CC BY
72
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
УДК 579.843.1:579.253].083.1:614.777(470.61)
Захарова И.Б.1, Водяницкая С.Ю.2, Подшивалова М.В.1, Кругликов В.Д.2, Архангельская И.В.2, Викторов Д.В.1
молекулярно-генетическая характеристика штаммов vibrio
cholerae NON-O1/NON-O139, выделенных из БАллАСтныХ вод
судов и акватории портов ростовской области
1ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, 400131, г. Волгоград; 2ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, 344002, г. Ростов-на-Дону
В данной работе приведены результаты анализа присутствия в геномах штаммов Vibrio cholerae non-O1/non-O139, выделенных из судовых балластных вод и прибрежной зоны Таганрогского залива, нуклеотидных последовательностей интегронов класса 1 (In1) и интегративных конъюгативных элементов семейства SXT/R391. Интактный фрагмент З'-консервативного сегмента In1 (qacEdeltal-sul) детектирован в 3 штаммах (33, 59, 182), тогда как в штаммах V. cholerae 28 и 52 выявлены вероятные изменения последовательности-мишени (дупликация и делеция соответственно). Фрагмент гена интегразы intSXTSXT/R391 обнаружен в 7 из 10 исследованных штаммов. Группы штаммов № 27, 36, 38, 117 и № 59, 182 принадлежат к двум более часто встречаемым генотипам и идентичны в пределах групп по исследованным генетическим маркерам, тогда как остальные изоляты характеризуются уникальными генотипами, что указывает на их различные источники происхождения.
Ключевые слова: Vibrio cholerae non-O1/non-O139; балластные воды судов; интегроны класса 1; 8ХТЖ391-элемент.
Для цитирования: Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015; 20 (3): 47-50.
Zakharova I.B.1, Vodyanitskaya S.Yu. 2, Podshivalova M.V.1, Kruglikov V.D. 2, Arkhangelskaya I.V. 2, Viktorov D.V.1
MOLECULAR GENETIC CHARACTERIZATION OF VIBRIO CHOLERAE N0N-01/N0N-0139 STRAINS ISOLATED FROM SHIP
BALLAST AND PORT SURFACE WATER IN ROSTOV REGION
'Volgograd Anti-Plague Research Institute of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance, 7, Golubinskaya
Str., Volgograd, Russian Federation, 400131
2Rostov-on-Don Institute for Plague Control of Federal Agency for Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision, 117/40, M.
Gorkogo Str., Rostov-on-Don, Russian Federation, 344002
In the given paper there are presented the results of analysis for presence in genomes of Vibrio cholerae non-O1/non-O139 strains isolatedfrom ships' ballast water and the coastal zone of Taganrog Gulf class 1 integrons (In1) and SXT/R391 integrative conjugative elements . The intact sequence of In13'-conservative segment (qacEdelta1-sul) was detected in 3 strains (no. 33, 59, 182), whereas in strains V. cholerae no. 28 and 52 there were revealed the probable changes of target sequence (duplication and deletion, respectively). The fragment of SXT/R391 integrase IntSXT gene was detected in 7 of 10 strains tested. Group of strains no. 27, 36, 38, 117 and 59, 182 belong to 2 most common identified genotypes, while the rest isolates are characterized by unique genotypes that indicates to different source of their origins. Key words: Vibrio cholerae non-O1/non-O139, ships' ballast water, class 1 integron,
Citation: Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. 2015; 20(3): 47-50. (In Russ.)
В системе эпидемиологического надзора по холере одно из ведущих мест занимают исследования открытых водоемов. В процессе проведения мониторинга поверхностных водоемов и хозяйственно-бытовых стоков на наличие возбудителей холеры в водных объектах Ростовской области обнаруживаются Vibrio cholerae non-01/non-0139 серогрупп, а также имеют место случаи выделения штаммов от больных острыми кишечными инфекциями (ОКИ), вибриононосителей и лиц, контактировавших с ними.
Обнаружение штаммов обусловливает необходимость выяснения основных причин и условий, способствующих появлению и распространению вибрионов в поверхностных водоемах. Многочисленными исследованиями установлена связь между обнаружением вибрионов и сбросом в водоемы недостаточно очищенных хозяйственно-бытовых, производственных и ливневых сточных вод, а также загрязнениями, поступающими с прибрежных территорий населенных пунктов, не имеющих канализации. Определенное значение в распространении вибрионов принадлежит морскому транспорту, который заносит с балластными водами различные виды морских обитателей, в том числе вирусы и бактерии, патогенные для человека. Так, занос возбудителя холеры в
страны Южной Америки в 1991 г. эксперты ВОЗ полностью связывают с морскими судами.
Холерные вибрионы поп-01/поп-0139 сегодня являются предметом пристального внимания исследователей и практических эпидемиологов, учитывая то обстоятельство, что их штаммы являются по сути природными резервуарами генов, расширяющих патогенный и эпидемический потенциал и способных передаваться V. сЫ1егае О1 и О139 серогрупп. Так, штаммы V с^1егае поп-01/поп-0139 могут служить источником для вибрионов эпидемически значимых серогрупп новых, ранее не встречавшихся у них комбинаций генов устойчивости к антимикробным соединениям [1].
В Ростовской области в течение 2010-2014 гг. ФКУЗ "Ростовский-на-Дону противочумный институт" Роспо-требнадзора и Управление Роспотребнадзора по Ростовской области ведут исследования балластных вод судов, прибывающих в порты Ростовской области из-за рубежа, на наличие холерных вибрионов. За период 2010-2014 гг. исследовано 285 проб балластной воды, возбудители холеры обнаружены не были, однако в 76 (26,66 %) пробах были выделены штаммы V сЫ1егае поп-01/поп-0139.
В данной работе проведен сравнительный анализ ге-
нотипов штаммов V. сЫкгае поп-01/поп-0139, выделенных из судовых балластных вод и прибрежной зоны Таганрогского залива в 2013 г., по маркерам множественной антибиотикорезистентности, связанным с мобильными генетическими элементами холерного вибриона, с целью доказательства заносного характера обнаруживаемых в балластных водах судов штаммов V. сЫ1егае поп-01/поп-0139.
Материалы и методы
В исследование были взяты 10 штаммов V. с^1егае поп-01/шп-0139: 7 штаммов, изолированных из балластных вод морских судов, прибывших в порты Ростовской области, и 3 штамма, изолированных в рекреационной зоне Таганрога (табл. 1). Отбор проб проводился сотрудниками лаборатории санитарной охраны территории ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора предложенными ими способами в зависимости от конструкции судна: через специальные люки, смотровые крышки балластных емкостей, замерные отверстия балластных цистерн с помощью насоса [2].
Выделение и идентификация штаммов проведены сотрудниками лаборатории микробиологии холеры Ростовского-на-Дону противочумного института в соответствии с МУК 4.2.2218-07 [3]. Дифференциацию водных штаммов холерных вибрионов от V. с^1егае О1 и О139 проводили с использованием моноклональных антител в реакции слайд-агглютинации.
Исследование на генетические маркеры множественной антибиотикорезистентности проведены в Волгоградском противочумном институте. Для выделения геномных ДНК 200 мкл бактериальной суспензии в 0,15 М №С1, рН 7,2 плотностью 2 • 109 м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-НС1, 100 мМ КС1, 5 мМ Mga2, 0,2 мг на 1 мл желатина, 0,9% Nonidet Р-40, 0,9% твин-20, 150 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 650С 120 мин и прогревали при 960С 30 мин для инактивации фермента. Далее пробы центрифугировали (10 000 об/мин, 1 мин), 10 мкл супернатанта использовали при постановке ПЦР.
Наличие в геномах исследуемых штаммов нуклео-тидных последовательностей интегронов класса 1 (1п1) и интегративных конъюгативных элементов семейства
Таблица 2
Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе
Прай- Последовательность 5'-3' Мишень*
мер
qacEdl ATCGCAATAGTTGGCGAAGT Ген устойчивости к чет-
вертичным аммониевым соединениям qacEdeltal З'-консервативного сегмента интегронов In1 (accession no. Х15370, 211-230)
Ген устойчивости к суль-фонамидам sull З'-консервативного сегмента интегронов Inl (accession no. Х12869, 1360-1341)
Ген интегразы int SXT-элемента (accession no. AF099172, 129-144 и 915-931)
П р и м е ч а н и е. * - указаны позиции праймеров на последовательностях Inl и SXT, представленных в Genbank NCBI (www.ncbi.nlm.nih. gov).
SXT/R391 исследовали в ПЦР с использованием набора генспецифических праймеров, перечисленных в табл. 2. Амплификацию участка 3'-консервативного сегмента интегронов Inl (праймеры qacEd1-sul) и фрагмента гена интегразы intXT (праймеры SXT-F - SXT-B) проводили по программе: прогрев 95oC 5 мин, 40 циклов (94oC - 30 с, 57oC - 30 с, 72oC - 60 с), финальная элонгация 72oC 10 мин, температура отжига праймеров составляла 58 и 55oC соответственно. Продукты ПЦР анализировали в 1,5% агарозных гелях.
Результаты и обсуждение
Множественная устойчивость к антибиотикам у V. cholerae может формироваться в результате горизонтального генетического переноса, опосредованного трансмиссивными плазмидами, интегронами, а также трансмиссивными интегративными элементами (ICE). Интегроны, локализованные на хромосомах либо
sul GCAAGGCGGAAACCCGCC
SXT-F TTATCGTTTCGATGGC SXT-B GCTCTTCTTGTCCGTTC
Таблица 1
Исследуемые штаммы V cholerae non-O1/non-O139
Штамм Дата забора Место забора (судно, порт) Источник выделения
27 09.0 8.13 Волго-Балт 220, Таганрог
28 16.0 8.13 Волго-Балт 220, Таганрог
32 23.0 8.13 Сандра 2, Таганрог
Балластные во-
33 24.0 8.13 ВФ Танкер 4,Таганрог
ды судов
38 01.09.13 ВФ Танкер 4, Таганрог
36 01.09.13 Астон Трэвелер, Ростов
52 22.09.13 ВФ Танкер 8, Таганрог
59 20.05.13 Пляж "Тополь", Таганрог Азовское море
117 10.06.13 Акватория порта Таганрог Азовское море
182 01.07.13 Пляж "Маяковка", Азовское море
Таганрог
П р и м е ч а н и е. Штаммы № 27 и 28 выделены с одного и того же судна «Волго-Балт 220», штаммы № 33 и 38 - с одного и того же судна «ВФ Танкер 4».
Таблица 3
Характеристика штаммов V cholerae non-О1/non-О139 по генетическим маркерам множественной антибиотикорезистентности
Генетический маркер Генотип
Штамм qacEdelta1- qacEdelta1-sul intSXT
V cholerae sul рекомбиниро-
non-01/non-0139 ванный
27
28
32
33 36 38 52 59 117 182
+ A
+ B
- C
+ D
+ A
+ A
+ E
- F
+ A
- F
+
+
+
+
+
+
1 234 56789 10 М 1 2345678 9 10 11
Детекция последовательностей интегронов класса 1 (треки 1-10, левая часть рисунка) и ICE элемента семейства SXT/R391 (треки 1-11, правая часть рисунка) в штаммах V. cholerae non-o1/non-o139. Обозначения: 1 - 27, 2 - 28, 3 - 32, 4 - 33, 5 - 36, 6 - 38, 7 - 52, 8 - 59, 9 - 117, 10 - 182, 11 - V cholerae B-191, М - ДНК-леддер 100 bp (100-500 bp).
внехромосомных элементах способны включать в свой состав индивидуальные генные кассеты по механизму сайтспецифической рекомбинации. Структурно инте-гроны состоят из центрального вариабельного региона, несущего вставки генных кассет, и фланкирующих его 5'- и З'-консервативные сегменты. Общими элементами интегронов являются ген т(1, кодирующий интегразу семейства тирозиновых рекомбиназ, сайт рекомбинации аШ и промотор Рс, обеспечивающий транскрипцию внедренных генных кассет. В составе каждой из генных кассет присутствует сайт узнавания интеграз
attC (59 bp-элемент). Область кассетной вставки In1 может включать от одной до десяти кодирующих последовательностей генов устойчивости к антимикробным соединениям различных классов (бета-лактамы, аминогликозиды, хлорамфеникол, сульфонамиды, макролиды, фосфо-мицин, линкомицин, рифампицин, отдельные антисептики) [4].
ICE (SXT-элементы) - крупные (60-100 kbp) транспозоноподобные структуры, интегрированные в определенные хромосомные локусы возбудителя холеры, способные к вырезанию и конъюгативному переносу, однако не способные к автономной репликации. Наряду с генами транс-позаз и генами Тга+-фенотипа, в составе различных типов IcE обнаружены гены резистентности к триметоприму (dfr), стрептомицину (strA, strB), сульфаметоксазолу (sul2) и хлорамфениколу (floR) [5].
Результаты проведенного ПЦР-анализа приведены на рисунке. Полноразмерные специфические фрагменты последовательностей З'-консервативного сегмента интегронов класса 1 (гены qacEdeltal-sul, размер ам-пликона 800 bp) детектированы в 4 исследуемых штаммах (№ 28, 33, 59, 182), причем в штамме V cholerae 28 выявлен дополнительный ампликон размером порядка 700 bp, что может свидетельствовать о дупликации тар-
Таблица 4
Анализ транспортных связей судов, из балласта которых выделены штаммы V cholerae non-О1/non-О139
Номер штамма Дата отбора пробы Место отбора (наименование судна, флаг государства) Порт убытия Порт прибытия Объем балласта на борту, т Место смены балласта (координаты)
27 09.08.13 "Волго-Балт 220", Белиз Немрут, Турция Таганрог, РФ 1200 Эгейское море (38°52,2^-26048,9'Е; 40°00,4^-29°09,3'Е) Мраморное море (41013,2^-29007,9'Е), Черное море (44°55,9^-36012,6'Е), Азовское море (45056,т-36058,3'Е)
28 16.08.13 " Волго-Балт 220", Белиз Керчь, Украина Таганрог, РФ 2380 Черное море (44°26,8^-35040,9' Е), Азовское море (45°43,6^-36055,2'Е)
32 23.08.13 "Сандра 2", Сент-Китс и Невис Самсун, Турция Таганрог, РФ 800 Азовское море (45°27,3^-36045,5'Е; 45°59,7^-37003,8'Е)
33 24.08.13 "ВФ Танкер 4", Россия Керчь, Украина Таганрог, РФ 3500 Черное море (45°05,9^-36031,2'Е; 45°07,5^-36029,8'Е), Черное море (45П2,Ш-36029,9'Е; 45°25,6^-36043,6'Е), Азовское море (45°25,8^-36055,2'Е; 46°19,0^-37014,0'Е)
36 01.09.13 "Астон Трэвелер", Россия Бандырма, Турция Ростов, РФ 600 Мраморное море (40°58,2^-28054,8'Е; 41°18,0^-29016,0'Е), Черное море (44°50,4^-36029,5'Е; 45°38,7^-36052,6'Е), Нулевой км реки Дон
38 01.09.13 "ВФ Танкер 4", Россия Керчь, Украина Таганрог, РФ 3000 Черное море (45°06,0^-36031,4 Е; 45°28,3^-36046,8'Е), Азовское море (45°36,0^-36051,0'Е; 46°06,2^-37007,0'Е)
52 22.09.13 ВФ Танкер 8, Россия Керчь, Украина Таганрог, РФ 3000 Азовское море (46°01,0^-37004,8'Е)
гетной последовательности вследствие рекомбинацион-ных событий. Результат амплификации с праймерами qacEdeltal-sul ДНК штамма V cholerae 52, где детектируется фрагмент 300 bp (трек 7, левая часть), может быть следствием делеции во внутренней области 3'-консервативного сегмента.
Специфический фрагмент интегразы П размером 870 bp обнаружен в 7 из 10 исследованных штаммов вибрионов non-01/non-0139, что свидетельствует о наличии в их геномах ICE-элемента семейства SXT/R391 (см. рисунок, правая часть электрофореграммы). В качестве положительного контроля был использован штамм V. cholerae В-191 О139-серогруппы, несущий ICE элемент семейства SXT/R391, принадлежащий к варианту SXTM010 [6].
Данные о выявленных генотипах исследованных штаммов по анализируемым маркерам суммированы в табл. 3. Как следует из полученных результатов, группы штаммов № 27, 36, 38, 117 и № 59, 182 принадлежат к двум более часто встречаемым генотипам и идентичны в пределах групп по исследованным генетическим маркерам, тогда как остальные изоляты характеризуются уникальными генотипами.
Таким образом, судя по результатам проведенного анализа, единый (но независимый друг от друга) источник происхождения могут иметь группы штаммов № 27, 36, 38, 117 (балластные воды и акватория порта) и № 59, 182 (пляжи). Штаммы № 28, 32, 33, 52, выделенные из образцов балластных вод судов, характеризуются уникальными генотипами по анализируемым маркерам, что указывает на их различные источники происхождения и отличия от штаммов, выделенных на пляжах и в акватории порта.
Анализ транспортных связей судов (табл. 4) c выделенными штаммами, характеризующимися уникальными генотипами, показал, что холерные вибрионы могут быть поэтапно занесены в акватории портов Средиземного и Черного морей из других акваторий. Порты Средиземного и Черного морей могут быть "реципиентами" балласта судов, прибывших из стран, неблагополучных по холере, и "донорами" для судов, следующих в Азовское море. Подтверждением этому служит наличие различных генетических маркеров у штаммов № 27 и 28, выделенных с одного и того же судна "Волго-Балт 220" в разные сроки, и штаммов № 33 и 38, изолированных с одного и того же судна "ВФ Танкер 4" в августе и сентябре 2013 г.
Несмотря на проводимые балластные операции, наличие схожих по генотипу штаммов в водяном балласте судов и в акватории Азовского моря может свидетельствовать, что рекомендуемый Конвенцией способ смены балласта D-1 при переходе из одной акватории в другую на судах смешанного «река - море» плавания малоэффективен. По мнению Н.В. Сустретовой, даже при троекратной смене балласта в танках образуются застойные зоны и полной смены воды не происходит [7].
Таким образом, результаты проведенного генетического анализа штаммов V cholerae non-01/non-0139, изолированных в прибрежной зоне Таганрогского залива и выделенных из судовых балластных вод, подтверждают заносной характер последних, что свидетельствует о выявлении нового объекта эпидемиологического над-
зора при холере в Российской Федерации, мероприятия для которого предложены нами ранее [8].
ЛИТЕРАТУРА
1. Rodríguez-Blanco A., Lemos M., Osorio С. Integrating conju-gative elements as vectors of antibiotic, mercury, and quaternary ammonium compound resistance in marine aquaculture environments. Antimicrob. Agents Chemother. 2012; 56(5): 2619-26.
2. Водяницкая С.Ю., Лях О.В. Разработка способов отбора балластной воды на судах смешанного «река-море» плавания для исследования на холеру. Здоровье населения и среда обитания. 2014; 1: 37-40.
3. Методические указания «Лабораторная диагностика холеры (МУК 4.2.2218-07)». М.; 2007.
4. Mazel D. Integrons: agents of bacterial evolution. Nature Rev. Microbiol. 2006; 4: 608-20.
5. Wozniak R., Fouts D., Spagnoletti M., et al. Comparative ICE genomics: insights into the evolution of the SXT/R391 family of ICEs. PLoS Genet. 2009; 5 (12): e1000786. doi:10.1371/journal. pgen.1000786.
6. Подшивалова М.В., Кузютина Ю.А., Захарова И.Б., Лопа-стейская Я.А., Викторов Д.В. Характеристика антибиотико-резистентных штаммов Vibrio cholerae, несущих интегратив-ные конъюгативные элементы SXT типа. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014; 18 (3): 34-9.
7. Сустретова Н.В. Обеспечение экологической безопасности балластных вод на судах смешанного плавания «река-море»: Дисс. ... канд. техн. наук. Н. Новгород; 2011.
8. Водяницкая С.Ю., Лях О.В., Ломов Ю.М., Рыжков Ю.В., Иванова Н.Г., Иванова А.И. и др. Противоэпидемические (профилактические) мероприятия при выделении возбудителей холеры из судовых балластных вод. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014; 2 (75): 40-4.
Поступила 11.03.15
REFERENCES
1. Rodríguez-Blanco A., Lemos M., Osorio C. Integrating conjuga-tive elements as vectors of antibiotic, mercury, and quaternary ammonium compound resistance in marine aquaculture environments. Antimicrob. Agents Chemother. 2012; 56 (5): 2619-26.
2. Vodyanitskaya S.Yu., Lyakh O.V. Developing methods of ballast water sampling from the tanks of "River-Sea" type vessels aimed at the Vibrio cholerae analysis. Zdorov'e naseleniya i sreda obi-taniya. 2014; 1: 37-40. (in Russian)
3. Guidelines "Laboratory Diagnosis of Cholera (MUK 4.2.221807)". Moscow; 2007. (in Russian)
4. Mazel D. Integrons: agents of bacterial evolution. Nature Rev. Microbiol. 2006; 4: 608-20.
5. Wozniak R., Fouts D., Spagnoletti M. et al. Comparative ICE genomics: insights into the evolution of the SXT/R391 family of ICEs. PLoS Genet. 2009; 5 (12): e1000786. doi:10.1371/journal. pgen.1000786.
6. Podshivalova M.V., Kuzyutina Yu.A., Zakharova I.B., Lopastey-skaya Y.A., Viktorov D.V. Characterization of drug resistant Vibrio cholerae strains carrying the SXT- type integrative conjuga-tive elements. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. 2014; 18 (3): 34-9. (in Russian)
7. Sustretova N.V. Ensuring Ecological Safety of Ballast from the Tanks of ""River-Sea" Type Vessels: Diss. Nizhniy Novgorod; 2011. (in Russian)
8. Vodyanitskaya S.Yu., Lyakh O.V, Lomov Yu.M., Ryzhkov Yu.V, Ivanova N.G., IvanovaA.I. et al. Epidemiological (preventive) measures in the allocation of cholera from ships' ballast water. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2014; 2 (75): 40-4. (in Russian)
Received 11.03.15
