Биологические свойства изолятов вируса ньюкаслской болезни, выделенных у голубей в Курской области

Репин Павел Иванович; Чвала Илья Александрович; Пчелкина Инна Петровна; Бахчин Иван Владимирович; Дрыгин Владимир Викторович

УДК 619:616.98:578.831.1.001.891

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ, ВЫДЕЛЕННЫХ У ГОЛУБЕЙ В КУРСКОЙ ОБЛАСТИ

UDC 619:616:98:578.831.1.001.891

BIOLOGIGAL PROPERTIES OF NEWCASTLE DISEASE VIRUSES ISOLATED FROM PIGEONS IN KURSK REGION

Репин Павел Иванович ведущий биолог

Федеральный центр охраны здоровья животных Чвала Илья Александрович

заведующий референтной лабораторией вирусных болезней птиц, кандидат ветеринарных наук

Пчелкина Инна Петровна

старший научный сотрудник, кандидат биологических наук

Бахчин Иван Владимирович аспирант

Дрыгин Владимир Викторович заместитель директора по НИР и развитию, доктор биологических наук, профессор ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир, Россия

Представлены данные по изучению биологических свойств изолятов вируса ньюкаслской болезни Ж)УЯ^еопЛ1ш/Киг8к/1/13 и Ж)УЛ^еопЛ1ш/Киг8к/2/13 , выделенных от голубей из голубятен в Курской области в 201 Зг, с использованием вирусологических и молекулярно-генетических методов

Ключевые слова: ВИРУС НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ, ПАРАМИКСОВИРУС ПТИЦ 1 СЕРОТИПА, САЙТ НАРЕЗАНИЯ БЕЛКА Б, ВИРУЛЕНТНОСТЬ, ГЕНОТИП

Repin Pavel Ivanovich leading biologist

Federal Centre For Animal Health, FGBI Chvala Ilya Aleksandrovich

Head of Reference Laboratory for Avian Viral Diseases, Candidate of Sciences (Veterinary Medicin)

Pchelkina Inna Petrovna

Senior Researcher, Candidate of Sciences (Biology)

Bahchin Ivan Vladimirovich postgraduate student

Dry gin Vladimir Viktorovich

Deputy Director for Research and Development, Doctor of Science (Biology), professor FGBI “ARRIAH”, Vladimir, Russia

The article provides the data of studying the biological properties of Newcastle disease virus isolates NDV/Pigeon/Rus/Kursk/1/13 and

NDV/Pigeon/Rus/Kursk/2/13 derived from pigeons in pigeon houses in the Kursk region in 2013 using virological and molecular genetic methods

Keywords: NEWCASTLE DISEASE VIRUS, SEROTYPE 1 AVIAN PARAMYXOVIRUS, PROTEIN F CLEAVAGE SAIT, VIRULENCE, GENOTYPE

Введение

Возбудителем ньюкаслской болезни (НБ) является РНК-содержащий парамиксовирус птиц 1 серотипа (ПМВ-1), относящийся к роду Avi.il ау1ш5 семейства Рагатухоутс1ае[1,2]. В естественных условиях и при экспериментальном заражении восприимчивыми к ньюкаслской болезни являются более 200 видов птиц, однако клинические признаки болезни варьируют в широких пределах, от легкого бессимптомного заболевания до системной генерализованной инфекции, способной вызывать в стадах смертность до 100 %. В настоящее время в лабораторной диагностике ньюкаслской болезни (НБ) нашли широкое применение

как молекулярно-генетические методы исследования, такие как ПЦР и нуклеотидное секвенирование с последующим филогенетическим анализом, так и традиционные методы - вирусологические и серологические [3,4,5]. Общепринятым стандартом изучения вирулентности вируса ньюкаслской болезни (ВНБ) является оценка индекса патогенности при интрацеребральном заражении цыплят и определение сайта нарезания белка Б. Так, согласно критериям Всемирной организации охраны здоровья животных (МЭБ), ньюкаслской болезнью может быть признана инфекция птиц, вызванная парамиксовирусом птиц 1 серотипа, отвечающая не менее, чем одному из критериев: вирус имеет значение индекса патогенности (1СР1) более 0,7, или содержит основные аминокислоты аргинин и лизин в позициях 113-116 в сайте нарезания (Б2-белок) и фенилаланина в позиции 117 (Б 1-белок) [6].

Материалы и методы

Выделение вируса. Вирусовыделение проводили в 10-суточных эмбрионах СПФ-кур (КЭ). Из биологического материала готовили 10% суспензию на фосфатно-буферном растворе (pH 7,2) и вводили в аллантоисную полость КЭ в объёме 0,2 мл [6]. Эмбрионы, погибшие после 24 ч. инкубации и более, использовали для сбора экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) и проведения дальнейших исследований.

РТГА. Для идентификации изолята ВНБ применяли РТГА с использованием антигенов и гипериммунных сывороток к вирусам гриппа и ньюкаслской болезни птиц производства ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) и Института зоопрофилактики (КБУе, Италия).

Определение титра инфекционности вируса НБ. Применяли метод десятикратных последовательных разведений (от 10_| до 10-9). Каждое разведение вируса инокулировали в аллантоисную полость четырём КЭ. Титр вируса в исходном материале определяли по методу Кербера и выражали в единицах ЭИДзо/см3.

Определение индекса патогенности вируса НБ при интрацеребралъном заражении. Интрацеребрально каждому из десяти суточных СПФ-цыплят вводили по 0,05 см3 исследуемой вирусосодержащей экстраэмбриональной жидкости в разведении 1:10 на стерильном ФБР.

В течение 8 суток эксперимента ежесуточно оценивали клиническое состояние каждой из птиц, и присваивали коэффициент: 0 - птица клинически здорова; 1 - птица больна, отмечены признаки заболевания (угнетение, отказ от корма и воды, нарушения деятельности респираторного или пищеварительного трактов, нервной системы); 2 - птица мертва. Погибшим птицам присваивали коэффициент 2 ежесуточно в течение 8 дней эксперимента [6].

Индекс патогенности (1СР1) вычисляли по формуле:

Ей-1 + ^-2)

1СР1 = --------------

8 • N

где Б— число больных в сутки /;

77— число погибших в сутки /;

N - общее количество птиц в эксперименте

В качестве отрицательного контроля использовали 5 суточных СПФ-цыплят, которым интрацеребрально вводили по 0,05см3 стерильного ФБР.

Определение индекса патогенности при внутривенном заражении 6-неделъных цыплят полученных из СПФ КЭ. Для определения 1УР1 использовали общепринятую методику (6). Исследуемую вирусосодержащую ЭЭЖ в разведении 1:10 на стерильном физиологическом растворе вводили внутривенно десяти цыплятам в дозе 0,1 см3. За птицами вели ежедневное наблюдение в течение 10 суток и учитывали клиническое состояние каждой птицы при помощи коэффициента: 0 - птица клинически здорова; 1 - больная (отмечены некоторые признаки заболевания, такие, как угнетение, отказ от корма и воды, нарушения со

стороны респираторного или пищеварительного тракта, нервные явления); 2 -тяжелобольная (одновременно наблюдаются несколько ярких клинических признаков инфекции); 3 - птица погибла. Погибшим птицам присваивали коэффициент 3 ежедневно, вплоть до десятых суток опыта. Индекс патогенности вычисляли по формуле:

10

Х(БГ1 + ТБГ2 + ПГ3)

IVPI = '='

10•N ^где

I)j - количество больных в сутки /;

ТБ, - количество тяжелобольных в сутки /;

77— количество погибших в сутки /;

N - общее количество птиц в эксперимент

В качестве контроля использовали 5 СПФ-цыплят в возрасте 6-недель, которым внутривенно вводили по 0,1 см3 стерильного ФБР.

Реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР). Очистка продуктов ОТ-ПЦР и нуклеотидное секвенирование. Выделение РНК, ОТ-ПЦР и секвенирования осуществляли по стандартной методике с помощью специфических праймеров [7,8]. Анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили, используя пакет прикладных программ BioEdit и MEGA 4. Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности ранее изученных изолятов и опубликованные последовательности вируса ньюкаслской болезни из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nili.gov)

Результаты и обсуждение

В январе 2013 г. в ФГБУ «ВНИИЗЖ» поступили 2 пробы патологического материала от павших голубей из голубятен г. Железногорск и г. Щигры Курской области. В хозяйствах обоих владельцев отмечали падеж голубей, у которых

наблюдали признаки поражения нервной системы и диарею. В обеих пробах патологического материала в ПЦР был выявлен геном ВНБ. В результате секвенирования была определена первичная структура фрагмента гена Б, кодирующая сайт нарезания белка Б0.

Аминокислотная последовательность данного участка гена для изолята ЫОУ/Р1/Яи8/Киг8к/2/13 имела структуру -112КК(2КК-Р117-, тогда как для изолята ЫЭ У/Р1/Яи8/Киг8к/1 /13 ^^Ш^КЯ-Б117-. Все изоляты имели в составе сайта нарезания парные основные аминокислоты (аргинин и лизин) в позициях 112-113 и 115-116 и остаток фенилаланина в позиции 117 , что позволило классифицировать изоляты как вирулентные.

Для сравнения изученных изолятов был проведён их филогенетический анализ и определена генотипическая принадлежность с использованием последовательностей ВНБ, опубликованных в СепВапк. Изученные изоляты, согласно полученным филогенетическим исследованиям, относятся к генотипу VI подтипу У1Ь, который вызвал эпизоотию ньюкаслской болезни у голубей с начала 80-х годов прошлого века [4]. В проведенных нами исследованиях было установлено, что изолят ЫЭ У/Р1/Яи8/Киг8к/1 /13 относится к «классической голубиной» генетической группе УГЬ/1, а изолят ЫОУ/Р1/Яи8/Киг8к/2/13 к генетической группе У1Ь/2 [1]. На рис показаны филогенетические отношения российских изолятов и ряда референтных штаммов и изолятов генотипа VI подтипа У1Ь генетических групп У1Ы1 и У1Ь/2.

Ближайшими к изоляту ЫОУ/Р1/Яи8/Киг8к/1/13 генетической группы У1Ь/1, выделенному от голубей в Курской области, относятся вирусы, выделенные в Бельгии (1X901124, ЛЧ872162) и Китае (1X486552) в период с 2008 по 2011 гг ( Данные СепВапк). Нуклеотидные отличия на общем фрагменте составляют 1-2% (рис).

К генетической группе У1Ь/2 принадлежит ряд изолятов, выделенных от голубей в Хорватии (АУ150144, АУ150162, АУ150163, АУ150165), Австрии (РАТРЮ0323, АУ471789), Польше (РРМУ-1/РЬ/Н2/10, НМ627541), Казахстане

(.(N806236), а также большинство изолятов, выделяемых от голубей в Российской Федерации (МВУ/Р1/Ки8/У1аёшпг/687/05 (1Р827026), ЫОУ/Р1/Яи5/Кетегоуо/0267/09 (1Р827027)), в том числе и изученный в данной работе изолят МОУ/Р1/Ки8/Киг8к/2/13. Нуклеотидные отличия на общем фрагменте составляют 1-2% (рис).

1*ЗТ20МН 0Г\2НиЯ\Г-УМЯЯ|

аО\Т8Э\-11гл1Ьб1\Лг1.Я\1Я-

6О\062О\б1|Л\гиЯ’

68ТГ^УАе2Ш

Э62Э08ИI 5О\^0О Г\у}бт1А\

0 1Л2£20\о\гатэтэ>Г

ТТ2088

ао\5

01ЯТАЯ

^09BІq\l'гVIVHA-

зиЯ^Я-60^020^01 эглаЖгиЯ^Я-тоггУАгб\г0гЯН

30 г ое Г- 2

]\£рЯН-

20ГОЗГУА го\т-ян е0гоагУА го\ааг-я

ГЛ/МЯЯ 28\Т22-Т1г

-20Т\а

686201

0^8 ГТ^УА Г^£Т01ЯТ1Я ----23 ГОЗ ГУА 86\ Г Г-ХМ

гапэгг)

ЗУА

9>1\8иЯ\1Я

ОО\0£Т2\у1вЛ\эуоЬ|

этг

8Г306ГУ

его

\^УА 2£2661ЯЫ А20\Г-иН

л™

гтиЖги

*рЯ-_

^2ГГОбХЬ ГГО2\О206О-гг\ти1в1эа\мтяя-20Г2Т8И1 80\0^6Мтые1эа\б|1эе©Я-886203УА 2Т\880Г\Зи\пэ)1о1Но

вtoЗвJ

20.0

£\с!1У

Г\Й

IV

в|У

Рис. Филогенетические отношения изолятов и штаммов ВНБ, построенные на основе последовательностей гена Р (нуклеотиды 1-374 ОРС гена Р), опубликованных в СепВапк и исследованных в данной работе (названия изолятов выделены жирным шрифтом).

С целью выделения вируса в аллантоисную полость 10-сут эмбрионов

СПФ-кур инокулировали суспензии биологического материала. Через 48-96 ч. инкубации произошла гибель всех эмбрионов. На тушках эмбрионов отмечали кровоизлияния, наиболее выраженные в области лап и головы. В РГА было установлено наличие в ЭЭЖ гемагглютинирующих агентов в титре 6 ^2 и 8 log2 для изолятов ЫЭ У/Р^Яиз/Кигек/1 /13 и ЫОУ/Р1/Яи8/Киг8к/2/13, соответственно. В результате типирования микроорганизма в РТГА с панелью гипериммунных сывороток к вирусу гриппа (Н1-Н16 подтипы) и парамиксовирусов птиц (1-9 серотипы) гемагглютинирующая активность была подавлена только сывороткой против ПМВ-1 (ВНБ) в титре 8 \og2-

Титр инфекционной активности изолята Ж)У/Р1/Ки8/Киг8к/1/13 при титровании в КЭ составил 8,25 ^ ЭИД50/мл, а изолята ЫОУ/Р1/Яи8/Киг8к/2/13 8,75 \ё ЭИД50/мл.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Для изучения вирулентных свойств изолята ВНБ провели эксперимент по определению индекса патогенности при интрацеребральном заражении цыплят, а также индекс патогенности при внутривенном заражении 6- недельных СПФ-цыплят. Результаты клинического наблюдения за цыплятами представлены в табл. 1и 2.

Таблица 1-Результаты наблюдения за цыплятами после интрацеребрального

заражения

Исследуемый изолят Клиническое состояние птицы Период наблюдения, сут. ICPI

1 2 3 4 5 6 7 8

NDV/Pigeon/Rus/K ursk/1/13 здоровые 10 10 6 0 0 0 0 0 1,2

больные 0 0 4 8 0 0 0 0

павшие 0 0 0 2 10 10 10 10

NDV/Pigeon/Rus/K ursk/2/13 здоровые 10 10 5 0 0 0 0 0 1,21

больные 0 0 5 6 2 0 0 0

павшие 0 0 0 4 8 10 10 10

При внешнем осмотре инфицированных цыплят отмечали такие признаки заболевания, как угнетение, отказ от корма и воды, парезы конечностей и параличи; при вскрытии наблюдали гиперемию тканей и кровоизлияния в головном мозге,

кишечнике, отечность легких. Инкубационный период длился не менее 2 сут, и все цыплята погибли в течение 4-5 сут. эксперимента. Как видно из представленных данных, индекс патогенности имел значение 1,20 для изолята

МОУМ/Яш/Китек/ШЗ, и 1,21 для изолята ЫОУ/Р1/Яи8/Киг8к/2/13, что позволило идентифицировать изоляты как вирулентный вирус ньюкаслской болезни.

Таблица 2-Результаты наблюдения за цыплятами после внутривенного

заражениия

Исследуемы й изолят Клиническое состояние птицы Период наблюдения, сут. 1УР1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ш\//Р1деоп/ РиБ/КигекЛ/ 13 здоровые 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 0

больные 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

тяжелобольные 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

павшие 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Ш\//Р1деоп/ Киь/КигьШ 13 здоровые 10 10 10 10 9 9 8 8 8 8 0,26

больные 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0

тяжелобольные 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

павшие 0 0 0 0 0 1 1 2 2 2

При внешнем осмотре цыплят, инфицированных изолятом ЫОУ/Р1/Яи8/Киг8к/2/13, признаки заболевания (отказ от корма, угнетение, парезы конечностей) отмечались у двух цыплят, погибших на 7 и 8 сутки эксперимента, у остальных цыплят признаков болезни не наблюдалось, индекс 1УР1 имел значение 0,26. При осмотре цыплят, инфицированных изолятом Ж)У/Р1/Ки8/Киг8к/1/13, птицы оставались клинически здоровыми в течение всего эксперимента, индекс 1УР1 имел значение 0,0. Ранее было показано, что индексы патогенности при внутривенном заражении цыплят имели низкие значения для вирусов, выделенных от диких видов птиц, в том числе голубей [9,10,11,12]. Низкое значение индекса 1УР1 в наших исследования, по всей видимости, связано с тем, что оба изолята принадлежали к классической «голубиной» линии, и они были неспособны вызвать клиническую болезнь у 6-недельных цыплят без предварительной адаптации. Именно поэтому в настоящее время МЭБ рекомендует применять 1СР1 для

Научный журнал КубГАУ, №93(09), 2013 года определения потенциальной вирулентности ВНБ.

Заключение

Проведенные нами исследования показали, что исследуемые изоляты NDV/Pi/Rus/Kursk/1/13 и NDV/Pi/Rus/Kursk/2/13 относятся к генетическим группам VIb/1 и VIb/2, соответственно. При проведении интрацеребрального заражения суточных цыплят и молекулярно-генетических исследований подтверждены вирулентные свойства данных изолятов. Индекс IVPI для изолятов NDV/Pi/Rus/Kursk/1/13 и NDV/Pi/Rus/Kursk/2/13 был равен 0,0 и 0,26, соответственно, что характерно для ВНБ, выделенного от голубей.

Список литературы

1.Ujvari, D. Phylogenetic analysis reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type 1 strains of pigeons (Columba livid) and suggests multiple species transmission / D. Ujvari, E. Wehmann, E.F. Kaleta [et al.] // Virus Res. - 2003 . - Vol. 96, N 1-2. - P. 63-73.

2.Вирус ньюкаслской болезни, выявленный в популяциях диких и синантропных птиц на территории России в 2008 году / И.П. Пчёлкина, С.Н Колосов, Т.Б. Манин [и др.] // Вет. медицина: мгжвщ. тем. наук. зб. - 2009. - Вип. 92. - С. 417-422.

3.Биологические свойства вируса ньюкаслской болезни, выделенного в 2010 году из популяции голубей в Кемеровской области / П И Репин, И.П. Пчёлкина, И.А Чвала [и др.] // Ветеринария сегодня,- 2013.-№1,- С. 29-34.

4. A molecular epidemiological investigation of isolates of the variant avian paramyxovirus

type 1 virus (PPMV-1) responsible for the 1978 to present panzootic in pigeons / E.W. Aldous, C.M. Fuller, J.K. Mynn, D.J. Alexander // Avian Pathol. - 2004. - Vol. 33, N 2. - P. 258-269

5. Structural comparison of the cleavage-activation site of the fusion glycoprotein between

virulent and avirulent strains of Newcastle disease virus / T. Toyoda, T. Sakaguchi, K. Imal [et al.] // Virology. - 1987 - Vol. 158. - P. 242-247.

6. Newcastle disease // O.I.E. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines, adopted

2012.

7. I. P. Pchelkina, Т. B. Manin, S. N. Kolosov, S. K. Starov, A. V. Andriyasov, I. A. Chvala, V. V. Drygin, Q. Yu, P. J. Miller, D. L. Suarez. Characteristics of Pigeon Paramyxovirus Serotype-1 Isolates (PPMV-1) from the Russian Federation from 2001 to 2009 / AVIAN DISEASES 57:2-7, 2013.

8. I. P. Pchelkina, Т. B. Manin, V. V. Drygin, S. K. Starov. Newcastle disease: molecular-biological diagnosis in the Russian Federation / FAO/IAEA International Symposium on sustainable improvement of animal production and health. Abstract book. - Vienna, Austria, 2009. - P. 352.

9. Alexander DJ: Newcastle disease diagnosis. In Newcastle Disease. Edited by:Alexander DJ. Boston: Kluwer Academic Publishers; 1988:147-160.

10. Pearson JE, Senne DA, Alexander DJ, Taylor WD, Peterson LA, Russell PH:Characterization of Newcastle disease virus (avian paramyxovirus-1) isolated from pigeons. Avian

Научный журнал КубГАУ, №93(09), 2013 года Dis 1987, 31:105-111

11. Alexander DJ, Gough RE: Newcastle disease, other avian paramyxoviruses and pneumovirus infections. In Diseases of Poultry.. 11 edition. Edited by: Saif YM, Barnes HJ, Fadly AM, Glisson JR, McDougald LR, Swayne DE. Iowa State University Press USA; 2003:63-92.

12. Alexander DJ: Newcastle disease. Chapter 2.3.14. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Paris, France: OIE, the World Organisation for Animal Health; 2009, 576-589

References

1. Ujvari, D. Phylogenetic analysis reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type 1 strains of pigeons (Columba livia) and suggests multiple species transmission / D. Ujvari, E. Wehmann, E.F. Kaleta [et al.] // Virus Res. - 2003 . - Vol. 96, N 1-2. - P. 63-73.

2. Virus n'jukaslskoj bolezni, vyjavlennyj v populjacijah dikih i sinantropnyh ptic na territorii Rossii v 2008 godu / I.P. Pchjolkina, S.N. Kolosov, T.B. Manin [i dr.] // Vet. medicina: mizhvid. tem. nauk. zb. - 2009. - Vip. 92. - S. 417-422.

3. Biologicheskie svojstva virusa n'jukaslskoj bolezni, vydelennogo v 2010 godu iz populjacii golubej v Kemerovskoj oblasti / P.I Repin, I.P. Pchjolkina, I.A Chvala [i dr.] // Veterinarija segodnja.-

2013.-№1.- S. 29-34.

4. A molecular epidemiological investigation of isolates of the variant avian paramyxovirus type 1 virus (PPMV-1) responsible for the 1978 to present panzootic in pigeons / E.W. Aldous, C.M. Fuller, J.K. Mynn, D.J. Alexander // Avian Pathol. - 2004. - Vol. 33, N 2. - P. 258-269

5. Structural comparison of the cleavage-activation site of the fusion glycoprotein between virulent and avirulent strains of Newcastle disease virus / T. Toyoda, T. Sakaguchi, K. Imal [et al.] // Virology. - 1987 - Vol. 158. - P. 242-247.