CC BY
54
Молекулярно-генетическая характеристика производственных штаммов коклюшных бактерий
И.А. Алексеева1 (iaalex@list.ru), Р.П. Чупринина1, И.В. Борисевич1, Н.Н. Курова2, Г.Я. Ценева2, Ю.В. Останкова2, А.В. Семенов2
1 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва (info@gisk.ru)
2 ФБУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург
Резюме
Проведено сравнительное изучение генома всех производственных штаммов, используемых в России для изготовления коклюшного компонента комбинированных вакцин, и штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных детей. По итогам исследований с помощью электрофореза в пульсирующем поле (ЭФПП) штамм 475 отнесен ко II группе, остальные штаммы - к III группе, изоляты от больных детей - к IV группе. При секвенировании гена ptxA выявлено, что штаммы 345 и 475 имеют аллель ptxA4, штамм 703 - ptxAl, остальные штаммы - ptxA2. У всех производственных штаммов обнаружены гены фимбрий аллелей fim2-1, fim3A и ген пертактина аллель prnl. У изолятов выявлены аллели fim2-1, fim3A, fim2-2, fim3B и prn2. Установлены определенные различия генотипов производственных штаммов и штаммов, выделенных от больных детей. Для оценки адекватности коклюшных вакцин необходимы модельные опыты по выявлению влияния установленных различий на защитные свойства коклюшных вакцин в отношении современной циркулирующей популяции B. pertussis. Ключевые слова: коклюш, штаммы Bordetella pertussis, генотип производственных штаммов B. pertussis, генотип циркулирующих штаммов B. pertussis
Molecular Genetic Characteristics of Industrial Strains of Pertussis Bacteria
I.A. Alekseeva1 (iaalex@list.ru), R.P. Chuprinina1, I.V. Borisevich1, N.N. Kurova2, G.Уа. Tseneva2, Yu.V. Ostankova2, A.V. Semenov2 1 Federal State Budgetary Institution «Scientific Center for Expertise of Medical Products» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow (info@gisk.ru)
2Federal State Budgetary Institution «Paster Epidemiology and microbiology Science-Research Institute» of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Saint-Petersburg Abstract
The comparative study of the genome of all of the vaccine strains in Russia to the pertussis vaccine preparation was performed as well the study of Bordetella pertussis strains isolated from children patients.
Analysis show that strain 475 belong to PFGEII group, other vaccine strains - PFGEIII group, isolates - PFGEIVgroup. Sequencing of genes ptxA, fim2, fim3 show that strains 345 and 475 have allele ptxA4, 703 - ptxA1, other vaccine strains - ptxA2. All vaccine strains have alleles fim2-1 and fim3A of Fim gene and allele prn1 of prn gene. Isolates have alleles fim2-1, fim3A, fim2-2, fim3B of fim gene and allele prn2 of the prn gene.
Some differences of the genotype of wild and vaccine strains of B. pertussis are established. In order to assess the importance of those differences exists the necessity for performing of the model experients.
Key words: pertussis, Bordetella pertussis strains, genotype of vaccine strains of B. pertussis, genotype of clinical isolates of B. pertussis
Введение
Еще на первом этапе разработки коклюшной вакцины было обращено внимание на значительную вариабельность биологических свойств коклюшных бактерий, как культивированных в лабораторных условиях, так и непосредственно выделенных от больных [15]. В начале 60-х годов ХХ века в связи с гипотезой N.W. Preston о типоспецифичности противококлюшного иммунитета [23, 24] особенно остро встал вопрос о необходимости использовать в готовой коклюшной вакцине штаммы коклюшных бактерий серотипов 1, 2 и 3. Данные рекомен-
дации были сформулированы экспертами ВОЗ в Требованиях к коклюшной вакцине в 1990 году [7]. В годы массовой вакцинации произошла смена доминирующих серотипов циркулирующих штаммов 1.2.0 и 1.2.3 на серотип 1.0.3 [4, 23, 24]. С помощью современных молекулярно-генетических методов исследования (электрофорез в пульсирующем поле - ЭФПП, IS-1002-типирование ДНК) было подтверждено, что популяция Bordetella pertussis имеет клональную структуру. Анализ результатов исследований, проведенных в разных странах, свидетельствует об изменениях профилей ДНК цирку-
лирующих штаммов B. pertussis, произошедших с момента широкого введения иммунопрофилактики коклюша. Выявлены изменения в структуре генов, кодирующих синтез основных токсинов и адгезинов у циркулирующих штаммов коклюшного микроба, по сравнению со штаммами, используемыми для изготовления коклюшных вакцин: S1- и S3-субъединицы коклюшного токсина (ptxA и ptxC соответственно), пертактина (prn), фактора колонизации трахеи (tcfA) и фимбрий (fim2, fim3) [6, 8, 12, 14, 16, 27, 30]. Ряд исследователей в разные годы пытались связать рост заболеваемости коклюшем в странах с высоким уровнем охвата населения прививками против коклюша с изменением серотипа и появлением новых профилей ДНК у циркулирующих штаммов В. pertussis [4, 10, 20, 23, 24].
Проводимые в последние годы исследования генома B. pertussis показали, что в течение периода массовой иммунизации циркулирующие штаммы прогрессивно утрачивают хромосомный материал. Хромосомные локусы, содержащие «выпадающие» гены, получили название «регионы различий» - RD (Regions of Difference), их описано уже более двадцати. В частности, RD2 (BP1135 - BP1141) присутствовал в геноме штаммов II ЭФПП-группы, но отсутствовал в геноме большинства штаммов остальных групп; RD3 (BP1158 - BP1176) обнаружен в геноме штаммов, выделенных до 1980 года (в основном III группы), однако его не было у штаммов, выделенных после 2000 года, независимо от ЭФПП-группы. RD4 (BP1948 - BP1966) отсутствовал у штаммов IV в группы. Часть утраченных генов отвечали за транспорт, метаболизм, продукцию и преобразование энергии [9].
Ранее в РФ были проведены исследования четырех производственных штаммов B. pertussis методом ЭФПП. Этот метод предложен как наиболее удачный из методов «отпечатков пальцев» ДНК (DNA fingerprinting) для типирования B. pertussis. Н.Н. Куровой с соавт. [5, 14] при изучении хромосомной ДНК вакцинных штаммов 267, 39, 305, 475, тест-штамма 18 323 и штаммов, выделенных от больных в разные годы, были установлены генетические различия между ними, что согласуется с данными других исследователей о генетическом разнообразии внутри вида B. pertussis [6, 8, 30].
Цель данной работы - изучение генома всех производственных штаммов, используемых в нашей стране для изготовления цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин, и проведение сравнительного анализа их с геномом штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем детей.
Материалы и методы
Производственные штаммы 187, 305, 312 были выделены на территории России от больных детей в 1955 - 1956 годах, 345 - в 1959 году, 38,
39, 267, 475, 703 - в 1966 - 1971 годах. Тест-штамм 18 323 получен из США в 1955 году. Для сравнительного исследования использовали штаммы B. pertussis, выделенные в Санкт-Петербурге от больных коклюшем детей: 275 (в 2009 г.), 284, 285, 287, 289 (в 2011 г.).
Производственные штаммы хранили в лиофи-лизированном виде в ампулах, свежевыделен-ные - в глубокой заморозке (-80 0С) в среде, предложенной F.R. Mooi и соавт. [19]. Для сравнительного изучения исследуемые штаммы регидратиро-вали из лиофильного состояния в 0,3 мл стерильной дистиллированной воды. Регидратированную или замороженную культуру высевали на среду КУА с добавлением 10% крови человека и выращивали в термостате при температуре 37 ± 1 0С. В работе использовали культуры второго пассажа (культуру первого пассажа выращивали в течение 72 ч, второго пассажа - 36 ч).
Серотипирование производственных и свеже-выделенных штаммов проводили с использованием адсорбированных сывороток к агглютиногенам 1, 2 и 3 производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.
Исследование ДНК изучаемых штаммов осуществляли с помощью ЭФПП. Постановку ЭФПП проводили по методике, описанной F.R. Mooi и со-авт. [19]. После разрушения клеточной стенки ДНК подвергали обработке рестриктазой Xbal. Профили ДНК исследуемых штаммов сравнивали с профилями ЭФПП референс-штаммов, представляющих основные группы.
Хромосомные локусы, содержащие «выпадающие» гены, изучали с помощью ПЦР отдельных генов в составе RD: для выявления RD2 применяли ПЦР гена BP1136, для RD3 - ПЦР гена BP1160, RD4 - ПЦР гена BP1966 [9]. ДНК из бактериальной суспензии выделяли с помощью набора «РИБО-преп» (ЦНИИЭ, Москва). Постановку ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Москва). Продукты ПЦР выявляли методом электрофореза в агарозном геле.
Секвенирование генов ptxA [11], fim2 [31], fim3 [31] и фрагментов гена prn [19] проводили методом Сэнгера с использованием коммерческого набора DTCS Quick Start Master Mix (Beckman Coulter Inc., США). Продукты ПЦР очищали на колонках Silica spin согласно общепринятой методике с использованием этанола. Секвенирование последовательностей проводили с помощью прямого и обратного праймеров в трех повторностях на секвенаторе Genomelab GeXP (Beckman Coulter Inc., США). Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с ранее опубликованными в GenBank.
Результаты и обсуждение
Серотипирование
За последние десятилетия в нескольких многоцентровых исследованиях было установлено, что агглютиногены (фимбрии) - поверхностно расположенные антигены коклюшных бактерий - прини-
мают участие в патогенезе коклюшной инфекции и формировании противококлюшного иммунитета [21, 22, 25, 29]. Поэтому проведен мониторинг продукции фимбрий - важных протективных антигенов коклюшных бактерий. Согласно действующим нормативным документам для производства коклюшного компонента используют суспензии, изготовленные на основе трех штаммов серотипов 1.2.3, 1.2.0 и 1.0.3, взятых в равных соотношениях. Количественное определение содержания агглю-тиногенов 1, 2 и 3 проводят регулярно в производственных условиях при пассировании штаммов на среде Борде-Жангу (или КУА с добавлением крови) и в коклюшной суспензии.
Как видно из таблицы 1, производственные штаммы представлены тремя серотипами: 1.2.3, 1.2.0 и 1.0.3. Исследуемые штаммы, выделенные от больных детей, относились к серотипу 1.0.3. Высокое количественное содержание агглютиногенов в производственных штаммах поддерживается регулярной селекционной работой, которую осуществляют в специализированной лаборатории НЦЭСМП (ранее - ГИСК им. Л.А. Тарасевича).
Исследование ДНК изучаемых штаммов с помощью электрофореза в пульсирующем поле
Результаты данной работы и материалы, полученные ранее, показали, что профили исследуе-
мых с помощью ЭФПП производственных штаммов могут быть отнесены к следующим группам: тест-штамм 18 323 - к I группе, штамм 475 - ко II группе, штаммы 187, 267, 38, 39, 305, 312, 703 - к III группе. Штаммы, выделенные от больных детей, принадлежат к IV группе, что совпадает с данными, полученными в РФ ранее при изучении хромосомной ДНК вакцинных штаммов 267, 39, 305, 475, тест-штамма 18 323 и штаммов, выделенных от больных в разные годы [14].
Таким образом, производственные штаммы, выделенные в 1955 - 1970 годах, относятся к группам II и III, как и другие циркулировавшие в тот период штаммы B. pertussis, и по электрофоре-тическим профилям ДНК отличаются от штаммов, циркулирующих в настоящее время.
ПЦР фрагментов RD (Regions of Difference)
Как указывалось выше, одной из задач настоящего исследования было сравнение ДНК производственных и выделенных от больных детей штаммов B. pertussis по содержанию разных фрагментов RD. Необходимо было проанализировать, насколько потеря генов представляет собой общую тенденцию популяций штаммов B. pertussis, циркулирующих в странах, проводивших массовую вакцинацию против коклюша.
Таблица 1.
Характеристика производственных и свежевыделенных штаммов по количественному содержанию агглютиногенов (фимбрий) 1, 2 и 3
№ штамма Агглютинация с сывороткой к агглютиногену*
Производственные штамммы (дата внедрения в производство) 1 2 3
38 (1967 г.) 3200 1600 0
39 (1980 г.) 10 240 10 240 10 240
187 (1964 г.)** 640 160 0
267 (1968 г) 10 240 0 10 240
305 (1958 г) 5120 1280 0
312 (1962 г) 6400 1600 400
345 (1962 г) 6400 1600 400
475 (1967 г) 5120 1280 10 240
703 (1977 г) 10 240 0 10 240
18 323 (тест-штамм) 10 240 20 480 2560
Штаммы, выделенные от больных детей
275 640 0 640
284 1280 0 640
285 1280 0 2560
287 640 0 1280
289 1280 0 2560
Примечание: *Представлены обратные величины титров адсорбированных сывороток, выявляющих агглютиногены на 3 креста; **в настоящее время не используют в производстве.
RD2 выявлен у двух производственных штаммов 312 и 475; у остальных исследуемых штаммов - отсутствует, RD3 - у всех изученных штаммов (производственные штаммы II и III групп и выделенные от детей штаммы IV группы), RD4 - у штаммов 38, 39, 267, 305, 312, 475, 703 (производственные штаммы; у исследованных штаммов, выделенных от больных, отсутствует).
Секвенирование генов - маркеров вирулентности коклюшного микроба
Для получения дополнительной информации о степени отличия производственных штаммов от тех, которые циркулируют среди населения, проведено секвенирование генов S1-субъединицы коклюшного токсина (ptxA), фрагментов гена пер-тактина (prn) и генов, кодирующих фимбрии (fim2, fim3).
Результаты исследования свидетельствуют -ген ptxA отличается по структуре на вариабельных участках у следующих производственных штаммов:
• 38, 39, 187, 267, 305, 312 - выявлен аллель гена ptxA2;
• 345, 475 - аллель гена ptxA4;
• производственного 703 и свежевыделенных штаммов 275, 284, 285, 287, 289 - аллель гена ptxA1.
В таблице 2 показано, что замена нуклеотидов в аллелях гена приводит к замене кодируемых соответствующими триплетами аминокислот в составе S1-субъединицы коклюшного токсина.
Секвенирование фрагментов гена пертактина
Фрагменты (AFR и BFR) гена пертактина -иммунодоминантные участки, распознаваемые В-лимфоцитами. Однако у преобладающего большинства штаммов B. pertussis различия найдены только в AFR.
При секвенировании фрагмента AFR гена пер-тактина было установлено, что производственные штаммы 38, 39, 267, 305, 312, 475 и 703 содержат аллель гена prn1 (вариабельный участок кодируемой им аминокислотной последовательности - GAVPGGAVPGGF), циркулирующие штаммы 275, 284, 285, 287, 289 - аллель гена prn2 (вари-
абельный участок кодируемой им аминокислотной последовательности - GAVPGGFGPGGFGPGGF). При секвенировании фрагмента BFR различий у штаммов не выявлено.
Секвенирование генов фимбрий fim2, fim3
Основными субъединицами, формирующими серотипы коклюшного микроба, являются Fim2 и Fim3 (агглютиногены 2 и 3), кодируемые генами fim2 и fim3, имеющимися у штаммов разных серо-варов, то есть они теоретически могут продуцировать один, другой или оба типа фимбрий. Геномный анализ первичной последовательности нукле-отидов выявил, что все три вида рода Bordetella (B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica) имеют эти гены. Фрагмент гена fim2, кодирующий предполагаемый С-концевой участок молекулы белка Fim2, варьируется у B. pertussis [26].
Полученные нами результаты (табл. 3) свидетельствуют о том, что у производственных и большинства исследованных свежевыделенных штаммов обнаружены аллели fim2-1, у двух свежевыделенных штаммов 284 и 285 - аллель fim2-2. У всех исследованных штаммов (кроме штамма 284) обнаружен аллель fim3A; у штамма 284 - fim3B.
Результаты исследования производственных штаммов, выделенных в 1955 - 1970 годах, и штаммов коклюшных бактерий, выделенных от больных коклюшем детей в 2009 - 2011 годах, продемонстрировали, что в геноме циркулирующих штаммов произошли изменения. Различия между штаммами возникли из-за мутаций в структурных генах, кодирующих коклюшный токсин и адгезины (фимбрии, пертактин), независимо от их серотипо-вой принадлежности.
По итогам исследования методом ЭФПП производственные штаммы отнесены к III группе (за исключением штамма 475 - II группа), циркулирующие штаммы - к IV группе, что совпадает с ранее полученными данными в РФ и в мире (см. табл. 3) [5, 9, 30].
Среди производственных штаммов при секве-нировании гена ptxA выявлено три варианта последовательности нуклеотидов: у штаммов 345 и 475 обнаружен аллель ptxA4, что ранее описано для штаммов II группы; остальные производственные
Таблица 2.
Варианты гена Sl-субъединицы коклюшного микроба
Аллели гена Вариабельные участки гена ptxA
196 - 210 679 - 695
ptxAl GTGCTCGAC* CATCTG D** CGCATAGCGCCGGTG ATA I I
ptxA2 ATG M
ptxA4 GAA E ATG GTG M V
Примечание: *Здесь и далее: нуклеотид, подвергающийся замене;
**здесь и далее: аминокислота, кодируемая указанным выше триплетом.
Таблица 3.
Характеристика вакцинных и циркулирующих штаммов по содержанию отдельных генов
Штаммы Серотип ptx prn fim2 fim3 RD2 RD3 RD4 Группа по ЭФПП
38 1.2.0 ptxA2 prn1 fim2-1 ^т3А - + + III
187 1.2.0 ptxA2 prn1 fim2-1 пт3А - + + III
305 1.2.0 ptxA2 prn1 fim2-1 ^т3А - + + III
39 1.2.3 ptxA2 prn1 fim2-1 пт3А - + + III
475 1.2.3 ptxA4 prn1 fim2-1 ^т3А + + + II
312 1.2.3 ptxA2 prn1 fim2-1 пт3А + + + III
345 1.2.3 ptxA4 prn1 fim2-1 Ш3А - + + III
267 1.0.3 ptxA2 prn1 fim2-1 /го3А - + + III
703 1.0.3 ptxA1 prn1 fim2-1 Ш3А - + + III
275 1.0.3 ptxA1 prn1 fim2-1 /го3А - + - IV
284 1.0.3 ptxA1 prn1 fim2-2 fim3B - + - IV
285 1.0.3 ptxA1 prn1 fim2-2 /го3А - + - IV
287 1.0.3 ptxA1 prn1 fim2-1 Ш3А - + - IV
289 1.0.3 ptxA1 prn1 fim2-1 /го3А - + - IV
штаммы содержат аллель ptxA2, кроме штамма 703, выделенного в 1970 году, - он, как и циркулирующие штаммы, содержит аллель ptxAl.
Согласно публикациям отечественных исследователей [3], среди штаммов, выделенных в последнее десятилетие (с 2000 г.), по-прежнему продолжают циркулировать штаммы со старой клональ-ной структурой - ST1, ST2 и ST3, но преобладают штаммы с новой клональной структурой: ST5 и ST8; аллельный профиль последнего представлен двумя «вакцинными» аллелями ptxA и tcfA и одним «невакцинным» - ptxC.
Все изученные штаммы B. pertussis, выделенные в разные годы, независимо от периода эпидемического процесса, включая производственные штаммы, были однородны по структуре гена tcfA и содержали «вакцинный» аллель tcfA2 [2].
Секвенирование гена пертактина дало результаты, сходные с опубликованными ранее: все производственные штаммы содержат аллель гена prnl, штаммы, выделенные от больных коклюшем детей, - prn2. По данным исследователей из Санкт-Петербурга, до 41% выделенных в 1998 - 2000 годах изолятов содержали «вакцинный» аллель гена prnl [5]. Вариабельность этого гена отмечена в других исследованиях [3, 13].
Исследования in vitro и in vivo свидетельствуют, что взаимодействие бактерий с эпителиальными клетками или с моноцитами/макрофагами, обусловленное фимбриями, играет важную роль не только в прикреплении, но также в природе самой инфекции и в выраженности иммунного ответа хозяина на коклюшную инфекцию [17, 28]. У всех изученных производственных штаммов обнаруже-
ны гены фимбрий аллелей fim2-1 и f/m3A. У исследованных выделенных штаммов выраженной изменчивости фимбриальных генов не выявлено: из пяти штаммов у двух был обнаружен аллель f/m2-2 и у одного - f/m3B. Остальные изоляты содержали «вакцинные» аллели f/m2-1 и f/m3A. По данным О.Ю. Борисовой с соавт. [8], в Москве и Московской области среди изученной авторами циркулирующей популяции B. pertussis преобладали штаммы, содержащие аллели fim2-2 и f/m3B.
Таким образом, из производственных штаммов, относящихся ко II (штамм 475) и III (штаммы 38, 39, 187, 267, 305, 312, 345) ЭФПП-группам, ptxA4 выявлен у штаммов 475 и 345, ptxA2 - у штаммов 38, 39, 187, 267, 305, 312, ptxAl - у штамма 703; при этом у всех изученных производственных штаммов выявлены ген пертактина prn1 и гены фимбрий аллелей fm2-1 и f/m3A. Уникальный тест-штамм 18 323, который используют при оценке иммуногенной активности коклюшных вакцин по рекомендованному ВОЗ методу экспериментального менингоэнцефалита, отнесен к I ЭФПП-группе и содержит аллели ptxS1E, prn6 и tcfA5 [19].
В последние годы отмечалось, что геном B. pertuss/s прогрессивно утрачивает хромосомный материал. В результате проведенного нами исследования установлено, что фрагмент генома RD2 был утрачен всеми изученными штаммами, кроме штамма 475 (выделен в 1966 г.), относящегося ко II ЭФПП-группе, и штамма 312 III группы, выделенного до начала вакцинации (в 1956 г.). Это в целом совпадает с данными других авторов, согласно которым указанный фрагмент генома встречается главным образом у штаммов, выделенных в до-
вакцинальный период и относящихся ко II ЭФПП-группе. Локус RD4 выявлен у изученных производственных штаммов (38, 39, 267, 305, 312, 475, 703) и отсутствует у штаммов, выделенных от больных, что также совпадает с данными публикаций зарубежных авторов [9]. Локус RD3, который другими авторами обнаруживался преимущественно у выделенных до 1980 года штаммов и отсутствовал у выявленных после 2000 года, в данном исследовании был обнаружен у всех изученных штаммов, в том числе у пяти, выделенных в последние годы от больных детей.
Хотя объем данного исследования недостаточен для того, чтобы сделать однозначные выводы, полученные результаты подтверждают наблюдение о меньшей выраженности изменений генотипа штаммов, циркулирующих в Санкт-Петербурге [5] по сравнению с зарубежными и отечественными штаммами, выделенными в разных регионах страны [8, 9].
Итоги проведенных исследований показывают, что производственные и свежевыделенные штаммы в большей или меньшей степени различаются по структуре генов коклюшного токсина (ptxA), фрагмента AFR пертактина (prn) и фимбрий fim2 и fim3.
Как отмечено выше, по-прежнему продолжают циркулировать штаммы со старой клональной структурой - ST1, ST2 и ST3, но преобладают штаммы с новой клональной структурой - ST5 и ST8. Причем ST8 содержит «вакцинные» аллели двух ведущих протективных антигенов.
Все изученные штаммы B. pertussis, выделенные в разные годы, содержали «вакцинный» аллель tcfA2 [2]. По данным исследователей [5], во многих из выделенных изолятов содержался «вакцинный» аллель гена prnl. Эти данные могут быть косвенным доказательством эффективности отечественной коклюшной цельноклеточной вакцины.
Геном штаммов коклюшных бактерий, выделенных в период массовой иммунопрофилактики инфекции, имеет меньший размер по сравнению со штаммами-предшественниками. Эволюция циркулирующих штаммов коклюшных бактерий происходит по типу «потери гена» и «изменения гена». По данным V. Bouchez и соавт., превалирующие клинические штаммы B. pertussis отличались от «вакцинных» потерей псевдогенов и генов, не имеющих отношения к вирулентности. Аллельный полиморфизм монону-клеотидных участков, являющийся типичной чертой генома B. pertussis, может играть роль в процессе адаптации B. pertussis к организму человека, быть следствием высокого уровня популяционного иммунитета, с которым должны сталкиваться бактерии В. pertussis, или участвовать в процессах обхода иммунного ответа [9]. Требуются дальнейшие исследования и наблюдения за циркулирующими штаммами.
Следует отметить, что используемые в РФ производственные штаммы независимо от серо- и генотипа важных протективных антигенов (коклюшного токсина, пертактина и фимбрий) обладают
высокими вирулентными и дермонекротическими свойствами, высокой иммуногенной активностью, определяемой по рекомендованному ВОЗ тесту экспериментального менингоэнцефалита при заражении мышей уникальным штаммом 18 323 [1]. При этом ранее было показано, что результаты оценки иммуногенной активности коклюшных вакцин в лабораторном тесте коррелируют с показателями их эффективности в клинических исследованиях [18].
По официальным данным Роспотребнадзора, отечественные вакцины АКДС и Бубо-Кок, содержащие цельноклеточный коклюшный компонент, при высоком охвате детей декретированного возраста прививками эффективно защищают от коклюшной инфекции. Так, с 2005 года, когда ситуация с охватом населения прививками значительно улучшилась, средний показатель заболеваемости по стране составлял от 7,11 (2008 г.) до 3,34 (2011 г.) на 100 тыс. населения.
Вместе с тем отмечается рост заболеваемости коклюшем детей старшего возраста, подростков и взрослых, которые являются резервуаром коклюшной инфекции и заражают детей младенческого возраста, не привитых против этой инфекции. Такая тенденция характерна для многих стран мира, в том числе для развитых стран с высоким уровнем охвата населения прививками, независимо от введения цельноклеточной или бесклеточной коклюшной вакцины. Отечественные и зарубежные исследователи данную ситуацию объясняют многими причинами: разным качеством используемых цель-ноклеточных и бесклеточных вакцин; несоблюдением сроков или неполным курсом вакцинации, что приводит к выработке непродолжительного и недостаточно напряженного поствакцинального противококлюшного иммунитета; изменением се-ротипа и генотипа важных протективных антигенов; гипер- или гиподиагностикой коклюша из-за несовершенства диагностических методов исследования; отсутствием в отечественном Календаре профилактических прививок второй и третьей ревакцинаций.
Решение проблемы заболеваемости коклюшем помимо организационных мер требует дальнейших исследований, направленных на изучение особенностей формирования механизмов постинфекционного и поствакцинального противококлюшного иммунитета, а также дальнейших исследований и наблюдений за циркулирующими штаммами. Для заключения об адекватности производимых вакцин недостаточно только обнаружения различий циркулирующих и производственных штаммов на уровне генома - необходимы модельные опыты по выявлению влияния этих различий на протек-тивные свойства коклюшного компонента вакцин в отношении современной циркулирующей популяции B. pertussis.
В настоящее время эксперты Strategic Advisory Group of Experts (SAGE) полагают, что нет доказа-
тельств снижения эффективности коклюшных вак- 3.
цин по отношению к новым штаммам [32].
Выводы
1. Сравнительная оценка хромосомных локусов RD показала, что фрагмент генома RD2 был утрачен всеми изученными штаммами, кроме штамма 475 (выделен в 1966 г.), относящегося ко II ЭФПП-группе, и штамма 312, относящегося к III группе, но выделенного до начала вакцинации (в 1956 г.). Локус RD4 выявлен у изученных производственных штаммов (38, 39, 267, 305, 312, 475, 703) и отсутствует у штаммов, выделенных от больных. Локус RD3 выявлен у всех изученных штаммов, включая пять штаммов, выделенных в последние годы 4. от больных детей.
2. Из производственных штаммов, относящихся ко II (штамм 475) и III (штаммы 38, 39, 187, 267, 305, 312, 345) ЭФПП-группам, аллель ptxA4 коклюшного токсина выявлен у штаммов 475 и 345, аллель ptxA2 - у штаммов 38, 39, 187, 267, 305, 312, аллель ptxA1 - у штамма 703; у всех изученных производственных штаммов выявлены аллель гена пертактина prn1 и аллели гена фимбрий fim2-1 и fim3A.
Согласно публикациям, по-прежнему продолжают циркулировать штаммы со старой клональ-ной структурой - ST1, ST2 и ST3 (схожей с кло-нальной структурой производственных штаммов), но преобладают штаммы с новой клональ-ной структурой - ST5 и ST8; последний содержал два «вакцинных» аллеля основных факторов патогенности, кроме того, все изученные штаммы B. pertussis содержали «вакцинный» аллель tcfA2. Эти данные показывают, что используемые производственные штаммы B. pertussis в большей или меньшей степени содержат в своем составе аллели основных генов вирулентности, которые соответствуют аллелям этих генов у изолятов, полученных от больных детей. Следует продолжить проведение исследований по изучению структуры генотипа циркулирующих штаммов и особенностей формирования в современных условиях постинфекционного и поствакцинального иммунного ответа - для обоснованной оценки адекватности используемых цельноклеточных и бесклеточных коклюшных вакцин как средства профилактики коклюшной инфекции.
Литература
1. Алексеева И.А., Чупринина РП. Сравнительный анализ безопасности и эффективности отечественных и зарубежных комплексных вакцин, содержащих цельноклеточную коклюшную вакцину // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2012. № 3 (64). С. 48 - 54.
2. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т. и др. Молекулярно-генетические особенности структуры гена, кодирующего фактор колонизации трахеи штаммами Bordetella pertussis // ЖМЭИ. 2010. № 5. С. 11 - 15.
3. Борисова О.Ю., Мазурова И.К, Ивашинникова Г.А и др. Генетическая характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в России // Медицинский альманах. Апрель 2012. № 2 (21). С. 30 - 34.
4. Демина А.А. Закономерности эпидемического процесса коклюша и паракоклюша в условиях массовой противококлюшной иммунопрофилактики и характеристика циркулирующих возбудителей: Автореф. дис. ... д.м.н. - М., 1970.
5. Курова Н.Н.. Молекулярно-биологическая характеристика Bordetella pertussis, циркулирующих в период подъема заболеваемости, и совершенствование лабораторной диагностики коклюша: Автореф. дис. ... к.м.н. - СПб., 2004.
6. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю. и др. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов B. pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции // Журн. мол. ген. и микробиол. 2005. № 4. С. 21 - 25.
7. Серия технических докладов. ВОЗ. 1992. № 800.
8. Borisova O.Yu., Kombarova S.J., Zakharova N.S. et al. Antigenic divergence between Bordetella pertussis clinical isolates from Moscow, Russia and vaccine strains // J. Clin. Immunol. 2007. V. 14 (3). P. 234 - 238.
9. Bouchez V., Caro V., Levillain E. et al. Genomic content of Bordetella pertussis clinical isolates circulating in areas of intensive children vaccination // PLos ONE. 2008. V. 3 (6). P. e2437. doi:10/1371/ journal.pone.0002437.
10. De Melker H.E., Schellekens J.F., Neppelenbroek S.E. et al. Reemergence of pertussis in the highly vaccinated population of the Netherlands: observations on surveillance data // Emerg. Infect. Dis. 2000. V. 6. P. 348 - 357.
11. Fry N.K., Neal S., Harrison T.G. et al. Genotypic variation in the Bordetella pertussis virulence factors pertactin and pertussis toxin in historical and recent clinical isolates in the United Kingdom // Infect. Immun. 2001. V. 69 (9). P. 5520 - 5528.
12. Hardwick T.H., Cassiday P., Weyant R.S. et al. Changes in predominance and diversity of genomic subtypes of Bordetella pertussis isolated in the United States, 1935 - 1999 // Emerg. Infect. Dis. 2002. V. 8 (1). P 44 - 49.
13. Hijnen M., Mooi F.R., van Gageldonk P.G.M. et al. Epitope structure of the Bordetella pertussis protein P69 pertactin, a major vaccine component and protective antigen // Infect. Immun. 2004. V. 72 (7). P. 3716 - 3723.
14. Kourova N., Caro V., Weber C.H. et al. Comparison of the Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis isolates circulating in Saint Peterburg between 1998 and 2000 with Russian strains // J. Clin. Microbiol. Aug. 2003. V. 41 (8). P. 3706 - 3711.
15. Lacey B.W. Antigenic modulation on Bordetella pertussis // J. Hyg. (Camb.). 1960. V. 58. P 57 - 93.
16. Mastrantonio P, Spigaglia P, van Oirschot H. Antigenic variants in Bordetella pertussis strains isolated from vaccinated and unvaccinated children // Microbiology. 1999. V. 145. P 2069 - 2075.
17. Mattoo S., Miller J.F., Cotter PA. Role of Bordetella bronchiseptica fimbriae in tracheal colonization and development of a humoral immune response // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 2024 - 2033.
18. Medical Reseach Council. Vaccination against whooping-cough: Final report // Brit. Med. J. 1959. V. 1. Р. 994 - 1000.
19. Mooi F.R., Hallander H., von Konig C.H.W. et al. Epidemiological typing of Bordetella pertussis isolates: recommendations for a standard methodology // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2000. V. 19. P 174 - 181.
20. Mooi F.R., van Loo I.H., King J. Adaptation of Bordetella pertussis to vaccination: a cause for its reemergence? // Emerg. Infect. Dis. 2001. V. 7 (Suppl. 3). P. 526 - 528.
21. Novotny P., Cownley K. Effect of growth, conditions on the composition and stability of the outer membrane of Bordetella pertussis / Intern. Symp. on Pertussis / C.R. Manclark and J.C. Hill, eds. - 1979. Р 99 - 123. US DHEW Publication no (NIH) 79-1830. Washington, D.C.
22. Parton R., Wardlaw A.C. Cell-envelope proteins of Bordetella pertussis // J. Med. Microbiol. 1975. V. 8. Р. 47 - 57.
23. Preston N.W. Type-specific immunity against whooping-cough // Brit. Med. J. 1963. V. 2. Р. 724 - 726.
24. Preston N.W. The importance of the different serotypes of B. pertussis on the effectiveness of pertussis vaccines. / PAHO/WHO. Intern. conference on the application of vaccines against viral, rickettsial and bacterial diseases of man. - Washington D.C. Dec. 1970. Р. 371, 372.
25. Preston N.W., Carter E.J. Serotype specificity of vaccine-induced immunity to pertussis. / Commun. Dis. Rep. CDR Rev. 1992. V. 2. P. R 155 - R156.
26. Preston N.W., Parkhill J., Maskell D.J. The bordetellae lessons from genomics // Nat. Rev. Microbiol. 2004. V. 2. P. 379 - 390.
27. Van Loo I.H.M., van der Heide G.J., Nagelkerke N.J.D. et al. Temporal trends in the population structure of Bordetella pertussis during 1949 - 1996 in a highly vaccinated population // J. Infect. Dis. 1999. V. 179. P. 915 - 923.
28. Van Rie A., Hethcote H.W. Adolescent and adult pertussis vaccination: computer simulations of five new strategies // Vaccine. 2004. V. 22. P. 3154 - 3165.
29. Wardlaw B.C., Parton R., Hooker M.J. Loss of protective antigen, histamine-sensitizing factor and envelope polypeptides in cultural variants of Bordetella pertussis // J. Med. Microbiol. 1976. V. 9. P 89 - 100.
30. Weber C., Boursaux-Eude C., Coralie G. et al. Polymorphism of Bordetella pertussis isolates circulating for the last 10 years in France, where a single effective whole-cell vaccine has been used for more than 30 years // J. Clin. Microbiol. 2001. P. 4396 - 4403.
31. Zhang L., Xu Y., Zhao J. et al. Effect of vaccination on Bordetella pertussis strains, China // Emerg. Infect. Dis. 2010. V. 16 (11). P. 1695 - 1701.
32. http://www.who.int/immunization/sage/meetings/2012/-November/en/index.html.
Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма А(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59 - донора для живых гриппозных вакцин
А.В. Терехов (tor4911@yandex.ru), Т.М. Цфасман (tanya.tsfasman@gmail.com), С.Г. Маркушин (s.g.markushin@rambler.ru), И.Б. Коптяева, К.В. Лисовская, Н.В. Кост
ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва (instmech@iitp.ru)
Резюме
Исследовали ts- и са-фенотипы одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью методов обратной генетики между холодоадаптированным (ХА) вакцинным штаммом А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 вируса гриппа и вирулентным штаммом вируса гриппа A(H1N1)/WSN/33. Показано, что полученные реассортанты различались по своему ts-фенотипу. В этой связи появляется возможность распределения их в несколько групп. В группу I попадают реассортанты, не отличающиеся по своему ts-фенотипу от вирулентного штамма. В группу II можно включить реассортанты, по своему ts-фенотипу тождественные ХА-вакцинному штамму. В группу III попадают реассортанты с промежуточными характеристиками. Анализ одногенных и полигенных реассортантов позволяет сделать вывод, что РВ1-ген и NS-ген ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 содержат ключевые детерминанты, определяющие ts-фенотип данного вакцинного штамма. Полученные данные также позволяют выдвинуть предположение о том, что для активного размножения ХА-штамма при 25 0С (са-фенотип) необходимо, по-видимому, участие большей части, если не всей совокупности, мутантных вирусных белков.
Ключевые слова: вирус гриппа типа А, одногенные и полигенные реассортанты, ts-фенотип, са-фенотип, обратная генетика
Genetic Basis of Attenuation of Cold-Adapted Strain A(N2N2)/Krasnodar/101/35/59 - Donor for Living Influenza Vaccines
АМ. Terekhov (tor4911@yandex.ru), Т.М. Tsfasman (tanya.tsfasman@gmail.com), S.G. Маrkushin (s.g.markushin@rambler.ru), I.B. Коptayeva, K.V. Lisovskaya, N.V. Коst
Federal State Budgetary Institution «I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera» of Russian Academy of Medical Sciences,
Moscow (instmech@iitp.ru)
Abstract
We have investigated the ts- and ca-phenotypes of single- and polygenic reassortants between the cold-adapted (CA) vaccine A(H2N2)/Krasnodar/101/35/59 strain and the virulent A(H1N1)/WSN/33 strain, obtained with the help of plasmids technology. It was shown, that the ts-phenotype of reassortants was different. This permits us to assign these reassortants to several groups. Group I contains viruses which exhibited wild type traits. Group II is composed of reassortants, which displayed the ts-phenotype. Group III consists of reassortants with intermediated characteristics of ts-phenotype.
The analysis of single- and polygenic reassortants allowed us to make the conclusion that PBl-gene and NS-gene of the СА A(H2N2)/ Krasnodar/101/35/59 contain crucial determinants, responsible for the ts-phenotype of this vaccine strain. The data obtained allow us to make a suggestion, that the combination of all the mutant virus-specific proteins is responsible for active reproduction of cold-adapted vaccine strain at 25 0C (ca-phenotype).
Key words: influenza virus A, single- and polygenic reassortants, ts-phenotype, ca-phenotype, reverse genetics
Введение
Создание живых гриппозных вакцин связано с разработкой холодоадаптированных (ХА) штам-
мов - доноров аттенуации А(Н2N2)/Энн Арбор /6/60 и А(Н2N2)/Ленинград/134/17/57 [5, 9, 11]. Аттенуационный фенотип этих штаммов обусловлен
