CC BY
13
problems of ViRoLoGY (RussiAN journal). 2019; 64(4)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192
ORIGINAL REsEARcH
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019
Карамендин К.О., Саятов М.Х., Кыдырманов А.И., Касымбеков Е.Т., Асанова С.Е., Даулбаева К.Д., Хан Е.Я.
молекулярно-генетическая характеристика штаммов avian
avulavirus 20, ВЫдЕЛЕннЫх от диких ПтИЦ
НПЦ микробиологии и вирусологии, Республика Казахстан, 050010, г. Алматы, ул. Богенбай батыра, 103
Введение. В 2013-2014 гг. на территории Казахстана от диких птиц были выделены ранее не описанные в науке штаммы парамиксовирусов, впоследствии идентифицированные как представители нового вида - Avian avulavirus 20. Цель и задачи исследований заключались в молекулярно-генетической характеристике изолятов новых авулавирусов и определении их филогенетических взаимоотношений.
Материал и методы. Биологическими образцами в виде клоакальных и трахеальных смывов от диких птиц заразили развивающиеся куриные эмбрионы с последующим выделением культуры вирусов. Полные нуклеотидные последовательности геномов вирусов получены методом массового параллельного секвенирования нуклеиновых кислот вирусов с биоинформационной обработкой результатов.
результаты. При первичном заражении куриных эмбрионов пробами от 179 диких птиц, относящихся к семействам утиные, чайковые, бекасовые и ржанковые, выделены 19 гемагглютинирующих агентов, из которых 5 впоследствии оказались представителями новых видов парамиксовирусов. Исследование секвенированных последовательностей их геномов выявило их идентичность по размерам, но значительную генетическую вариабельность внутри вида. Выявлены 2640 нуклеотидных замен, из них 273 оказались несинонимическими, т.е. оказывали влияние на белковую структуру вирусов. Показано, что изоляты Avian avulavirus 20/озёрная чайка/Балхаш/5844/2013 и Avian avulavirus 20/черноголовый хохотун/Атырау/5541/2013 оказались на 86 и 95% соответственно идентичны ранее описанному референсному штамму, что свидетельствует о значительной эволюционной дивергенции внутри вида. обсуждение. Авторы предполагают существование двух независимых линий - Каспийской, представленной ре-ференсным Актау/5976 и Атырау/5541, а также географически значительно отдалённой Балхашской линии. Заключение. Проведённые исследования подтверждают, что птицы семейства чайковые являются основным резервуаром Avian avulavirus 20 в орнитофауне, играют ключевую роль в поддержании авулавирусов в биосфере и представляют потенциальный источник возникновения новых вариантов. Непрерывное наблюдение за ними в дикой природе - одна из важнейших задач при обеспечении безопасности птицеводства.
Ключевые слова: парамиксовирус; секвенирование; Avian avulavirus 20; серотип; эволюция; дикая птица; Казахстан; чайка.
Для цитирования: Карамендин К.О., Саятов М.Х., Кыдырманов А.И., Касымбеков Е.Т., Асанова С.Е., Даулбаева К.Д., Хан Е.Я. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Avian avulavirus 20, выделенных от диких птиц. Вопросы вирусологии. 2019; 64(4):185-192. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192 Информация об авторах:
Карамендин К.О., https://orcid.org/0000-0003-0829-3330 Саятов М.Х., https://orcid.org/0000-0003-4740-9156 Кыдырманов А.И., https://orcid.org/0000-0002-8374-6128 Касымбеков Е.Т., https://orcid.org/0000-0002-8773-4984 Асанова С.Е., https://orcid.org/0000-0002-7259-5539 Даулбаева К.Д., https://orcid.org/0000-0001-5618-3385 Хан Е.Я., https://orcid.org/0000-0002-6279-3419
Для корреспонденции: Карамендин Кобей Омертаевич, канд. вет. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологии вирусов НПЦ микробиологии и вирусологии, Республика Казахстан, 050010, г. Алматы, ул. Богенбай батыра, 103. E-mail: kobey.karamendin@gmail.com
Karamendin K.O., Sayatov M.Kh., Kydyrmanov A.I., Kasymbekov E.T., Asanova S.E., Daulbayeva K.D., Khan E.Ya.
MOLECULAR-GENETIC CHARACTERIZATION OF AVIAN AVULAVIRUS 20 STRAINS ISOLATED FROM WILD BIRDS
SPC for Microbiology and Virology, Almaty, 050010, Kazakhstan
Introduction. Previously unknown paramyxovirus strains were isolated from wild birds in 2013-2014 in Kazakhstan and subsequently identified as representatives of the novel Avian avulavirus 20 species. The aims and tasks were molecular genetic characterization of novel avulaviruses and investigation of their phylogenetic relationships. Material and methods. Embryonated chicken eggs were inoculated with cloacal and tracheal swabs from wild birds with subsequent virus isolation. The complete nucleotide sequences of viral genomes were obtained by massive parallel sequencing with subsequent bioinformatics processing.
Results. By initial infection of chicken embryos with samples from 179 wild birds belonging to the Anatidae, Laridae, Scolopacidae and Charadriidae families, 19 hemagglutinating agents were isolated, and five of them were identified as representatives of new viral species. The study of their sequenced genomes revealed their similarity in size, but there was a significant genetic variability within the species. 2,640 nucleotide substitutions were identified and 273 of them were non-synonymous, influencing the protein structure of viruses. It was shown that isolates Avian avulavirus 20/black-headed gull/ Balkhash/5844/2013 and Avian avulavirus 20 /great black-headed gull/Atyrau/5541/2013 were 86% and 95% respectively identical to the previously described reference strain, indicating a significant evolutionary divergence within species.
вопросы вирусологии. 2019; 64(4)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192
оригинальные исследования
Discussion. The authors suggest the existence of two independent lineages - the Caspian, represented by the reference strain Aktau/5976 and Atyrau/5541, as well as the second, geographically significantly distant Balkhash lineage. Conclusion. The study confirms the role of the birds of the Laridae family as the main reservoir of Avian avulavirus 20 in the avifauna that plays a key role in maintaining viruses of the genus Avulavirus in the biosphere and is a potential natural source for the emergence of new viral variants. Continuous surveillance of them in the wild is one of the most important tasks in ensuring the safety of the poultry industry.
Keywords: paramixovirus; .sequencing; Avian avulavirus 20; serotype; evolution; wild bird; Kazakhstan; gull.
For citation: Karamendin K.O., Sayatov M.Kh., Kydyrmanov A.I., Kasymbekov E.T., Asanova S.E., Daulbayeva K.D., Khan E.Ya. Molecular-genetic characterization of Avian avulavirus 20 strains isolated from wild birds. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2019; 64(4): 185-192. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192
For correspondence: Kobey O. Karamendin, PhD, DVM, Leading researcher, Laboratory of Viral Ecology, SPC for Microbiology and Virology, SPC for Microbiology and Virology, Almaty, 050010, Kazakhstan. E-mail: kobey.karamendin@gmail.com Information about authors:
Karamendin K.O., https://orcid.org/0000-0003-0829-3330 Sayatov M.Kh., https://orcid.org/0000-0003-4740-9156 Kydyrmanov A.I., https://orcid.org/0000-0002-8374-6128 Kasymbekov E.T., https://orcid.org/0000-0002-8773-4984 Asanova S.E., https://orcid.org/0000-0002-7259-5539 Daulbayeva K.D., https://orcid.org/0000-0001-5618-3385 Khan E.Ya., https://orcid.org/0000-0002-6279-3419
Acknowledgments. This work was supported by grants from the Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan: AP05131549 «Research of the virome of migratory birds as a source of transcontinental transmission of the human and animal infectious diseases pathogens» and AP0513370 «Molecular evolution of novel for science paramyxoviruses circulating among wild birds in Kazakhstan». Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Received 07 September 2018 Accepted 31 October 2018
Введение
Парамиксовирусы птиц (ПМВ) - РНК-содержащие вирусы, относящиеся к роду Avulavirus в составе семейства Paramyxoviridae, способные вызывать заболевания с различными клиническими проявлениями у диких и домашних птиц. До недавнего времени они включали 9 антигенно отличающихся серотипов (ПМВ-1 - ПМВ-9) [1], которые в последнее годы дополнены 11 новыми серотипами ПМВ-10 - ПМВ-20.
ПМВ-1, известный как вирус болезни Ньюкасла (ВБН), является высокопатогенным агентом, вызывающим массовые заболевания и гибель среди поголовья птиц во всём мире. Другие серотипы вызывают респираторные и другие заболевания меньшей степени тяжести у различных представителей орнитофауны [2]. Экспериментальные исследования и практические наблюдения показывают, что ПМВ-2, -3, -6 и -7 способны вызывать заболевания с разной патогенностью у домашних птиц [3-5]. Так, штаммы ПМВ-6 связаны с заболеваниями органов дыхания лёгкой степени и со снижением яйценоскости у индеек [6]. ПМВ-3 и -5 (вирус КипШсМ) вызывали болезни лёгких с тяжёлыми проявлениями у диких птиц [7,8]. ПМВ-4, -8, -9 и -10 были выделены от уток, водоплавающих и других диких видов птиц, у которых отсутствовали какие-либо клинические признаки заболевания [9-11]. ПМВ-4 выделен в основном от диких птиц отряда пластинчатоклювых [12], домашних уток и гусей, предположительно заразившихся в результате непосредственного контакта с их дикими сородичами [13]. Экспериментальная инфекция кур ПМВ-4 и 6 показала умеренную дыхательную патоло-
гию и возможность передачи вируса от дикой птицы к домашней [14].
ПМВ-1 - ПМВ-9 были выделены и охарактеризованы в 1970-х годах. В результате совершенствования технологий секвенирования с 2001 г. было обнаружено 11 новых серотипов. Вирус, выделенный от хохлатого пингвина в 2007 г., антигенно и генетически отличался от всех известных к тому времени серотипов и стал представителем новой группы - ПМВ-10 [15]. Следующий новый изолят (ПМВ-11) был выделен во Франции от бекаса в 2010 г. [16]. ПМВ-12 был изолирован в Северной Италии в 2005 г. от утки свиязи [17]. Сразу 3 публикации, вышедшие примерно в одно время, описывают ПМВ-13, независимо выделенный в трёх отдельных регионах Евразии - в Японии, Казахстане и Украине [18-20]. В 2017 г. было объявлено о 6 новых серотипах ПМВ: от уток в Японии [21] и Корее [22], от кулика в Бразилии [23]. Ещё 3 новых серотипа были одновременно выделены от антарктических пингвинов [24]. С 2013 по 2014 г. в Казахстане выявлен новый для науки серотип ПМВ-20 [25], чьё генетическое разнообразие и экология ранее не были описаны и который охарактеризован как вирус - представитель чайковой линии. Приведённые данные показывают, что ПМВ птиц широко распространены в диких популяциях и высока вероятность появления новых генетически различных вариантов.
Следует отметить, что, согласно новой утверждённой классификации Международного комитета по таксономии вирусов, ПМВ птиц серотипов 1-20, получили новое видовое наименование «Avian avulavirus 1-20». Далее в тексте будем придерживаться новой классификации.
problems of ViRoLoGY (RussiAN journal). 2019; 64(4)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192
ORIGINAL REsEARcH
Целью настоящей работы было изучение молекулярно-генетических свойств изолятов нового вида Avian avu/avirus 20, выделенных в разные годы в удалённых друг от друга регионах Казахстана и провести их сравнительные филогенетические исследования. В предыдущей работе [25] показаны сравнительные характеристики изолята Avian avu/avirus 20 с существующими видами рода Avu/avirus по морфологии, патогенности, ростовым свойствам, а также их филогенетические взаимоотношения. Данная статья описывает молекулярную эволюцию внутри данного вида, содержит более детальное описание структуры генома вирусов, а также подтверждает роль чаек как основного резервуара в орнитофауне.
Материал и методы
Биологические материалы в виде клоакальных и трахеальных смывов получены от диких птиц, согласно требованиям Международного эпизоотического бюро [26]. Пробы до проведения исследований хранили в жидком азоте (-196 °С).
Изоляцию вирусов и восстановительные пассажи проводили путём инокуляции каждой пробы вируса в 9-10-дневные развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) и последующей инкубации их при температуре 36 °С в течение 48 ч по сертифицированным методикам, рекомендованным ВОЗ [27].
Вирусные РНК выделены с использованием набора QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.
Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией проводили с использованием праймеров к консервативному фрагменту L-гена, общему для всех ПМВ [28]. Реакцию проводили в термоциклере «Eppendorf Gradient» при следующих параметрах: обратная транскрипция при 48 °С 45 мин, начальная 2-минутная денатурация при 95 °С и амплификация в 30 циклов, включающая денатурацию (94 °С, 30 с), отжиг праймеров (55 °С, 30 с) и удлинение цепи (72 °С, 30 с) с последующей окончательной элонгацией при 72 °С, 10 мин.
Секвенирование продуктов ПЦР по Сенгеру проводили с использованием терминирующих дидеоксину-клеотидов на автоматическом 8-капиллярном секве-наторе «ABI 3500 DNA Analyzer» (Applied Biosystems, США).
Подготовку библиотек для массового параллельного секвенирования осуществляли с помощью набора NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, США) согласно прилагаемому протоколу. Фрагментацию РНК проводили до размеров около 400-450 п.о. с применением ферментативного метода, используя двухвалентные катионы в составе набора. Качество приготовленных библиотек проверяли на приборе «Bioanalyzer 2100» (Agilent Technologies, Германия). Секвенирование проводили с использованием комплекта MiSeq Reagent v.3 (Illumina, США) на секвена-торе нового поколения «MiSeq» (Illumina, США).
Биоинформационный анализ полученных в результате секвенирования последовательностей проведён с
использованием компьютерной программмы Geneious 11.0 (Biomatters, Новая Зеландия).
Выравнивание и филогенетический анализ секве-нированных генов с нуклеотидными последовательностями из GenBank проводили с помощью компьютерной программы MEGA 6.0 методом максимального правдоподобия на основании 500 выборок, модель GTR [29].
Результаты
Выделение и идентификация вирусов. Проведён вирусологический скрининг в РКЭ 204 биологических образцов в виде клоакальных и трахеальных смывов, собранных в 2013 г в Западном, Юго-Восточном и Центральном Казахстане от 165 диких птиц водного и околоводного комплексов, относящихся к семействам утиные (Anatidae), чайковые (Laridae), бекасо-вые (Scolopacidae) и ржанковые (Charadriidae) из отрядов гусеобразные (Anseriformes) и ржанкообразные (Charadriiformes). В мае 2014 г. были собраны материалы в виде свежих фекалий от 14 чаек в Западном Казахстане.
В результате первичного заражения пробами 10-дневных РКЭ выделены 19 гемагглютинирующих агентов. Идентификация их в ПЦР с праймерами к консервативному участку L-гена, общему для всех ПМВ, позволила отнести 17 гемагглютинирующих агентов к этому семейству.
Осуществлено секвенирование продуктов амплификации L-гена методом Сенгера. При проведении BLAST-анализа в GenBank установлена принадлежность одного из изолятов к Avian avulavirus 1, шести -к Avian avulavirus 8, четырех - к Avian avulavirus 13 и ещё одного - к Avian avulavirus 6. Пять оставшихся не-идентифицированными изолятов ПМВ 2013 и 2014 гг. выделения показали значительное генетическое расхождение по консервативному фрагменту L-гена с известными в науке видами рода Avulavirus. Это позволило предположить, что в Казахстане циркулируют новые, ранее неизвестные ПМВ.
С целью дальнейшей идентификации новых ПМВ осуществляли их массовое параллельное секвениро-вание на приборе «MiSeq» с последующим BLAST-анализом. В результате изоляты были идентифицированы и получили обозначение Avian avulavirus 20/черноголовый хохотун/Атырау/5541/2013 (№ MH844488 в GenBank) и Avian avulavirus 20/озёрная чайка/Балхаш/5844/2013 (№ MH844489 в GenBank). Ранее из этой группы были описаны штаммы Avian avulavirus 20/чайка/Актау/5976/2014 (№ MF033136 в GenBank), Avian avulavirus 20/чайка/Актау/5977/2014 и Avian avulavirus 20/чайка/Актау/5979/2014, при этом первый из них обозначен как референсный штамм для всего серотипа [25]. Таким образом, в трёх значительно удалённых друг от друга регионах Казахстана и в разное время выделены 5 штаммов - представителей нового вида Avian avulavirus 20.
Полногеномное секвенирования изолятов Avian avulavirus 20. В результате секвенировании на приборе Illumina «MiSeq» получены в общей сложности от 504 106
Вопросы Вирусологии. 2019; 64(4)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192
оригинальные исследования
до 881 691 прочтений с обоих концов библиотек, которые впоследствии выравнивались на группу контрольных последовательностей, включающих все известные ПМВ птиц с дальнейшим формированием консенсуса.
Были получены полные нуклеотидные последовательности всех 6 генов изолятов Avian avulavirus 20/черноголовый хохотун/Атырау/5541/2013 и Avian avulavirus 20/озёрная чайка/Балхаш /5844/2013. Установлен следующий порядок их очерёдности: 3'-NP-P/V/W-M-F-HN-L-5', которые кодируют 8 белков: NP
- 459 аминокислотных остатков (а.о.), P - 431 а.о.; V
- 263 а.о.; W - 165 а.о.; M - 376 а.о.; F - 537 а.о.; HN
- 574 а.о. и L - 2242 а.о., что соответствует размерам генов референсного вируса Avian avulavirus 20/чайка/ Актау/5976/2014.
Размеры геномов вновь полученных последовательностей вирусов Avian avulavirus 20 были сопоставимы с таковой описанного эталонного штамма и включали 15 954 нуклеотидных основания (н.о.), что согласуется с «правилом шести», характерным для большинства ПМВ птиц.
Последовательности геномов новых казахстанских изолятов Avian avulavirus 20/черноголовый хохотун/ Атырау/5541/2013 и Avian avulavirus 20/озёрная чай-ка/Балхаш/5844/2013 оказались на 95 и 86% соответственно идентичны референсному штамму. Выравнивание позволило обнаружить области со значительными нуклеотидными расхождениями, неравномерно распределёнными по всей протяжённости генома.
Как известно, геномная РНК ПМВ представляет собой единую нить, содержащую концевые участки: ли-дерный на З'-конце (как правило, 55 н.о.) и трейлер-ный на 5'-конце (50-776 н.о.). У исследуемого изо-лята Avian avulavirus 20 определена протяженность 3'-лидерного концевого участка как 55 н.о., что является характерной длиной для всего семейства. Выявлены 2 нуклеотидные замены T45C и G50A у изолята Балхаш/5844, а также уникальная замена C30T у изолята Атырау/5541. Длина 5'-трейлерного концевого участка составила 248 н.о. и здесь также обнаружены 87 нуклеотидных замен. Следует отметить высокую степень комплементарности концевых участков между собой в 20 начальных нуклеотидов с обоих 3'- и 5'-концов, что свидетельствует о возможном наличии промоутерных элементов в этих регионах.
В начале каждого гена присутствует консервативный участок, так называемый gene-start, функционирующий, как сигнал начала транскрипции. В конце нуклеотидной последовательности каждого гена имеется короткий полиуридиловый участок, так называемый gene-end, являющийся сигналом аденилирования и одновременно терминации синтеза мРНК. Установлена последовательность C5GCUGG стартового фрагмента гена, одинаковая для всех генов Avian avulavirus 20, и она оказалась сходной с таковой Avian avulavirus 15. При этом участок сигнала терми-нации оказался вариабельным для разных генов Avian avulavirus 20: AAUUCU6 для NP, F, HN и L-генов, AAUUAU6 для Р-гена, а также GAU8 для М-гена.
Гены ПМВ птиц отделены друг от друга межген-
ными участками. Количество нуклеотидов в них у разных ПМВ варьирует, только лишь у вирусов родов Respirovirus и Morbillivirus каждый межгенный учасок содержит одинаковое количество нуклеотидов (3). У Avian avulavirus 20 межгенные участки содержали от 8 (между NP и Р) до 26 (между М и F) нуклеотидов.
Сравнительный молекулярный анализ изолятов Avian avulavirus 20. Казахстанские изоляты Avian avu-lavirus 20 обнаружили значительную генетическую вариабельность между собой и содержали в общей сложности 2640 нуклеотидных замен, из которых 273 оказались несинонимическими, т.е. изменяющими аминокислотную структуру.
Ген нуклеопротеина (NP) Avian avulavirus 20 имеет в составе 1380 н.о. и кодирует 459 аминокислот. Выявлены аминокислотные замены в 13 позициях (см. таблицу). Все изоляты содержали аминокислотный фрагмент 324-FAPANYSTLYSYAMG-338, который соответствует консервативной последовательности F-X4-YX3^-S^-A-M-G (где X - любая аминокислота, а Ф - ароматическая аминокислота), обнаруживается у всех представителей семейства Paramyxoviri-dae и считается ответственным за N-N самосборку во время РНК-связывания [30].
Ген фосфопротеина (P) длиной 1296 н.о. кодирует одноименный белок, состоящий из 431 аминокислоты. Казахстанский изолят Балхаш/5844 отличался от референсного штамма по 83 аминокислотным заменам, изолят Атырау/5541 имел отличие в 17 аминокислотных замен. По белковому составу фосфопроте-ина наблюдали наименьший процент сходства в 96% между исследуемыми и референсным штаммами, что позволило считать кодирующий его ген наиболее вариабельным среди остальных.
Известно, что у большинства вирусов семейства Paramyxoviridae ген Р содержит информацию для синтеза нескольких белков, что достигается за счёт наличия в мРНК дополнительных рамок считывания или с помощью вставки дополнительных G-нуклеотидов при транскрипции.
Ген P исследуемых изолятов Avian avulavirus 20 в позициях 2175-2183 содержал сайт AAAAGGGGG для вставки дополнительных нуклеотидов G. Выявлено, что мРНК без вставок у данного вида кодирует белок Р длиной 431 аминокислоты, а мРНК с вставкой одного остатка G кодирует белок V длиной 263 аминокислоты, вставка двух остатков G кодирует белок W длиной 165 аминокислот и у обоих С-концевая часть (начиная от места вставки) иная, чем у белка Р.
Матриксный ген (М) казахстанских изолятов Avian avulavirus 20 имеет длину 1131 н.о. и кодирует одноименный белок в 376 аминокислот. По этому гену выявлены аминокислотные замены в 17 позициях. Наряду с NP он оказался наиболее консервативным с наименьшим количеством замен.
Ген белка слияния (F) имеет длину 1614 н.о. и кодирует одноименный белок в 537 аминокислот. Сайт расщепления белка имеет аминокислотную последовательность GEQQARjLIG, где отсутствуют основные аминокислоты, что характерно для непатогенных вариантов. По
problems of virology (RussiAN jouRNAL). 2019; 64(4)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192
ORIGINAL REsEARcH
этому гену выявлены аминокислотные замены в 40 позициях. Также данный белок характеризуется наличием сайтов гликозилирования, которые потенциально могут влиять на формирование вирусных частиц, связывание вируса с клеткой и патогенез. У изолята Атырау/5541 и референсного штамма Актау/5976 зарегистрированы 6 таких сайтов в позициях 61, 74, 432, 456, 467 и 483. На один сайт меньше у изолята Балхаш/5844 из-за аминокислотной замены H467N.
Ген гемагглютинин-нейраминидазы (HN) имеет длину 1725 н.о. и кодирует одноименный белок в 574 аминокислот. Он содержит 6 консервативных аминокислот 234-N-R-K-S-C-S-239, ответственных за прикрепление к сиаловой кислоте на поверхности клетки [31]. По этому гену выявлены аминокислотные замены в 37 позициях.
Самый большой по размеру вирусный ген L, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу, имеет длину 6729 н.о. и кодирует одноименный белок в 2242 аминокислоты. По этому гену выявлены аминокислотные замены в 83 позициях. Он содержит 5 консервативных аминокислот 775-QGDNQ-779 в домене III, как и у многих минус-нитевых несегментированных РНК-вирусов, и считается принимающим участие в транскрипционной активности [32].
Филогенетический анализ новых казахстанских штаммов Avian avulavirus 20. С использованием компьютерной программы Mega 6.0 проведён филогенетический анализ генов новых изолятов между собой и в сравнении с другими из международной базы данных GenBank. Результаты представлены на рисунке.
Как видно из рисунка, казахстанские изоляты Avian avulavirus 20 вместе с другими видами Avian avulavirus 2, 8, 10 и 15 образовали отельную монофилетическую группу. Внутри данной группы казахстанские ПМВ сформировали отдельный кластер, что свидетельствует об их значительной филогенетической отдалённости от других видов и ином эволюционном происхождении. Также видно, что изоляты из Северного Каспия: референсный штамм Avian avulavirus 20/чайка/ Актау/5976/2014 и изолят Avian avulavirus 20/черно-головый хохотун/Атырау/5541/2013 - сформировали отдельную ветвь от изолята Avian avulavirus 20/озёр-ная чайка/Балхаш/5844/2013, выделенного в другом географически удалённом регионе Юго-Восточного Казахстана, что также подтверждает данные об их значительной генетической вариабельности.
Обсуждение
Казахстан обладает огромной территорией, пересекаемой трансконтинентальными путями миграций птиц, которые концентрируются в естественных ландшафтах во время пролёта и гнездования [33].
Дикие птицы, преимущественно водоплавающие, известны как основные резервуары Avian avulavirus 4, 6, 8 и 9 в природе [34, 35]. Несмотря на обширные исследования, проведенные с Avian avulavirus 1 по всему миру, сведений о молекулярно-биологических свойствах и патогенности остальных видов рода Avu-lavirus недостаточно.
В Казахстане относительно широко изучены эволюционные взаимоотношения различных штаммов Avian avulavirus 1, выделенных в разные годы [36-39]. Авторами показано, что на территории республики среди домашних птиц одновременно циркулировали вирусы нескольких генотипов. О других видах в республике имелись лишь единичные сообщения, опубликованные в конце 1980-х годов, и они касаются только Avian avulavirus 2 [40]. С развитием технологий массового параллельного секвенирования 5 видов рода Avulavirus 4, 6, 8 и новые виды Avian avulavirus 13 [18-20] и 20 [25] были выделены от диких птиц в последнее время в Казахстане.
В статье представлены результаты молекулярно-генетических и филогенетических исследований изо-лятов нового вида Avian avulavirus 20, выделенных в разные годы в удалённых друг от друга регионах Казахстана. Анализ полученной полной нуклеотидной последовательности вирусов позволил обнаружить в её составе 6 открытых рамок считывания, которые кодируют 8 вирусных белков. Сопоставление между собой РНК штаммов Avian avulavirus 20 показало их идентичность между собой по размерам, но выявлена значительная генетическая вариабельность внутри серотипа. В общей сложности выявлены 2640 нуклео-тидных замен, из которых 273 оказались несинонимическими. Все нуклеотидные расхождения оказались распределёнными неравномерно по всей протяжённости генома. Наиболее консервативными на каждые 100 нуклеотидов генома оказались гены внутренних белков M, NP и L, что характерно для большинства известных вирусов.
Интересно, что наиболее генетически вариабельным на каждые 100 нуклеотидов оказался Р-ген, где выявлены 83 несинонимичные нуклеотидные замены. Подобную картину авторы данной статьи наблюдали при исследовании штамма Avian avu-lavirus 16 (неопубликованные данные), похожий феномен выявлен при описании ВБН генотипа VI [41], где было высказано предположение, что существенная вариабельность в области Р-гена может объясняться участием продуцируемого им белка в процессе приспособления вируса к новым хозяевам за счёт эффективного преодоления внутренней защиты в виде выработки интерферона и апоптоза. В 2 раза меньшее количество несинонимических замен в генах F и HN, представляющих собой поверхностные гликопротеины оболочки вируса и являющиеся главной мишенью иммунного ответа хозяина, авторы объясняют как косвенное свидетельство незначительного влияния антигенного дрейфа в эволюции ПМВ.
Полногеномные последовательности новых казахстанских изолятов Avian avulavirus 20/озёрная чайка/ Балхаш/5844/2013 и Avian avulavirus 20/черноголовый хохотун/Атырау/5541/2013 оказались на 86 и 95% соответственно идентичны референсному штамму, что свидетельствует о значительной эволюционной дивергенции внутри серотипа. В данном случае можно говорить о существовании двух независимых линий -
Ю
о
Аминокислотные замены в вирусных белках штаммов Аушп ауи1а\чгш 20
Вирусный белок
ОТ
Замена в позиции £ 4- Ю оо чо к» 4^ ОО 4^ -й-оо оо оо чо -!— ЬО 4^ 4^ 4^ -!— оо оо 4^ оч ЧО ач о ач [о оч ач оч о> оо оч чс к» ос оо о оо оо оо оч оо чо к) чо оч чо оо о о о о К) о чо оо ач ю о ю 4— о оо ^ (-Л чо £ к> 'М оч чо 4— (-Л Оч <5 оо чо оо о оо к»
Актау/5976 в 8 N V ь р 8 А Е ь т к в 8 К т С А о Р 8 К в О в Р р т N N Е Е Е ь т I т А Т Т С Т в I М в в V I в N I Я I т н в Н I р Р А
Атырау/5541 в а в V ь р 8 А В С) т к в 8 к т С V о I в К 8 V 8 Р р I N N Е К N ь т Ь А А Т А С Т о I м 8 8 V I N N I Я I т С 8 н I р ь Т
Балхаш/5844 N в N А 8 т Ь Т Е м V я А А к А н V Е А Р С ь о N в т I I К Б Е Б т N ь I в А Т Н 8 8 V I N V Б V N 8 Т к р I н Ь 0 м 8 ь в
М
Замена в позиции
1—1 1—' инннюыюы
оооо чочочочооооо
ОО -й- ьос^^ачооюоочо
ы ьо ю ю
О У а\ М
Ы Ю Ы ЬО Ю Ы (ОЮЮЮЫЫЫЫ'^^ЫЫ^^., « и) Ы ^
оо о-^сл^оо омю^моою^л^о^оомю^^0
' СЛ ЧО и) ЬО
ш ш ш и ш ш I—'1 ОО О О ОН
Ю ОО -о чо
Актау/5976 Р V в С 8 V N н ь ь о Е в К А А V А ь в А I V Н к 8 Р 8 I Р в 8 М V А Т К т р т I я я я с к I I ь о в м Б 8 Ь т V А Б в I 8
Атырау/5541 Р А 8 с в V N н I, ь о Е N Н А А V V ь я А I V Н к в Р 8 Ь Р в в М V А N я т с в V я к я с к I I р о в т Б Б Р I А V Б в М в
Балхаш'5844 в А N р О I. в I, р р Б О в н 0 V А V р I, V т А Я я А т N I, 8 N Т V I 8 Т к м 0 т I к к к 8 я I. V р V 0 А I А Ь к А I I, Р I N
™
Замена
В ПОЗИЦИИ
ООЧО ^ММ^МЮЫЮ
ю к) ^ ы и) оо
-Й- 4^ ОП 1-Л О.
ьо оо «.л о чо
ЧО -О I—1 4^- О
ш
Замена
в ПОЗИЦИИ
^«(^оонюю^оом^оооооам^^^очиоиомоочч! оо
Актау/5976 А I N в Т в I 8 8 Е Ь я с я т N М I Б V м р т У V в 0 Р т Б I Я V н м н к т I к Б в О V К 0 N N т N I I т V I I в т I, I I V
Атырау/5541 А V N 8 т в I в 8 Е Ь я С я т 8 М I Б I I р А У V в 0 Р т У I я I н м н к т т я Б 8 С V я н N N т N I I т V I I N т I. V I м
Балхаш/5844 V V Б Р А N V Т Р О м к я к 8 N I м О V м т Е о I А N 0 А Б V к V 0 А я я V I к Е О в I к я 8 Н А А Т м А I м V в А 8 V т м
Замена в позиции
•-г; 1—' 1—1 1—11—11—1 1—1 |—1 |—1 I—1 |—1 |—1 ю ьо ьо ьо ю (о
<1<1^^1-<1-<|ООООЧС>ЧОЧО'040000 I—1 I—11 I—11
' и «О О Ю ОО Л
ОО I—1
ю ю ю
ю ю ю ю ьо ы О К> ОО
Акгау/5976 4 Е Р I К Н К в Т Р Ь В К К Т в Ь Я Т Н I I I А 8
Атырау/5541 АЕРТК(2ЯОТУЬКЯКТ8ЕЯТНУМ1 А I Балхаш/5844 SDSIRHKSIYIRKR.AALK.KQ I I М 8 8
Актау/5976 N а А I А Е V т I А в I н т ь к N т I I V N Б V I ь I I А N V А I Б I V С V в I я я к т в 8 N Б N Я Я в Б К я т в Е У 8 V I 00 чл
Атырау/5541 N 0 А Б А Е V в V 8 в I я т V к N т А V V N Б V I I I I 8 N V V I Б I V к м в I я я к V в т н Б N Я К р N Я к N в Е У 8 I I ЧО го
Балхаш/5844 8 Е Т I Т В I т V -8 Ь V я I V я К А I V I Н Е М V V I. А Т I I т Е М 1 С V N н я н я I ь в н N Б К о в N К к в I В н А I V
О оо
О О
— 3
ЕГ "О
§ я
г
со
9. ^ о ^ п О ь о
сп ^
ш ^ ш 2
ю
с*
problems of virology (Russian journal). 2019; 64(4)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192
ORIGINAL RESEARCH
Филогенетические взаимоотношения новых казахстанских Avian avulavirus 20 между собой и в сравнении с другими серотипами из
международной базы данных GenBank.
Каспийской, представленной референсным штаммом Актау/5976 и изолятом Атырау/5541, а также Балхашской линии, географически значительно отдалённой от первой.
Филогенетитческие исследования подтверждают разделение на 2 отдельные линии: на дендрограмме видно, что изоляты из Северного Каспия референс-ный штамм Avian avulavirus 20/чайка/Актау/5976/2014 и изолят Avian avulavirus 20/черноголовый хохотун/ Атырау/5541/2013 - сформировали отдельную ветвь от изолята Avian avulavirus 20/озёрная чайка/ Балхаш/5844/2013, выделенного в Юго-Восточном Казахстане.
Данное исследование также подтверждает приоритетную роль чайковых как основного носителя Avian avulavirus 20 в природе, так как вирусы этого вида выделены исключительно от птиц этого семейства в разные годы и в удалённых друг от друга регионах.
Дикая фауна играет ключевую роль в поддержании вирусов рода Avulavirus в биосфере и является потенциальным природным источником возникновения новых вариантов. Экспериментальные исследования на примере ВБН показали, что дикие птицы способны распространять и заносить слабо- или непатогенные варианты в популяцию домашних птиц, которые через несколько пассажей in vivo зачастую приобретают высокопатогенные свойства [42]. По этой причине непрерывное наблюдение за вирусами рода Avulavirus в дикой природе является одной
из важнейших задач при обеспечении безопасности птицеводства.
Кроме этого, имеются скудные сведения о молекулярной биологии вирусов рода Avulavirus в популяциях диких птиц, и исследования в этом направлении имеют определённый эпидемиологический интерес, что важно для разработки вакцин в случае появления новых патогенных штаммов.
Финансирование. Данная работа профинансирована грантами Министерства образования и науки Республики Казахстан АР05131549 «Изучение вирома перелетных птиц как источников трансконтинентального переноса возбудителей инфекционных болезней человека и животных» и АР05133370 «Молекулярная эволюция новых для науки парамиксовирусов, циркулирующих среди диких птиц в Казахстане».
Конфликт интересов. Все авторы статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1-32, 34-37, 39-42 см. REFERENCES)
33. Полный список видов птиц Казахстана. Available at: http://www.birds.
kz/v2checklist.php?l=ru 38. Коротецкий И.С., Богоявленский А.П., Прилипов А.Г., Усачев Е.В., Усачева О.В., Турмагамбетова А.С. и др. Молекулярно-генетическая характеристика велогенных изолятов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории Российской Федерации, Украины, Казахстана и Киргизии. Вопросы вирусологии. 2010; 55(4): 25-9.
Вопросы Вирусологии. 2019; 64(4)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-185-192 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
REFERENCES
1. Alexander D.J. Newcastle disease, other avian paramyxoviruses, and pneumovirus infections. In: Diseases of Poultry. Ames, IA, USA: Iowa State Press; 2003.
2. Saif Y.M., Mohan R., Ward L., Senne D.A., Panigrahy B., Dearth R.N. Natural and experimental infection of turkeys with avian paramyxovi-rus-7. Avian Dis. 1997; 41(2): 326-9.
3. Alexander D.J. Newcastle disease and other avian paramyxoviridae infections. In: Diseases of Poultry. Ames, IA, USA: Iowa State Press; 1997.
4. Jung A., Grund C., Muller I., Rautenschlein S. Avian paramyxovirus serotype 3 infection in Neopsephotus, Cyanoramphus, and Neophe-ma species. J. Avian Med. Surg. 2009; 23(3): 205-8. Doi: https://doi. org/10.1647/2008-022.1
5. Nerome K., Nakayama M., Ishida M., Fukumi H. Isolation of a new avian paramyxovirus from budgerigar (Melopsittacus undulatus). J. Gen. Virol. 1978; 38(2): 293-301. Doi: https://doi.org/10.1099/0022-1317-38-2-293
6. Gough R.E., Alexander D.J. Avian paramyxovirus type 4 isolated from a ringed teal (Calonetta leucophrys). Vet. Rec. 1984; 115(25-26): 653. Doi: https://doi.org/10.1136/vr.115.25-26.653
7. Stallknecht D.E., Senne D.A., Zwank P.J., Shane S.M., Kearney M.T. Avian paramyxoviruses from migrating and resident ducks in coastal Louisiana. J. Wildl. Dis. 1991; 27(1): 123-8. Doi: https://doi. org/10.7589/0090-3558-27.1.123
8. Alexander D.J., Hinshaw V.S., Collins M.S., Yamane N. Characterization of viruses which represent further distinct serotypes (PMV-8 and PMV-9) of avian paramyxoviruses. Arch. Virol. 1983; 78(1-2): 29-36. Doi: https://doi.org/10.1007/bf01310856
9. Stanislawek W.L., Wilks C.R., Meers J., Horner G.W., Alexander D.J., Manvell R.J., et al. Avian paramyxoviruses and influenza viruses isolated from mallard ducks (Anas platyrhynchos) in New Zealand. Arch. Virol. 2002; 147(7): 1287-302. Doi: https://doi.org/10.1007/s00705-002-0818-2
10. Turek R., Gresikova M., Tumova B. Isolation of influenza A virus and paramyxoviruses from sentinel domestic ducks. Acta Virol. 1984; 28(2): 156-8.
11. Chang P.C., Hsieh M.L., Shien J.H., Graham D.A., Lee M.S., Shieh H.K. Complete nucleotide sequence of avian paramyxovirus type 6 isolated from ducks. J. Gen. Virol. 2001; 82(Pt. 9): 2157-68. Doi: https:// doi.org/10.1099/0022-1317-82-9-2157
12. Miller P. J., Afonso C.L., Spackman E., Scott M.A., Pedersen J.C., Senne D.A., et al. Evidence for a new avian paramyxovirus serotype 10 detected in rockhopper penguins from the Falkland Islands. J. Virol. 2010; 84(21): 11496-504. Doi: https://doi.org/10.1128/JVI.00822-10
13. Briand F.X., Henry A., Massin P., Jestin V. Complete genome sequence of a novel avian paramyxovirus. J. Virol. 2012; 86(14): 7710. Doi: https://doi.org/10.1128/JVI.00946-12
14. Terregino C., Aldous E.W., Heidari A., Fuller C.M., De Nardi R., Manvell R.J., et al. Antigenic and genetic analyses of isolate APMV/wigeon/ Italy/3920-1/2005 indicate that it represents a new avian paramyxovirus (APMV-12). Arch. Virol. 2013; 158(11): 2233-43. Doi: https://doi. org/10.1007/s00705-013-1735-2
15. Yamamoto E., Ito H., Tomioka Y., Ito T. Characterization of novel avian paramyxovirus strain APMV/Shimane67 isolated from migratory wild geese in Japan. J. Vet. Med. Sci. 2015; 77(9): 1079-85. Doi: https://doi. org/10.1292/jvms.14-0529
16. Karamendin K., Kydyrmanov A., Seidalina A., Asanova S., Sayatov M., Kasymbekov E., et al. Complete genome sequence of novel avian paramyxovirus (APMV-13) isolated from a wild bird in Kazakhstan. Genome Announc. 2016; 4(3): pii e00167-16. Doi: https://doi.org/10.1128/ genomeA.00167-16
17. Goraichuk I., Sharma P., Stegniy B., Muzyka D., Pantin-Jackwood M.J., Gerilovych A., et al. Complete genome sequence of an avian paramyxo-virus representative of putative new serotype 13. Genome Announc. 2016; 4(4): pii e00729-16. Doi: https://doi.org/10.1128/genomeA.00729-16
18. Thampaisarn R., Bui V.N., Trinh D.Q., Nagai M., Mizutani T., Omatsu T., et al. Characterization of avian paramyxovirus serotype 14 a novel serotype isolated from a duck fecal sample in Japan. Virus Res. 2017; 228: 46-57. Doi: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2016.11.018
19. Lee H.J., Kim J.Y., Lee Y.J., Lee E.K., Song B.M., Lee H.S., et al. Novel Avian Paramyxovirus (Putative Serotype 15) Isolated from Wild Birds. Front. Microbiol. 2017; 8: 786. Doi: https://doi.org/10.3389/ fmicb.2017.00786
20. Thomazelli L.M., de Araujo J., Fabrizio T., Walker D., Reischak D., Ometto T., et al.
21. Novel avian paramyxovirus (APMV-15) isolated from a migratory bird in South America. PLoS One. 2017; 12(5): e0177214. Doi: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0177214
22. Neira V., Tapia R., Verdugo C., Barriga G., Mor S., Ng T.F.R, et al. Novel Avulaviruses in Penguins Antarctica. Emerg. Infect. Dis. 2017; 23(7): 1212-4. Doi: https://doi.org/10.3201/eid2307.170054
23. Karamendin K., Kydyrmanov A., Kasymbekov Y., Asanova S., Daulbayeva K., Seidalina A., et al. Novel avian paramyxovirus isolated from gulls in Caspian seashore in Kazakhstan. PLoS One. 2017; 12(12): e0190339. Doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0190339
24. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. Avian influenza. Available at: https://www.oie.int/en/standard-setting/ terrestrial-manual/access-online/
25. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. Available at: http://www.wpro.who.int/emerging_diseases/documents/ docs/manualonanimalaidiagnosisandsurveillance.pdf
26. Tong S., Chern S.W., Li Y., Pallansch M., Anderson L.J. Sensitive and Broadly Reactive Reverse Transcription-PCR Assays to Detect Novel Paramyxoviruses. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(8): 2652-8. Doi: https:// doi.org/10.1128/JCM.00192-08
27. Nei M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press; 2000.
28. Morgan E.M. Evolutionary relationships of paramyxovirus nucleo-capsid-associated proteins. In: Kingsbury D.W., ed. The Paramyxovi-ruses. New York: Plenum Press; 1991: 163-79.
29. Paldurai A., Subbiah M., Kumar S., Collins P.L., Samal S.K. Complete genome sequences of avian paramyxovirus type 8strains goose/ Delaware/1053/76 and pintail/Wakuya/20/78. Virus Res. 2009; 142(1-2): 144-53. Doi: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2009.02.003
30. Xiao S., Subbiah M., Kumar S., De Nardi R., Terregino C., Collins P.L., et al. Complete genome sequences of avian paramyxovirus serotype 6 prototype strain Hong Kong and a recent novel strain from Italy: evidence for the existence of subgroups within the serotype. Virus Res. 2010; 150(1-2): 61-72. Doi: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2010.02.015
31. The Checklist of the Birds of Kazakhstan. Available at: http://www. birds.kz/v2checklist.php?l=en
32. Karamendin K., Kydyrmanov A., Seidalina A., Asanova S., Daulbayeva K., Kasymbekov E., et al. Circulation of avian paramyxoviruses in wild birds of Kazakhstan in 2002-2013. Virol. J. 2016; 13: 23. Doi: https:// doi.org/10.1186/s12985-016-0476-8
33. Yamane N., Arikawa J., Odagira T., Ishida N. Characterization of avian paramyxoviruses isolated from feral ducks in northern Japan: the presence of three distinct viruses in nature. Microbiol. Immunol. 1982; 26(7): 557-68. Doi: https://doi.org/10.1111/mim.1982.26.7.557
34. Bogoyavlenskiy A., Beresin V., Prilipov A., Usachev E., Lyapina O., Levandovskaya S., et al. Molecular Characterization of Virulent Newcastle Disease Virus Isolates from Chickens during the 1998 NDV Outbreak in Kazakhstan. Virus Genes. 2000; 31(1): 13-20. Doi: https://doi. org/10.1007/s11262-004-2195-2
35. Bogoyavlenskiy A., Beresin V., Prilipov A., Usachev E., Lyapina O., Korotetskiy I., et al. Newcastle disease outbreaks in Kazakhstan and Kyrgyzstan during 1998, 2000, 2001, 2003, 2004 and 2005 were caused by viruses of the genotypes VIIb and VIId. Virus Genes. 2009; 39(1): 94-101. Doi: https://doi.org/10.1007/s11262-009-0370-1
36. Korotetskiy I.S., Bogoyavlenskiy A.P., Prilipov A.G., Usachev E.V., Usacheva O.V., Turmagambetova A.S., et al. Molecular genetic characteristics of cyclic isolates of the Newcastle disease virus isolated on the territory of the Russian Federation, Ukraine, Kazakhstan, and Kyrgyz-stan. Voprosy virusologii. 2010; 55(4): 25-9. (in Russian)
37. Bogoyavlenskiy A., Beresin V., Prilipov A., Usachev E., Korotetskiy I., Zaitceva I., et al. Characterization of Pigeon Paramyxoviruses (Newcastle disease virus) Isolated in Kazakhstan in 2005. Virol. Sin. 2012; 27(2): 93-9. Doi: https://doi.org/10.1007/s12250-012-3234-0
38. Kydyrmanov A., Panshin A., Shihmanter E., Sayatov M. Monoclonal antibody analysis of avian paramyxovirus serotipe 1 (NDV) and serotype 2 (APMV2) strains isolated in Kazakhstan. In: News. The Annual Meeting of the Israel Society for Microbiology. Tel Aviv: Tel Aviv University Press; 1997.
39. Munir M., Linde A.M., Zohari S., Stahl K., Baule C., Engstrom B., et al. Whole genome sequencing and characterization of a virulent Newcastle disease virus isolated from an outbreak in Sweden. Virus Genes. 2011; 43(2): 261-71. Doi: https://doi.org/10.1007/s11262-011-0636-2
40. Shengqing Y., Kishida N., Ito H., Kida H., Otsuki K., Kawaoka Y., et al. Generation of velogenic Newcastle disease viruses from a nonpathogen-ic waterfowl isolate by passaging in chickens. Virology. 2002; 301(2): 206-11. Doi: https://doi.org/10.1006/viro.2002.1539
Поступила 07.09.18 Принята в печать 31.10.18
