Молекулярно-генетические исследования по изучению генома новых бактериофагов Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

БИОЛОГИЯ. ВЕТЕРИНАРИЯ

УДК 619:616-07

молекулярно-генетические иссдедования по изучению генома новых бактериофагов

С.Н. Золотухин, доктор биологических наук, профессор ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Д.А. Васильев, доктор биологических наук, профессор ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

8(84231)55-95-47

Ключевые слова: Бактериофаги, энтеробактерии, фаголизаты, осаждение бактериофагов, нуклеиновые кислоты, ДНК, РНК, размер генома, электрофорез, агарозный гель; рестрикционный анализ.

Работа посвящена определению типа нуклеиновой кислоты и размера генома у 14-ти новых бактериофагов патогенных энтеробактерий. При проведении молекулярно-генетических исследований авторами установлено, что нуклеиновые кислоты всех изученных фагов представлены типом ДНК размером от 45000 п.о. до 67000 п.о.

введение

Всесторонние исследования по изучению бактериофагов, выполненные за последние 40-50 лет, позволили широко использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, иммунологии, радиобиологии, биотехнологии и других областях биологических исследований. Поэтому учение о фагах, развивающееся вначале как узкая область медицинской и ветеринарной микробиологии, в настоящее время приобрела общебиологическое значение.

В течение двух последних десятилетий преобладало мнение, что изучение фагов уже не может дать науке ничего принципиально нового. В России при возникновении и развитии генной инженерии произошла утрата интереса к изучению фагов, и лишь единичные научные лаборатории в настоящее время продолжают заниматься фундаментальными исследо-

ваниями бактериофагов. Однако, несмотря на накопленный большой научный материал по изучению биологических свойств бактериофагов, многие вопросы требуют дополнительных исследований. Так, например, у большинства, как считалось ранее, глубоко изученных модельных эшерихиозных фагов Т-серии так и не удалось выяснить функцию двух третей синтезируемых ими продуктов (В.Н. Крылов, 2003). Кроме того, нет единой схемы таксономии и морфологической классификации этих микроорганизмов, отсутствуют стандартные наборы бактериофагов многих возбудителей заболеваний животных и человека, а также схемы и регламенты их применения (В.С. Русалеев, 1990; 1992).

Интерес к фагам у отечественных исследователей возродился сравнительно недавно по ряду причин и, прежде всего, с возникновением множественноустойчивых к антибиотикам возбудителей

Вестник УГСХА №1(11) май - июнь 2010 65

разных болезней. Кроме того, в настоящее время в результате молекулярногенетических исследований была выявлена связь генома патогенности бактерий с профагом и отмечена возможность генетического обмена не только между бактериями и фагами, но и между фагами и эукариотами (В.Н. Крылов, 2003).

Целью исследований было изучение типа и размера генома у выделенных и селекционированных нами фагов патогенных энтеробактерий.

объекты и методы исследований

Материалом для исследований явились 14 штаммов бактериофагов энтеробактерий родов Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, видов, Y. entero-colitica, М. morganii и E. coli сероваров O157:H7 и H-, предложенных нами для изготовления диагностических и лечебнопрофилактических препаратов.

Для изучения типа нуклеиновой кислоты и молекулярной массы генома бактериофагов нами поэтапно были проведены следующие исследования:

1. освобождение фаголизатов от фрагментов бактериальных клеток;

2. осаждение бактериофагов;

3. выделение нуклеиновых кислот фагов;

4. определение типа нуклеиновой кислоты;

5. определение размера генома фагов электрофорезом в агарозном геле;

6. рестрикционный анализ генома фагов;

В работе было использовано четырнадцать штаммов бактериофагов различных энтеробактерий в виде лизатов бульонных культур в титрах 2,1-5,9*109 фаговых корпускул в 1,0 см3 (табл.1).

Для освобождения фаголизатов от обломков бактериальных клеток исследуемый материал разливали по 100,0 см3 в стеклянные стерильные центрифужные флаконы и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 40 мин.

После центрифугирования надоса-дочную жидкость осторожно переливали (чтобы не попал осадок) в другие центрифужные пробирки также по 100,0 см3, которые центрифугировали на высокоскоростной центрифуге в режиме при 19 000 об./мин в течение 5 часов для осаждения вирионов бактериофагов. Затем надосадок сливали, а из осадка готовили суспензию для выделения нуклеиновых

Таблица 1

№ п/п Название фага Объем материала Титр фагов по Грациа (корпускул фага в 1 см3)

1 Y. enterocolitica Y/9 500 см3 2,5х109

2 Enterobacter En-13 500 см3 3,4х109

3 Enterobacter En-2 500 см3 4,2х109

4 Klebsiella K-10 500 см3 5,1х109

5 Klebsiella K-80 500 см3 3,7х109

6 Citrobacter C-61 500 см3 4,8х109

7 E. coli O157 E-67 500 см3 5,9х109

8 E. coli O157 E-67 500 см3 2,1х109

9 Proteus П-16 500 см3 3,2х109

10 Proteus П-261 500 см3 4,1х109

11 М. morganii М-17 500 см3 2,2х109

12 М. morganii М-20 500 см3 2,7х109

13 Citrobacter C-66 500 см3 3,1х109

14 Citrobacter C-52 500 см3 5,4х109

Таблица 2

Результаты электрофореза при определении типа нуклеиновой кислоты у бактериофагов

№ п/п Название фага Результат электрофореза

в контроле после обработки РНК-азой после обработки ДНКазой

1 Y. enterocolitica Y/9 + + -

2 Enterobacter En-13 + + -

3 Enterobacter En-2 + + -

4 Klebsiella K-10 + + -

б Klebsiella K-80 + + -

б Citrobacter C-61 + + -

7 E. coli O157 E-67 + + -

В E. coli O157 E-67 + + -

9 Proteus П-16 + + -

10 Proteus П-261 + + -

11 М. morganii М 17 + + -

12 М. morganii М 20 + + -

13 Citrobacter C-66 + + -

14 Citrobacter C-52 + + -

Примечание : «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат

кислот, для чего его растворяли в 200,0 см3 1хТЕ буферного раствора рН7,5 (ТЕ-10 тМ Трис и 1 тМ ЭДТА).

Для выделения нуклеиновых кислот к приготовленной суспензии добавляли: 10% от объема SDS (10 % додицилсуль-фат натрия) и 20 % от объема 5 М NaCl, перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре.

К полученной смеси добавляли равный объем фенола (рН 7,5), перемешивали в течение 5 мин, затем ее центрифугировали на микроцентрифуге системы «эппендорф» при 10 000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную верхнюю водную фазу отбирали и переносили в другую чистую пробирку «эппендорф», к которой добавляли равный объем фенола (рН 7,5) и перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 5 мин.

После этого верхнюю водную фазу

переносили в другую чистую пробирку «эппендорф», куда вносили равный объемом хлороформа (рН 8) и перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость вносили в стерильную пробирку и добавляли в нее 10% от объема AcNa и 2,5 объема 96% этилового спирта для осаждения нуклеиновых кислот.

Полученную смесь выдерживали при -20°С в течение 18 часов, а затеем центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 5 мин., промывали пробы 75% этиловым спиртом; осадки растворяли в 40 мкл Н2О.

Для проведения электрофореза в 2% агаровый гель вносили по 10 мкл каждой пробы.

После электрофореза проводили обработку нуклеиновых кислот РНК-азой (по 1 единице активности) и ДНК-азой (по

67

Вестник УГСХА

№1(11) май - июнь 2010

Таблица 3

Характеристика молекулярной массы генома

№ Наименование проб Размер п.о.

1 Y/9 б034б

2 М-17 б09б7

3 En-13 4б0В3

4 En-2 бб043

б E-61 б02б2

б E-67 б0Вб7

7 K-10 б704б

В K-81 бВб72

9 C-52 б0000

10 C-61 б0б73

11 C-66 б03б7

12 M-20 4б190

13 П-16 4В430

14 П-2б1 бб4б1

1б П-143 4ВВВ0

б единиц активности), с целью определения типа нуклеиновой кислоты.

Смесь инкубировали в течение 10 мин при 37°С и результаты исследований учитывали в 1% агаровом геле.

результаты исследований и их обсуждение

Результаты электрофореза показали, что нам удалось выявить нуклеиновые кислоты у всех образцов. При обработке РНК-азой у всех образцов был положительный результат электрофореза, а при обработке ДНК-азой - отрицательный. Следовательно, все изучаемые нами фаги содержат нуклеиновую кислоту типа ДНК, т.е. выделенные и селекционированные нами бактериофаги энтеробактерий относятся к ДНК-содержащим вирусам.

Для определения молекулярной массы генома вносили в гель по 15 мкл каждой пробы и ДНК-маркер II. Компьютерная обработка результатов электрофореза показала, что все фаги имеют молекулярный вес размером от 4800 п.о. до 6500 п.о. (табл. 3).

При проведении электрофореза проводился рестрикционный анализ с эндонуклеазой Hind III в течение 2,5 часов. Результаты исследований показали, что используемая рестриктаза не разрезает

данные образцы.

Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют о возможности выделения нуклеиновых кислот бактериофагов энтеробактерий фенольно-дегратационным методом. Выделенные нуклеиновые кислоты у всех бактериофагов были представлены ДНК небольшим размером от 45083 до 67045 п.о.

заключение

Проведенные молекулярно-

генетические исследования выделенных нами бактериофагов свидетельствуют о том, что все изученные бактериофаги по типу нуклеиновой кислоты относятся к ДНК-содержащим вирусам. Молекулярная масса генома находиться в пределах от 45000 п.о. до 67000 п.о.

Литература:

1. Крылов В.Н. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий. // Генетика, том №5, 2003, с. 595-620.

2. Русалеев В.С. Таксономия вирусов бактерий// Ветеринария -1990 №3, с. 34-36.

3. Русалеев В.С. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий // Ветеринария.

6в