CC BY
124
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ BORDETELLA PERTUSSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ КОКЛЮШЕМ В РОССИИ
О.Ю. Борисова1, И.К. Мазурова1, Г.А. Ивашинникова1, Н.Т. Гадуа1, И.А. Рудакова1, Н.Я. Салова3,
Ф.М. Абасова3, И.П. Требунских3, Н.Д. Наретя4, Л.А. Алексеева5, О.Ю. Якунина6, F. Mooi2, В.А. Алёшкин1,
1ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского»,
Netherlands centre for infectious diseases control, National institute for public health and the environment, Bilthoven, Netherlands,
3ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», 4ТО Управление Роспотребнадзора по Московской области в гг. Дзержинск, Лыткарино, Люберецкого района, 5ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии во Владимирской области», г. Владимир, 6ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области», г. Новосибирск
Борисова Ольга Юрьевна - e-mail: [email protected]
С помощью метода мультилокусного секвенирования, основанного на комбинации аллелей ptxA, ptxC и tcfA генов, проведено генотипирование 149 штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в течение 1948-2010 гг. в различных регионах России. Показано, что в течение
50-летнего проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной в популяции штаммов возбудителя коклюша происходят существенные изменения ее клонального состава. Формирование популяции идет по пути появления штаммов, принадлежащих к новому «клональному комплексу» ST5-ST8.
Ключевые слова: Bordetella pertussis, секвенирование, ген, мультилокусное секвенирование.
By means of a method multilocus sequence typing (MLST), based on a combination alleles of ptxA, ptxC и tcfA genes, it is spent genotyping of 149 Bpertussis strains isolated from patients in 1948 - 2010 in various regions of Russia. It is shown that during 50-year-old carrying out of mass immunization of the
children's population by the DTP-vaccine in population of B.pertussis strains there are its essential changes clonal structure. Population formation goes by the way of occurrence strains, belonging to new clonal structure ST5-ST8.
Key words: Bordetella pertussis, sequencing, gene, multilocus sequence typing.
Введение
Коклюш является воздушно-капельной инфекцией, управляемой средствами специфической вакцинопрофилактики, которая впервые в мире введена в 1920-х годах прошлого столетия и привела к резкому снижению заболеваемости и летальности. Вместе с тем, коклюш до сих пор является одной из десяти причин летальности у детей младенческого возраста и занимает пятое место в детской смертности, вызванной вакциноуправляемыми инфекциями. Во многих странах Европы и Америки с высоким уровнем охвата профилактическими прививками с 1990-х годов отмечается рост заболеваемости коклюшем, который стал наиболее рапро-страненным среди вакциноуправляемых инфекций (www.who.int/ru). В России массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной введена в 50-е годы прошлого века и коренным образом изменила характер течения эпи-
демического процесса коклюшной инфекции и привела к значительному улучшению эпидемиологической обстановки. Однако, несмотря на несомненные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения, до настоящего времени регистрируются периодические подъемы заболеваемости как за счет непривитых, так и привитых детей, высокая заболеваемость детей раннего возраста и увеличение заболеваемости детей школьного возраста [1-5]. Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции возбудителя среди населения, и, следовательно, существует риск возникновения заболеваний.
Многочисленные исследования, проводимые как отечественными, так и зарубежными исследователями в более чем 15 странах мира на 4 континентах, показали, что возбудитель коклюша подвержен генетической вариабельности, затрагивающей, в первую очередь, основные детерминанты
патогенности возбудителя [6-18]. К настоящему времени штаммовый SN-полиморфизм (SNP) B. pertussis описан в 16 генах, кодирующих поверхностные белки, из которых наиболее выраженные изменения обнаружены в шести генах -ptxA, ptxC, prn, fim2, fim3 и tcfA. Нашими предыдущими исследованиями [1, 6, 9, 19, 20] проанализирована динамика циркуляции штаммов B. pertussis с различными аллельными вариантами генов, кодирующими основные факторы патогенности. Было установлено, что штаммы с новыми «невакцинными» аллелями ptxA, prn, fim2 и fim3 генов постепенно вытесняют штаммы со старыми «вакцинными» аллелями этих генов.
В последние годы одним из перспективных методов гено-типирования штаммов B. perussis, позволяющим выявлять генетические различия и оценивать клональный состав циркулирующей популяции возбудителя, является метод муль-тилокусного секвенирования (МЛСТ) [16-18]. Поэтому, целью данного исследования явилось изучение клонального состава популяции штаммов B. pertussis, циркулирующих в России в 1948-2010 гг., с помощью МЛСТ.
Материалы и методы
Штаммы. В работе изучено 149 штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в различных регионах России (г. Москва, Московская, Владимирская и Новосибирская области), из них 97 штаммов B. pertussis выделены в 20002010 гг., и 52 штамма, выделенных в 1948-1999 гг., из коллекции ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора». Для проведения анализа динамики изменения клонального состава циркулирующей популяции штаммов B. pertussis все изученные штаммы были разделены по годам (1948-59 гг., 1960-69 гг., 1970-79 гг., 1980-99 гг. и 2000-2010 гг.). В исследование также включены три вакцинных штамма, используемых в настоящее время для производства АКДС-вакцины в нашей стране (из коллекции ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора). Микробиологическое исследование штаммов B. pertussis осуществляли согласно [21]: исследуемый материал засевали на среду Борде-Жангу («Pronadisa», Испания) с добавлением 10% крови КРС с последующим изучением морфологических, культуральных и серологических свойств штаммов. Генотипирование штаммов проводили в соответствии с общепринятой схемой МЛСТ для B. pertussis, на основе секвенирования фрагментов ptxA (кодирующего S1 субъединицу гена коклюшного токсина), ptxC (кодирующего S3 субъединицу гена коклюшного токсина) и tcfA генов (кодирующего фактор колонизации трахеи), также была изучена структура prn гена, кодирующего синтез белка пертактина, отвечающего за адгезию возбудителя к поверхности чувствительного эпителия. В работе использовали протоколы выделения ДНК, проведения ПЦР и секвенирования, опубликованные van Loo I.H.M. [18]. Идентификацию аллелей и сиквенс-типов осуществляли согласно международной базе данных EMBL/ GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez): ptxA1
(AJ245366), ptxA2 (AJ245367), ptxA4 (AJ245368); ptxC1 (М13223), ptxC2 (AJ420987), tcfA2 (AJ009785), prn1 (AJ011091), prn2 (AJ011092), prn3 (AJ011093), prn9 (AJ315611.1). Анализ результатов МЛСТ проводили с помощью программного обеспечения MEGA 5.0 с построением дендрограмм методом UPGMA и Neighbor-Joining на основе последовательностей фрагментов аллельных вариантов ptxA, ptxC, tcfA генов.
Результаты и их обсуждение
Для оценки клонального состава циркулирующей популяции штаммов B. pertussis проведено секвенирование фрагментов четырех генов - ptxA и ptxC (кодирующих S1 и S3 субъединицы гена коклюшного токсина (КТ), tcfA (кодирующего фактор колонизации трахеи) и prn (кодирующего белок адгезии возбудителя - пертактин) генов. Среди изученных штаммов B. pertussis при секвенировании ptxA гена выявлено три варианта последовательности нуклеотидов, которые соответствовали в базе данных генотипов EMBL/ GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) одному из трех аллелей этого гена: ptxA1, ptxA2 или ptxA4 аллелю; два варианта последовательности нуклеотидов ptxС гена - ptxC1 или ptxC2 аллелю; четыре варианта последовательности нуклеотидов prn гена - prn1, prn2, prn3 или prn9 аллелю; один вариант последовательности нуклеотидов tcfA гена -tcfA2 аллелю гена.
На основании полученных при секвенировании результатов проведена идентификация аллельного профиля и определение сиквенс-типа (ST) каждого штамма. Всего среди изученных штаммов B. pertussis идентифицировано пять сиквенс-типов - S7I, SТ2, Sy3, Sy5 и ST8, из которых, согласно [18], S71 соответствовал ptxA4, ptxC1, tcfA2 аллельный профиль, SТ2 - ptxA2, ptxC1, tcfA2 профиль, SТ3 - ptxA1, ptxC1, tcfA2 профиль, SТ5 - ptxA1, ptxC2, tcfA2 профиль и ST8 - ptxA2, ptxC2, tcfA2 профиль.
Для штаммов B. pertussis, выделенных в 1948-59 гг., характерными были аллельные профили, определяющие два сиквенс-типа - ST1 и ST2 (рис. 1). Из них 66,6% штаммов имели ST1 и 33,4% - ST2 типы. Такие же аллельные профили несут штаммы B. pertussis, используемые в настоящее время для производства АКДС-вакцины: один штамм - SP1 и два штамма - ST2. Следует отметить, что аллельные профили, определяющие ST1 и ST2, согласно международной базе данных генотипов EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez), состоят из старых «вакцинных» аллелей ptxA, ptxC, tcfA генов.
Среди изученных штаммов B. pertussis, выделенных в 1960-69 гг., 20,0% штаммов имели ST3, 40,0% - ST2 и 40,0% - ST1, т. е. отмечается относительное увеличение доли штаммов ST2, уменьшение удельного веса штаммов ST1 и в циркулирующей популяции появились штаммы с новым сиквенс-типом - ST3, аллельный профиль которого определяется одной новой «невакцинной» аллелью ptxA гена и старыми «вакцинными» аллелями ptxC и tcfA генов. В последующие годы отмечается аналогичная ситуация - 26,7% штаммов B. pertussis относились к ST3 и регистрировали колебание удельного веса штаммов ST1 и ST2 (53,3% и 20,0%, соответственно). Следовательно, можно говорить, что в 196070-е годы, т. е. через 10-20 лет проведения массовой иммунизации, отмечается начало перестройки циркулирующей популяции, которая заключается в появлении штаммов B. pertussis с новой клональной структурой, которые в последующие годы заняли доминирующее положении.
Так, среди штаммов, выделенных в 1980-90-е годы, уже 95,3% штаммов несли ST3. Вместе с тем, стали регистрировать (в 4,7% случаях) штаммы с другим новым сиквенс-типом - ST5, аллельный профиль которого определяется двумя новыми «невакцинными» аллелями ptxA и ptxC генов и старым «вакцинным» аллелем tcfA гена, т. е. можно сказать,
что в эти годы продолжается перестройка циркулирующем популяции, которая идет по пути появления штаммов с новой клональной структурой, отличающейся от структуры штаммов, выделенных в допрививочный период. Среди 97 изученных штаммов B. pertussis, выделенных в 2000-2010 гг., зарегистрированы штаммы пяти сиквенс-типов - ST1, ST2, ST3, ST5 и ST8. Из них 83 (85,5%) штамма характеризовались ST5, 9 (9,3%) штаммов - ST3, 3 (3,0%) штамма - ST2, один (1,1%) штамм - ST1 и один (1,1%) штамм - ST8 (рис. 1). Следовательно, в последние десять лет циркулирующая популяция штаммов B. pertussis в основном представлена штаммами с новой клональной структурой - ST5. Следует отметить, что удельный вес штаммов ST5 стал постепенно увеличиваться с 2000 г. Так, если в 2000-2003 гг. были выделены только единичные штаммы ST5, то в 2010 г. уже 87,0% штаммов относились к этому сиквенс-типу. По-прежнему продолжают циркулировать штаммы ST3, штаммы со старой клональной структурой - ST1-ST2 и появились штаммы с другой новой клональной структурой - ST8, аллельный профиль которого представлен двумя «вакцинными» ptxA и tcfA аллелями и одним «невакцинным» ptxC аллелем.
В настоящем исследовании проведено сопоставление структуры prn гена, кодирующего пертактин, и сиквенс типа циркулирующих штаммов. Пертактин относится к генетически контролируемой системе адгезинов, принимает участие в прикреплении микробов к чувствительным клеткам и инвазии их в клетки хозяина, включая реснитчатый эпителий и альвеолярные макрофаги. Известно, что структура prn гена, кодирующего пертактин, подвержена наибольшей вариабельности. Описано тринадцать аллелей prn гена (prn1-13), которые отличаются по наличию 5 немолчащих и 4 молчащих мутаций в девяти областях гена с наибольшими различиями в 1 и 2 областях гена с повторяющимися кодируемыми последовательностями - GGXXPn (область 1 -положения 796 - 891) и PQPn (область 2 - положения 1744 - 1788). Изменения в структуре prn гена обнаружены во всех странах мира и совпали с изменениями по времени появления с подъемом заболеваемости коклюшем в них [10Ц18].
Все штаммы B. pertussis, относящиеся к ST1 и ST2, независимо от периода выделения, несли старый «вакцинный» prn1 аллель гена. Однако, среди штаммов, относящихся к сиквенс-типу ST3, впервые в 1970-е годы зарегистрировали один штамм с новым «невакцинным» prn3 аллелем гена, удельный вес которых в последующие годы стал увеличиваться. «Невакцинный» prn3 аллель, согласно EMBL/GenBank, отличается от «вакцинного» prn1 аллеля «немолчащей» мутацией в положениях 832 - 834, приводящей к контрастной замене аминокислоты аланина на фенилаланин (A278F), относящихся к разным классам аминокислот, а также «немолчащей» мутацией в положении 836 с заменой аминокислоты валин на глицин (V279G), которые принадлежат к одному классу аминокислот, но имеют разные свойства. Для штаммов B. pertussis, выделенных в 1980-90-е годы и принадлежащих к ST3, уже 42,8% штаммов несли prn3 аллель и 7,1% штаммов несли также новый «невакцинный» prn2 аллель, нуклеотидная последовательность которого соответствует последовательности prn3 аллеля, но несет одну дополнительную повторяющуюся последовательность в 15 п.н., удлиняющую ген и, следовательно, белок пертактин (Prn). Среди
штаммов ST5 этого же периода появились единичные штаммы prn3 аллеля гена. Для штаммов, выделенных в последнее
десятилетие,отмечаетсяаналогичнаятенденция.Практически все штаммы ST3 и ST5 имели одинаковую структуру этого гена - новый «невакцинный» prn2 аллель, за исключением одного штамма B. perussis ST5, несущего также новый «невакцинный» prn9 аллель гена и выделенного от мамы ребенка больного коклюшем и прибывшей из другого региона. Данный prn9 аллель, согласно международной базе генотипов, является «невакцинным» аллелем этого гена и имеет последовательность нуклеотидов подобную prn2 аллелю, но несет еще одну дополнительную повторяющуюся последовательность в 15 п.н., т. е. дополнительный в 30 п.н. фрагмент гена, и, следовательно, более удлиненный Prn белок. Согласно EMBL/GenBank все изменения, произошедшие в 1 и 2 областях prn гена с повторяющимися кодируемыми 100%
90%
2Q0% — 4,7%
33,4% 26,7%
■ 40% 20%
953%
66,6Р/о 1
40% 533%
и и и
1,1%
^ff/oBST-8 □ ST-5
— □ ST-3
— □ ST-2 ■ ST-1
3,0%
- 1.1%
1948-59 1960-69 1970-79 1980-99 2000-2010
РИС. 1.
Удельный вес сиквенс-типов штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в 1948-2010 гг.
Б
РИС. 2.
Филогенетическое дерево, построенное методом иРвМЛ, с использованием последовательностей фрагментов аллельных вариантов рЬхЛ, рЬхС, Ьс/Л генов.
последовательностями - GGXXPn и PQPn, являются иммуно-генными и участвуют в формировании В-клеточного иммунного ответа, т. е. иницирируют выработку протективных антител. Эти повторяющиеся области сближены в полипеп-тидной цепи и формируют единый конформационный эпитоп, который отражает действие протективных антител. Следовательно, все штаммы B. pertussis ST5 и ST8 имеют и новую структуру prn гена, детерминирующего основной фактор адгезии возбудителя на поверхности чувствительного эпителия.
Полученные результаты позволили провести филогенетический анализ данных с определением генетического расстояния между штаммами B. pertussis различных сиквенс-типов на основании отличий в их аллельных профилях (рис. 2А). Видно, что циркулирующие штаммы разделились на два «клональных комплекса», включающих в себя группу чрезвычайно близкородственных штаммов, - один комплекс объединил штаммы ST1-ST2-ST3 другой - штаммы ST5-ST8. Следовательно, анализируя динамику распространения штаммов B. pertussis различных сиквенс, можно отметить, что клональный состав циркулирующей популяции изменяется - в допрививочный период преимущественное распространение имели штаммы «клонального комплекса» ST1-ST2, в 1960-70-е годы в популяции продолжали циркулировать штаммы комплекса ST1-ST2, удельный вес которых в последующие годы снижается. Вместе с тем, уже в 1960-70-е годы появились штаммы нового сиквенс-типа - ST3, принадлежащего к тому же «клональному комплексу», но, как было показано выше, имеющего другой аллельный профиль. Такие штаммы в 1980-90-е годы заняли доминирующее положение в популяции, но в этот же период появились штаммы B. pertussis, относящиеся к новому «клональному комплексу» - сиквенс типа ST5. В последние 10 лет продолжается перестройка популяции - увеличился удельный вес штаммов ST5 и появились штаммы ST8, которые также относятся к новому «клональному комплексу» ST5-ST8 и по структуре prn гена, отвечающего за адгезию возбудителя коклюша, принадлежат к новым «невакцинным» prn2, prn3 и prn9 аллелям этого гена. Филогенетический анализ с построением дендрограммы с помощью программного обеспечения Neighbor-Joining (рис. 2Б) подтверждает полученные данные и демонстрирует динамику формирования популяции и показывает, что наиболее ранее в эволюционном отношении происхождение имеет ST1, далее последовательно появились штаммы ST2 и ST3. Наиболее позднее происхождение имеет клональный комплекс ST5-ST8.
При сопоставлении структуры штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем В России в последние десять лет, со структурой штаммов, используемых для АКДС-вакцины, установлено, что современные штаммы отличаются от вакцинных штаммов - два производственных штамма относятся к ST2 и один - к ST1, которые, как показано выше, встречаются среди циркулирующих штаммов только в 3,0% и 1,1% случаев, соответственно, в то время как преобладают штаммы ST5 и появились штаммы ST8, принадлежащих к другому «клональному комплексу» ST5-ST8.
При сравнении полученных данных с результатами типи-рования штаммов в различных странах мира можно отметить, что изменения, происходящие в клональном составе популяции штаммов B. pertussis, выделенных в России, про-
исходят аналогично популяциям штаммов в других странах мира [10, 11, 13-18]. Всего в мире описано одиннадцать сиквенс-типов ST1-ST11. Так, в допрививочный период преимущественно были распространены штаммы «клонального комплекса» ST1-ST2, далее отмечалось постепенное уменьшение удельного веса этих штаммов и увеличение доли штаммов ST3, которые получили преимущественное распространение в 1960-80-е годы. Начиная с 1980-х годов в циркуляции стали регистрировать штаммы других сиквенс-типов - ST4, ST5, ST6, ST7, ST8, ST9, ST10 и ST11, удельный вес которых варьирует в различных странах мира. В последнее десятилетие преимущественно распространены штаммы ST3, ST4 и ST5, однако, в единичном проценте случаев сохраняются штаммы ST1-ST2, которые до сих пор используются для производства цельноклеточных вакцин.
Заключение
Таким образом, проведенные исследования показали, что в течение 50-летнего проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной в популяции штаммов возбудителя коклюша происходят существенные изменения ее клонального состава. Формирование популяции идет по пути появления штаммов, принадлежащих к новым «клональным комплексам», которые постепенно вытесняют штаммы со старым «клональным комплексом». Учитывая многочисленные данные зарубежных исследователей [13, 15-18], можно предположить, что клональная перестройка циркулирующей популяции штаммов B. pertussis будет продолжаться с появлением новых штаммов, что свидетельствует о микро-эволюционных изменениях, способствующих расширению адаптационных возможностей возбудителя и приспособлению его к меняющимся условиям существования.
ЛИТЕРАТУРА [S3
1. Борисова О.Ю., Петрова М.С., Мазурова И.К., Лыткина И.Н., Попова О.П., Гадуа Н.Т., Мерцалова Н.У., Захарова Н.С., Пяева А.П., Салова Н.Я., Требунских И.П., Комбарова С.Ю, Шинкарев А.С., Скачкова В.Г., Савинкова В.С., Алёшкин В.А. Особенности коклюшной инфекции в различные периоды эпидемического процесса в г. Москве. Журн. эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010. № 4. С. 33-39.
2. Герасимова А.Г., Петрова М.С., Тихонова Н.Т. Клиникоэпидемиологическая характеристика современного коклюша. Новости вакци-нопрофилактики. Вакцинация. 2004. № 5. С. 4-5.
3. Петрова М.С., Сигаева Л.А., Попова О.П. и др. Особенности эпидемиологии и клиники коклюша в период эпидемического неблагополучия. В сборн. научн.трудов «Проблемы инфекционных болезней». 2000. № 1. С. 80-86.
4. Попова О.П., Петрова М.С., Чистякова Г.Г. и др. Клиника коклюша и серологические варианты коклюшного микроба в современных условиях. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. № 1. С. 44-46.
5.Селезнева Т.С., Титова Н.С., Заргарьянц А.И., Максимова Н.М., Маркина С.С. Влияние вакцинопрофилактики на эпидемический процесс управляемых инфекций в Российской Федерации. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. № 2. С. 6-11.
6.Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю. и др. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве (1948-2005 гг.). Журнал молекулярной медицины. 2008. № 1. С. 40-45.
7. Семенов Б.Ф., Захарова Н.С., Мазурова И.К. Подъем заболеваемости коклюшем на фоне массовой вакцинации. Гипотезы, объясняющие этот феномен. Журн. микробиол. 2003. № 6. С. 70-73.
8. Шинкарев А.С, Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Захарова Н.С., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Поддубиков А.В., Брицина М.В., Бажанова И.Г. Современные штаммы Bordetella pertussis: молекулярная и иммунобиологическая характеристика. Журн. микробиол. 2007. № 4. С.20-25.
9. Borisova O., Kombarova S.Y., Zakharova N.S. et all. Antigenic divergence between B.pertussis clinical isolates from Moscow, Russia, and vaccine strains. J. Clin. And Vaccine Immunology. 2007. № 14 (28). P. 234-238.
10. Brinig M.M., Cummings C.A., Sanden G. Net allio Significant gene order and expression differences in B. pertussis despite limited gene content variation. J. of Bacteriology. 2006. № 188 (7). P. 2375-2382.
11. Cassiday, P., G. Sanden, K. Heuvelman, F. Mooi, K. M. Bisgard and Popovic T. Polymorphism in Bordetella pertussis pertactin and pertussis toxin virulence factors in the United States, 1935-1999. J. Infect. Dis. 2000. № 182. P. 1402-1408.
12. Kourova N., Njamkepo E, Brun D. et all. Monitoring of Bordetella isolates circulating in Saint Petersburg, Russia between 2001 and 2009. Res. Microbiol. 2010. № 161 (10). P. 810-815.
13. Litt D.J., Neal S.E. and Fry N.K. Changes in Genetic Diversity of the Bordetella parapertussis Population in the United Kingdom between 1920 and 2006 Reflect Vaccination Coverage and Emergence of a Single Dominant Clonal Type. J. Clin. Microbiol. 2009. № 47 (3). P. 680-688.
14. Mastrantonio, P., Spigaglia H., van Oirschot et all. Antigenic variants in Bordetella pertussis strains isolated from vaccinated and unvaccinated children. Microbiology.1999. № 145. P. 2069-2075.
15. Mooi F.R.. Bordetella pertussis and vaccination: The persistence of a genetically monomorphic pathogen. J. Infection, genetics and evolution. 2009. № 2. P. 1-14.
Їб. Packard, E. R., Parton R., Coote J. et all. Sequence variation and conservation in virulence-related genes of Bordetella pertussis isolates from the UK. J. Med. Microbiol. 2QQ4. № S3. Р. 3SS-36S.
Ї7. van Amersfoorth, S. C. M., Schouls, L. M., van der Heide et all. Analysis of Bordetella pertussis Populations in European Countries with Different Vaccination Policies. J. Clin. Microbiol. 2QQS. № 43. Р. 2837-2843.
Ї8. van Loo, I. H. M, Heuvelman, C. J., King et all. Multilocus sequence typing of Bordetella pertussis based on surface protein genes. J. Clin Microbiol. 2QQ2. № 4Q. Р. 1994-2QQ1.
Ї9. Борисова О.Ю., Мазурова ИХ., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Aлешкин ВА Молекулярно-генетические особенности структуры гена, кодирующего фактор колонизации трахеи штаммов B.pertussis. Журн. микро-биол. 2Q1Q. № S. С. 11 -1S.
20. Мазурова ИХ., Борисова О.Ю., Юомбарова С.Ю. и др. Молекулярногенетическая характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции. Журн. молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2QQS. № 4. С. 21-2S.
2Ї. Министерство здравоохранения СССР. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше.1984.
