализации и функции, сложность воспроизводства спектра ампли-конов в связи с большим количеством ошибок отжига из-за его относительно низкой температуры.
Одной из попыток увеличения точности отжига и воспроизводства высокополиморфных спектров ампликонов является использование в качестве пары праймеров части последовательностей микросателлитных локусов. Такой подход увеличивает точность отжига, воспроизводимость амплифициро-ванных фрагментов и уменьшает «анонимность» амплифицируемых участков, поскольку о них, по крайней мере, известно, что это относительно короткие фрагменты ДНК, заключенные между инвертирован-
ными повторами микросателлитного локуса. Получаемый спектр ампликонов имеет определенные ограничения, связанные с условиями амплификации, так, в частности, недоступными для анализа являются фрагменты слишком большой длины (больше 2,5-3 т.п.о.) [7].
В наших исследованиях происхождение стерляди из ОАО «Рыбхоз «Полесье» было изучено с использованием микросателлит-ного анализа по четырём микросателлит-ным локусам: LS-68, LS-19, LS-39 и Аох-45 (Табл.2),- предложенным в работе Dorota Fopp-Bayat et al. [2]. В исследованиях Bernie May et al. [1] и King et al. [8], именно по этим локусам, был выявлен значительный полиморфизм среди различных видов осетровых.
ПЦР производили на амплификаторе My-CyclerTM (Bio-Rad, США) при температурном режиме, представленном в таблице 3.
Реакционная ПЦР-смесь объёмом 25 мкл содержала ПЦР-буфер 10х (c KCl) (Fermentas); 2,5 мМ хлорид магния, раствор dNTP's 10x; -0,4 мкМ каждого праймера; 0,06 ед./ мкл Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и образцы ДНК животных (20-70 нг).
Продукты амплификации (7 мкл реакционной смеси) разделяли в 2,5% агароз-ном геле (SeaKem LE Agarose, LONZA) в TBE-буфере. Гель окрашивали этидиум бромидом.
Частоту каждого аллеля по определённому локусу вычисляли как процент от общего количества аллелей по данному локусу. Все математические вычисления производили в программе Statistica 6.0. Обработку и анализ гелей производили в программе Quantity One 4.4.0.
Таблица 2
Последовательность праймеров к исследуемым микросателлитным локусам
Название праймера Последовательность
Ь8-19Б 5'-CATCTTAGCCGTCТGGGTAC-3'
5'-CAGGTCCCTAATACAATGGC-3'
Ь8-39Б 5'-TTCTGAAGTTCACACATTG-3'
LS-39R 5'-ATGGAGCATTATTGGAAGG-3'
Ь8-68Р 5'-TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC-3'
LS-68R 5'-AGCCCAACACAGACAATATC-3'
Аох-45Б 5'-TTGTTCAATAGTTTCCAACGC-3'
Aox-45R 5'-TGTGCTCCTGCTTTTACTGTC-3'
Таблица 3
Температурный режим амплификации
шаг Температура, °С Продолжительность Количество циклов
I 94 5' 1
Денатурация 94 1'
II Отжиг 55 30'' 33
Элонгация 72 30''
III 72 5' 1
IV 4 До ® 1
Результаты и обсуждение
При проведении микросателлитного анализа с использованием праймеров к микросателлит-ным локусам LS-68, LS-19, LS-39 и Аох-45 было установлено днестровско-днепровское происхождение стерляди, выращиваемой в ОЛО «Рыбхоз «Полесье» Пинского района Брестской области. При интерпретации полученных нами результатов микросателлитного анализа мы опирались на данные, представленные в статье Dorota Fopp-Bayat et а1., 2008 [2], где
авторы с помощью микросателлитного анализа по вышеуказанным локусам проанализировали 5 различных популяций стерляди (Волга, Кама, Днепр, Днестр, Дунай) и выявили для некоторых из популяций специфические аллели по тому или иному локусу.
Ниже представлена таблица частот аллелей, полученных у исследуемых нами особей стерляди по анализируемым локусам (Табл. 4).
Таблица 4
Частота аллелей для популяции стерляди ОАО «Рыбхоз «Полесье»
Локус Частота аллелей, %
LS-68 140 27,9
164 4,4
185 13,2
207 30,9
228 14,7
235 8,8
LS-19 138 66,66
150 30,55
164 2,77
LS-39 121 7,14
126 38,09
133 26,19
138 11,90
148 16,60
Аох-45 120 1,49
130 10,44
137 10,44
143 10,44
150 23,88
156 13,43
163 5,97
170 16,41
174 7,46
У анализируемых нами образцов был обнаружен аллель (140) по локусу LS-68, характерный только для днестровской популяции стерляди, с частотой 27,9% (присутствовал у 75% исследуемых особей), и аллель (235) по тому же локусу, характерный только для днепровской популяции стерляди, с частотой 8,8% (присутствовал у 25%
особей) (Рис.2). Также у исследуемых образцов присутствовал аллель (150) по локусу LS-19, опять же, характерный только для днестровской популяции, с частотой 30,55% (отмечен у 41,66% особей) (Рис.3). Данные аллели отсутствовали у особей стерляди, принадлежащих к волжской популяции [2].
Рис. 2. Агарозный гель продуктов амплификации по микросателллитному локусу LS-68 популяции стерляди
ОАО «Рыбхоз «Полесье»
Рис. 3. Агарозный гель продуктов амплификации по микросателлитному локусу LS-19 популяции стерляди
ОАО «Рыбхоз «Полесье».
Последние данные изучения различных популяций стерляди показали, что по локусу Аох-45, обнаружены специфические аллели, характерные для рыб только из Волги и Днестра [2]. Для волжской популяции был специфичен аллель в 118 пар оснований, а для днестровской - в 121 пару оснований. В нашей работе похожий аллель был обнаружен только у одной из 24 анализируемых особей. Программой Quantity One 4.4.0 он был дифференцирован, как соответствующий 120 парам оснований (Рис. 4).
Таким образом, по полученным образцам гелей по локусу Аох-45 представляется трудным более точно оценить, к какому молекулярному маркеру всё же отнести этот аллель. По нашему мнению, вышеупомянутые аллели по локусу Аох-45 не являются специфичными для какой-либо из популяций стерляди, так как разница в три нуклеотида трудно вычленяема.
Считаем, что аллель в 118 пар оснований и 121 пару оснований можно идентифицировать как один и тот же.
Рис. 4. Агарозный гель продуктов амплификации по микросателлитному локусу Аох-45 популяции стерляди
ОАО «Рыбхоз «Полесье».
Нами также проанализирован локус LS-39, который по сведениям польских и украинских ученых не выявил специфических аллелей у различных популяций стерляди [2]. На рисунке 5 приведено изображение геля со спектром продуктов амплификации по локусу LS-39, полученного при анализе выборки из популяции производителей стерляди ОАО
«Рыбхоз «Полесье». Показано, что по данному локусу, кроме ранее выявленных аллелей [2], был обнаружен еще один аллель (148). Этот аллель встречался с частотой 16,6% и присутствовал у 29% исследованных нами особей. Возможно, этот аллель характерен для популяций стерляди Днестра и Днепра.
Рис. 5. Агарозный гель (элекрофореграмма) продуктов амплификации по микросателлитному локусу LS-39
популяции стерляди ОАО «Рыбхоз «Полесье».
Таким образом, полученные нами результаты позволяют предположить, что завезенный из города Конаково (РФ) и выращенный до производителей в ОАО «Рыбхоз «Полесье»
(Республика Беларусь) рыбопосадочный материал стерляди вероятнее всего, принадлежит к популяции рек Днестра и Днепра (Черноморский бассейн). Установлено, что микро-
сателлитные маркеры являются эффективным средством в определении популяционной принадлежности стерляди. Аллель (148) по локусу
LS-39, возможно, также может быть использован для идентификации популяций днестровской и днепровской стерляди.
заключение
Установленные нами факты днестровско-днепровского происхождения стерляди, выращиваемой в ОАО «Рыбхоз «Полесье» с использованием микросателлитного анализа ДНК, открывают реальные перспективы для планирования и выполнения работ по реинтро-дукции выращиваемой в белорусском хозяйстве стерляди в реки бассейна Днепра с целью восстановления днепровской популяции, находящейся под угрозой исчезновения и зане-
сенной в Красные книги Республики Беларусь, Российской Федерации, Украины.
Окончательным аргументом в установлении популяционно-генетической принадлежности стерляди, выращенной в ОАО "Рыбхоз "Полесье", могут явиться молекулярно-генетические исследования обской стерляди и останков жучек днепровской стерляди, обнаруженных при археологических раскопках на берегах реки Припять, самого крупного притока Днепра.
Список использованных источников
1. Bernie May, Charles C. Krueger, and Harold L. Kincaid. Genetic variation at microsatellite loci in sturgeon: primer sequence homology in Acipenser and Scaphirhynchus // Can. J. Fish. Aquat. Sci. - 1997. - 54. - P. 1542-1547.
2. Dorota Fopp-Bayat, Ryszard Kolman, Aleksander M. Tretyak, Pawel Woznicki. Microsatellite DNA analysis of starlet (Acipenser ruthenus Brandt) from five European river drainage areas. Actual status and active protection of sturgeon fish populations endangered by extinction [Aktualny stan i aktywna ochrona naturalnych populacji ryb jesiotrowatych zagrozonych wygini^ciem] - Red. R. Kolman, A. Kapusta. Wyd. IRS. - 2008. - P. 223-234.
3. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. // Nucl. Acids Res. - 1990. - 18. - P. 7213-7218.
4. Williams, J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. L, Rafalscki J. A., Tingly S. K DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. // Nucl. Acids
Res. - 1990. - 18. - P. 6513-6535.
5. Caetano-Anolles G., Gresshoff M. DNA amplification fingerprinting using arbitrary mini-hairpin oligonucleotide primers // Biotechnology. - 1994. - 12. - P. 619-623.
6. В.И.Глазко, А.В. Дубин, Р. Н. Календарь, Г. В. Глазко, В. И. Шерепитко, А. А.Созинов. Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR маркеров // Цитология и генетика, -1999, - Т. 33, - № 5, - С. 47-51.
7. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by sequence repeat (SSR) - anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. - 1994. - 20. -P. 176-183.
8. King T. L., Lubinski B. A., Spidle A. P. 2001 - Microsatellite DNA variation in Atlantic sturgeon (Acipenser oxyrinchus oxyrinchus) and cross-species amplification in the Acipenseridae // Cons. Genet. 2. -P. 103-119.
Дата поступления статьи 14 апреля 2009 г.
