CC BY-ND
16
январь НИ (298) ЗНиСО
33
УДК 579.843.1:575.25.:612.017.4:002.5/6
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ICE ЭЛЕМЕНТОВ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ
У У. CHOLERAE
С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников, С.В. Титова
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора,
Ростов-на-Дону, Россия
С помощью виртуальной ПЦР in silico проведен анализ локальной базы данных 395 полногеномных нуклеотидных последовательностей Vibrio cholerae на наличие ICE элемента. Результат свидетельствовал о широком распространении ICE элемента у токсигенных и атоксигенных штаммов Vibrio cholerae серовара О1. При этом все ICE элементы успешно типировались: три основных типа - «индийский», «мозамбикский» или «SXT». При этом до 40 % атоксигенных штаммов О1 серовара и неО1/неО139 несли ICE элемент. При анализе с помощью ПЦР in vitro коллекции 222 штаммов Vibrio cholerae серовара О1 показано наличие ICE элемента и определены его типы у токсигенных штаммов, выделенных в последние годы на территории Российской Федерации. Все атоксигенные O1, О139 и неО1/неО139 штаммы, выделенные на территории РФ, лишены ICE элемента, что отличает их от штаммов, циркулирующих в эндемичных по холере регионах. Это наблюдение позволяет рассматривать наличие ICE элемента как новый эпидемический маркер «заносных штаммов» атоксигенных холерных вибрионов. Ключевые слова: Vibrio cholerae, ICE элемент, ПЦР.
S.O. Vodop'yanov, A.S. Vodop'yanov, I.P. Oleynikov, S.V. Titova □ PREVALENCE OF ICE ELEMENTS OF DIFFERENT TYPES IN V. CHOLERAE □ Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.
With the help of a virtual PCR in silico analysis of the local database 395 genome-nucleotide sequences of Vibrio cholerae in the presence of ICE element. The results showed widespread ICE member from toxigenic strains and nontoxigenic Vibrio cholerae O1 serotype. Thus all elements of ICE successfully typed three basic types - «Indian», «Mozambique», or «the SXT». In this case up to 40 % nontoxigenic strains O1 serovar and nonO1/nonO139 carried ICE element. When analyzed by PCR in vitro collection of222 strains of Vibrio cholerae O1 serotype shows the presence of ICE element and determine its type in toxigenic strains isolated in recent years in the Russian Federation. All nontoxigenic O1, O139 and nonO1/nonO139 strains isolated in Russia, deprived of ICE element that differs from strains circulating in endemic cholera areas. This observation allows us to consider the presence of ICE element as a new epidemic marker «of invasive strains of» nontoxigenic Vibrio cholerae. Key words: Vibrio cholerae, ICE element, PCR.
Integrative Conjugative Elements (ICEs) представляют собой мобильные генетические элементы размером от 79 до 108 kb, способные интегрироваться в состав хромосомы хозяина и передаваться путем конъюгации. Эти элементы содержат свыше 50 генов, включая гены, детерминирующие процесс конъюгации, интеграции, продукцию токсинов, устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам, ДНК-азы и др. ICE-подобные элементы обнаружены у многих видов бактерий, включая Photobacte-rium damselae, Shewanella putrefaciens и Providencia alcalifaciens [13]. Первый элемент этого типа был выявлен у штамма Providencia rettgeri, выделенного в 1967 году [7, 10]. Данные ретроспективного анализа, приведенные разными группами авторов, показали, что вибрионы ориентировочно приобрели ICE элемент путем горизонтального переноса от гетероло-гичных микроорганизмов в период 1978-1984 годов [7, 10, 13].
У холерного вибриона первый ICE был описан в 1992 году под названием SXT/R391 элемента. В последующем разные группы авторов у разных штаммов описали несколько типов ICE. В настоящее время по итогам секве-нирования предложено несколько классификаций ICE, выделяющих свыше десяти основных типов [10, 13].
В настоящее время подавляющее большинство вспышек холеры во всем мире вызвано токсигенными штаммами, содержащими ICE
элементы разных типов. Это способствовало началу изучения этой структуры и у нас в стране [3, 5]. Это делает целесообразным введение анализа на наличие ICE элемента в практику молекулярного мониторинга за холерой.
Цель исследования - с помощью компьютерного анализа локальной базы данных полногеномных сиквенсов V. cholerae О1 и неО1/не 0139 и ПЦР на коллекции штаммов различного происхождения оценить возможность использования детекции ICE элемента и его типиро-вания в практике эпиднадзора за холерой.
Материалы и методы. ПЦР in silico проводили согласно описанному алгоритму [1] с использованием локальной базы данных неполных геномов Vibrio cholerae (созданная локальная база данных последовательностей ДНК неполных геномов штаммов возбудителя холеры, находившихся в Genbank на момент проведения работы). Глубину секвенирования и репрезентативность данных анализировали с помощью авторской программы SegAnalyzer. Созданная локальная база данных содержала информацию о 395 структурах штаммов V. cho-lerae, выделенных в различных регионах мира, полностью отвечавших всем критериям полноты секвенирования. Для анализа in silico и постановки ПЦР in vitro использовали систему описанных в литературе праймеров (пара родовых для выявления ICE элемента) и трех пар видовых (для выявления «индийского», «мо-замбикского» и «SXT» типов) [12].
34
ЗНиСО mm им (290)
Коллекция изученных штаммов включала 222 культуры сероваров O1, О139 и неО1/неО139, выделенных в различные сроки в различных регионах РФ и мира. Культивирование штаммов, выделение ДНК, проведение ПЦР и учет результатов проводили так, как описано ранее [21. Синтез праймеров проводила НПФ «Евроген» (Москва).
Результаты исследования. Результаты виртуальной ПЦР in silico на наличие ICE элемента и его типов, проведенной на локальной базе из 395 полногеномных нуклеотидных последовательностей Vibrio cholerae сероваров О1 и не О1/не О139, представлены в табл. 1. Полученные данные свидетельствуют о широком распространении ICE элемента у токсиген-ных и атоксигенных штаммов Vibrio cholerae серовара О1. При этом все ICE элементы успешно типировались использованной системой праймеров на три основных типа - «индийский», «мозамбикский» и «SXT». Эти данные согласуются с мнением о существовании трех типов ICE элемента [9, 11] и позволят упростить молекулярное генотипирование при практическом использовании метода.
Отсутствие ICE элемента у части изученных токсигенных штаммов можно объяснить их ранним сроком выделения до наступления этапа приобретения ICE элемента [2, 5]. Интересно, что 40 % атоксигенных штаммов 01 серовара и штаммы не01/не0139 несли ICE элемент. Однако в случае штаммов неО1/неО139 ICE элемент не удалось протипировать как представителя одного из трех основных типов. Эти данные согласуются с результатами, полученными при изучении полногеномных сиквенсов «гаитянских штаммов», показавших существование у таких штаммов нового типа этой генетической структуры [6].
Результаты следующего этапа работы - анализ с помощью ПЦР коллекции штаммов, выделенных на территории РФ, для выявления и ти-пирования ICE элемента - приведены в табл. 2. Токсигенные штаммы, лишенные ICE элемента, были выделены в период эпидемических осложнений 1965-1974 годов, то есть до момента приобретения этой генетической структуры холерным вибрионом [9, 10]. Все токсигенные штаммы последующих сроков изоляции содержали ICE. При этом все выявленные нами ICE элементы, обнаруженные у О1 ctx+tcpA+ штаммов, были успешно идентифицированы до вида, что совпа-
ло с нашими данными типирования in silico и свидетельствует о достаточной разрешающей способности использованного нами метода типирования при анализе на три основных типа.
Все атоксигенные O1, О139 и неО1/неО139 штаммы, выделенные на территории РФ, лишены ICE элемента, что отличает их от штаммов, циркулирующих в эндемичных по холере регионах, где, по данным типирования in silico, 40 % штаммов содержит анализируемый фрагмент ДНК. Это наблюдение позволяет рассматривать наличие ICE элемента как новый эпидемический маркер «заносных штаммов» холерных вибрионов. Полученный результат совпадает с данными недавнего исследования, когда из 10 изученных неО1/не 0139 штаммов, выделенных из судовых балластных вод, у 7 культур был обнаружен специфический фрагмент инте-гразы, что прямо свидетельствовало о наличии ICE элемента. Это позволило авторам сделать вывод о заносной природе подобных штаммов [3].
Интересные результаты получены при анализе распределения типов ICE элемента у ток-сигеных штаммов, выделенных в РФ и сопредельной территории в последние десятилетия (табл. 3). Практически все крупные эпидемические вспышки были вызваны штаммами с одним типом ICE элемента. Единственное исключение - крупная вспышка в Дагестане 1994 года, когда была отмечена циркуляция токсиген-ных культур с двумя типами ICE элемента. Это может свидетельствовать о наличии двух независимых заносов инфекции, что согласуется с мнением о сложном характере эпидемического процесса в Дагестане в период 1994 года с многочисленными заносами инфекции [4]. Отмечена тенденция смены возбудителя: так, если ранние заносы 1993-1998 годов были обусловлены штаммами с ICE элементом «мозамбик-ского типа», то начиная с 2001 года в нашей стране выделяют только штаммы с ICE элементом «индийского типа». Эта тенденция может свидетельствовать о большем эпидемическом потенциале штаммов с ICE элементом «индийского типа». Косвенным подтверждением этого предположения может быть факт продолжающейся циркуляции токсигенных штаммов, лишенных ICE элемента, на эндемичной территории без их выноса на сопредельные регионы и серьезных эпидемических осложнений [8].
Таблица 1. Результаты ПЦР in silico на 395 полногеномных нуклеотидных последовательностях Vibrio cholerae О1 и неО1/не О139 на наличие ICE элемента и его типов
Свойства Всего структур ICE- ICE+ Тип ICE «индийский»/ « мозамбикский»/<^ХТ»
O1 всего 321 115 206 159/44/3
O1 ctx+ 286 94 192 149/42/1
O1 ctx- 35 21 14 10/2/2
неО1/неО139 всего 74 45 29
неО1/неО139 ctx+ 12 12 -
неО1/неО139 ctx- 62 33 29
Таблица 2. Результаты анализа коллекции штаммов Vibrio cholerae в ПЦР на определение наличия ICE и его типов
№ Генотип Число Наличие ICE элемента Тип
штаммов + - ICE элемента
1 O1 ctx+tcpA+ 104 89 15 «индийский» - 24; «мозамбикский» - 65
2 O1ctx-tcpA+ 27 0 27
3 O1ctx-tcpA- 77 0 77
4 О139 ctx-tcpA- 8 0 8
5 неО1/неО139 6 0 6
Всего 222 89 133
январь НИ (298) ЗНиСО
35
Таблица 3. Типы ICE элемента у О1 ctx+tcpA+ штаммов V. cholerae, выделенных в различных регионах
№ Регион, дата выделения Число штаммов Тип ICE элемента
1 Дагестан, 1993 10 «мозамбикский» - 10
2 Дагестан, 1994 45 «мозамбикский» - 43; «индийский» - 2
3 Крым, 1994 2 «мозамбикский» - 2
4 Дагестан, 1998 7 «мозамбикский» - 7
5 Казань, 2001 6 «индийский» - 6
6 Крым, 2010 3 «мозамбикский» - 3
7 Мариуполь, 2011 10 «индийский» - 10
8 Штаммы, выделенные в РФ в 2005-2014 6 «индийский» - 6
На основании проделанной работы можно сделать выводы, что ICE элемент является информативным генетическим маркером токси-генных штаммов V. cholerae, а для молекулярного типирования ICE элемента достаточно определения двух основных типов. Кроме того, отсутствие ICE элемента у атоксигенных штаммов V. cholerae, выделенных в Российской Федерации, позволит использовать выявление ICE элемента как признак, характерный для «заносных» штаммов.
ЛИТЕРАТУРА (п. 6—13 см. References)
1. Водопьянов А. С. Алгоритм компьютерного VNTR-типи-рования на основе неполных сиквенсов ДНК штаммов Vibrio cholerae, выделенных на Гаити в 2010 / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, И.П. Олейников, Б.Н. Ми-шанькин // Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 3 (240). С. 28-31.
2. Водопьянов А.С. и др. INDEL- и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, И.П. Олейников [и др.] // Здоровье населения и среда обитания 2015. № 5 (266). C. 41-44.
3. Захарова И. Б. и др. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Vibrio cholerae NON-O1/NON-O139, выделенных из балластных вод судов и акватории портов Ростовской области / И.Б. Захарова, С.Ю. Водяниц-кая, М.В. Подшивалова [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни 2015. № 3. C. 47-50.
4. Онищенко Г.Г. и др. Холера в Дагестане: прошлое и настоящее / Г.Г. Онищенко, Е.Н. Беляев, Э.А. Москви-тина [и др.]. Под общей редакцией заслуженного деятеля науки РФ, доктора медицинских наук профессора Г.М. Мединского. Ростов-на-Дону: изд-во «Полиграф», 1995. С. 33-77.
5. Подшивалова М.В. и др. Характеристика антибиотико-резистентных штаммов Vibrio cholerae, несущих интегра-тивные конъюгативные элементы SXT-типа / М.В. Подшивалова, Ю.А. Кузютина, И.Б. Захарова [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014. № 3. С. 34-39.
REFERENCES
1. Vodop'janov A.S., Vodop'janov S.O., Olejnikov I.P., Mis-han'kin B.N. Algoritm komp'juternogo VNTR-tipirovanija na osnove nepolnykh sikvensov DNK shtammov Vibrio cholerae, vydelennykh na Gaiti v 2010 [Computer VNTR-typing algorithm based on the partial sequence data of vibrio cholera strains from Haitian outbreak (2010)]. Zdorov'e naselenija i sreda obitanija, 2013, no. 3 (240), pp. 28-31 (in Russian).
2. Vodop'janov A.S., Vodop'janov S.O., Olejnikov I.P., Mis-han'kin B.N., Kruglikov V.D., Arhangel'skaja I.V., Zub-kova D.A., Ezhova M.I. INDEL- i VNTR-tipirovanie shtammov Vibrio cholerae, vydelennykh v 2013 godu iz objektov okruzhajushchej sredy na territorii Rossijskoj Federatsii [INDEL- и VNTR-typing Vibrio cholerae strains, isolated in 2013 from the environment objects in the Russian Federation]. Zdorov'e naselenija i sreda obitanija, 2015, no. 5 (266), pp. 41-44 (in Russian).
3. Zakharova I.B., Vodjanitskaja S.Ju., Podshivalova M.V., Kruglikov V.D., Arkhangel'skaja I.V., Viktorov D.V. Mo-
lekuljarno-geneticheskaja Charakteristika shtammov Vibrio sholerae NON-O1/NON-O139, vydelennykh iz ballastnykh vod sudov i akvatorii portov Rostovskoj oblasti [Molecular genetic characterization of Vibrio cholerae non-01/non-0139 strains isolated from ship ballast and port surface water in Rostov region]. Epidemiologija i infektsionnye bo-lezni, 2015, no. 3, pp. 47-50 (in Russian).
4. Onishchenko G.G., Beljaev E.N., Moskvitina E.A., Reza-jkin V.I., Lomov Ju.M., Medinskij G.M. Cholera v Dages-tane: proshloe i nastojashchee. [Cholera in Dagestan: Past and Present]. Under the general editorship of the honored worker of science of RF, doctor of medical sciences, Professor G.M. Medinskij. Rostov-on-Don: «Poligraf» Publ., 1995, pp. 33-77 (in Russian).
5. Podshivalova M.V., Kuzjutina Ju.A., Zakharova I.B., Lo-pastejskaja Ja.A., Viktorov D.V. Charakteristika antibiotic-korezistentnykh shtammov Vibrio cholerae, nesushchih in-tegrativnye konjugativnye elementy SXT-tipa [Characteristics of antibiotic resistant strains of Vibrio cholerae carrying SXT type integrative conjugative elements]. Epide-miologija i infektsionnye bolezni, 2014, no. 3, pp. 34-39 (in Russian).
6. Ceccarell D. et al. A new integrative conjugative element detected in Haitian isolates of Vibrio cholerae non-O1/non-O139 / D. Ceccarell, M. Spagnoletti, N.A. Hasan [et al.] // Res Microbiol. 2013. November. № 164 (9). pp. 891-893.
7. Daliaa A.B. et al. A globally distributed mobile genetic element inhibits natural transformation of Vibrio cholerae / A.B. Daliaa, K.D. Seed, S.B. Calderwoodd, A. Camilli // PNAS. August 18. 2015. Vol. 112. № 33. pp. 10485-10490.
8. Klinzing D. et al. Hybrid Vibrio cholerae El Tor Lacking SXT Identified as the Cause of a Cholera Outbreak in the Philippines / D. Klinzing, S.Y. Choi, N.A. Hasan [et al.] // mbio.asm.org March/April 2015. Vol. 6. Iss. 2. e00047-15.
9. Marin M.A. et al. Worldwide Occurrence of Integrative Conjugative Element Encoding Multidrug Resistance Determinants in Epidemic Vibrio cholerae O1 / M.A. Marin, E.L. Fonseca, B.N. Andrade [et al.] // PLOS ONE. URL: www.plosone.org September. 2014. Vol.9. Iss. 9. e108728.
10. Mutreja A. et al. Evidence for multiple waves of global transmission within the seventh cholera pandemic / A. Mu-treja, D.W. Kim, N. Thomson [et al.] // Nature. 2011. № 477 (7365). pp. 462-465.
11. Spagnoletti M. et al. Acquisition and Evolution of SXT-R391 Integrative Conjugative Elements in the Seventh-Pandemic Vibrio cholerae Lineage whole-genome sequence data / M. Spagnoletti, D. Ceccarelli, A. Rieux [et al.] // mbio.asm. org July/August 2014. Vol. 5. Iss. 4. e01356-14.
12. Spagnoletti M. et al. Rapid detection by multiplex PCR of Genomic Islands, prophages and Integrative Conjugative Elements in V. cholerae 7th pandemic variants / M. Spag-noletti, D. Ceccarelli, M.M. Colombo // J. Microbiological Methods. № 88 (2012). pp. 98-102.
13. Wozniak R.A.F. et al. Comparative ICE Genomics: Insights into the Evolution of the SXT/R391 Family of ICEs / R.A.F. Wozniak, D.E. Fouts, M. Spagnoletti [et al.] // PLoS Genetics URL: www.plosgenetics.org December 2009. Vol. 5. Iss. 12. e1000786.
Контактная информация:
Водопьянов Сергей Олегович, тел.: +7 (903) 402-11-63, e-mail: serge100v@gmail.com Contact information:
Vodop'yanov Sergey, phone: +7 (903) 402-11-63, e-mail: serge100v@gmail.com
