CC BY
196
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.84:579.252.55].083.1:577.21.08
А. В. Попова, В. П. Мякинина, М. Е. Платонов, Н. В. Воложанцев
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ ЛСтЕТОБЛСТЕЯ БЛиМЛММ1 И ОЦЕНКА ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К БАКТЕРИОФАГУ АР22
ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск
Проведен молекулярно-генетический анализ 130 антибиотикоу-стойчивых штаммов А. baumannii, выделенных из клинического материала от больных, госпитализированных в стационары различного профиля крупных городов России (Челябинск, Москва, Нижний Новгород, Санкт-Петербург) в 2005—2010 гг. Штаммы идентифицированы с помощью метода оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов амплификации гена 16Б рРНК, а также с помощью ПЦР на видоспецифические для А. baumannii гены Р-лактамаз ОХА-51 и родственных ферментов и генетически типированы методом ПЦР с универсальными праймерами. При анализе дендрограммы, построенной по результатам генотипирования штаммов, выявлено 2 кластера, каждый из которых включает по одной из двух доминирующих РАРБ-групп (А1 и В1), объединяющих в целом 82% (107 из 130) клинических нозокомиальных штаммов A. baumannii. При определении чувствительности штаммов А. baumannii к бактериофагу АР22 показано, что бактериофаг специфически инфицирует и лизирует 69% из 130 исследуемых штаммов, проявляя более выраженную литическую активность по отношению к представителям указанных выше доминантных РАРБ-групп. Способность бактериофага АР22 специфически инфицировать широкий круг штаммов A. baumannii, циркулирующих в стационарах лечебных учреждений, позволяет рассматривать его в качестве потенциального компонента для создания лечебного препарата и использовать для идентификации Л. baumannii при бактериологическом анализе клинического материала. Ключевые слова: ЛЫпе1оЬас1ег Ьаитаппп, видовая идентификация, генотипирование, бактериофаг
ЛствШЬа^вг Ьаитаппп является одним из наиболее значимых возбудителей внутрибольничных инфекций среди неферментирующих грамотрицательных аэробных микроорганизмов. В отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), а также в ожоговых отделениях Л. Ьаитаппп часто выделяется от больных с госпитальной пневмонией, раневыми инфекциями (в том числе от больных с термическими поражениями), катетерассоциированными урологическими инфекциями, осложнениями после хирургических вмешательств, сепсисом [13, 15]. Высокий уровень и широкий спектр природной и приобретенной устойчивости Л. Ьаитаппп к антимикробным препаратам разных функциональных классов в настоящее время отмечаются во всем мире [1, 12]. Другими клинически значимыми особенностями данного микроорганизма являются: устойчивость к дезинфицирующим средствам, высушиванию, ультрафиолетовому облучению, толерантность к детергентам [18, 19]. Высокая выживаемость на объектах внешней среды и способность пер-систировать в течение продолжительного периода в условиях больничного окружения [7] увеличивают риск передачи этого микроба через медицинский персонал и предметы обихода. На фоне интенсивного использования антибиотиков широкого спектра действия это приводит к быстрому распространению Л. Ьаитаппп в стационарах лечебных учреждений, особенно в ОРИТ.
В связи с этим чрезвычайно актуальны своевременное выявление Л. Ьаитаппп в стационарах лечебных учреждений, быстрая идентификация данного микроорганизма и, что не менее важно, разработка
новых антибактериальных средств против инфекций A. baumannii. Одним из возможных путей решения последней проблемы может быть применение лити-ческих фагов.
За последние 2 года было опубликовано несколько статей, характеризующих фаги, специфически инфицирующие клинические штаммы A. baumannii [10, 11, 22]. При этом в отечественной литературе нет ни одной публикации, посвящённой характеристике фагов, активных в отношении данного микроорганизма. Кроме того, необходимо отметить, что в настоящее время не существует коммерческих препаратов бактериофагов для контроля внутрибольничных инфекций, вызванных A. baumannii, что в первую очередь связано с отсутствием коллекций перспективных фагов, которые могли бы быть использованы для их разработки.
Целью настоящей работы явилась молекулярно-ге-нетическая характеристика антибиотикоустойчивых штаммов A. baumannii, выделенных от больных, госпитализированных в стационары различного профиля крупных городов России (Челябинск, Москва, Нижний Новгород, Санкт-Петербург) в 2005—2010 гг., и оценка их чувствительности к бактериофагу AP22.
Материалы и методы
Штаммы бактерий. В работе использовали антибиоти-корезистентные штаммы А. baumannii, выделенные из клинического материала (раневое отделяемое, тканевые биоптаты, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, моча, желчь, кровь, содержимое дренажей, внутривенных катетеров) в бактериологических лабораториях стационаров различного профиля Челябинска, Москвы, Нижнего Новгорода, Санкт-Петербурга; бактерии других геномовидов Acinetobacter: A. genomospecies 3, A. genomospecies 10, A. johnsonii, A. shindleri, A. lwoffii, A. anitratus, A. calcoaceticus, а также бактерии других родов и семейств: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Pasteurella multocida, Salmonella еnteritidis.
Для роста бактериальных культур использовали Luria— Bertani (LB) бульон и Nutrient-агар ("Himedia Laboratories Pvt. Limited", Индия).
Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК бактерий для использования в качестве матрицы в реакции амплификации получали следующим образом. 0,5 мл ночной культуры, выращенной в LB-бульоне, переносили в 1,7 мл пробирку, центрифугировали 5 мин при 5000 g. Супернатант удаляли, клетки промывали физиологическим раствором, осадок ресуспензировали в 180 мкл TE-буфера (10 мМ трис-НС1 pH 7,5, 1 мМ ЭДТА pH 8,0) с дополнительным содержанием 5—10 мМ ЭДТА, добавляли 20 мкл раствора лизоцима (10 мг/мл), РНКазу свободную от ДНКазы до конечной концентрации 20 мкг/мл и инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С. Затем добавляли 400 мкл лизирующего буфера на основе изотиоцианата гуанидина и инкубировали 15—30 мин при 56°С. К полученной смеси добавляли 500 мкл раствора хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), перемешивали и разделяли фазы центрифугированием в течение 5 мин при 20 000 g. Экстракцию проводили несколько
раз. Осторожно отбирали верхнюю (водную) фазу и переносили в новую пробирку. В супернатант вносили 700 мкл изопро-панола. Центрифугировали 5 мин при 20 000 g, осадок дважды промывали 70% этиловым спиртом и однократно 96% этиловым спиртом, высушивали, растворяли в 200 мкл деионизованной воды или TE-буфера и хранили в замороженном состоянии при -20 С. Количество и качество выделенной ДНК контролировали посредством электрофореза в 0,5% агарозном геле и спектрофо-тометрически.
Идентификация штаммов. Видовую идентификацию штаммов А. baumannii осуществляли методом оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ) гена 16S рРНК с помощью праймеров: SP2-16S (5'-GATCATGGCTCAGATTGAACGC-3') и ASP2-16S (5'-GCT ACCTTGTTACGACTTCACCC-3'), разработанных на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК A. baumannii, депонированных в GenBank (CP000863.1, CP000521.1, CP001172.1, CU459141.1 и CP001182.1), и эндонуклеазы рестрикции A/uI.
Реакционная смесь для ПЦР объемом 30 мкл содержала 10 мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25°C), 50 мМ KCl, 0,08% Nonidet P40, 1,5 мМ KCl; 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров, 150 мкМ каждого дНТФ, 1 ед. Taq -ДНК-полимеразы и 10-50 нг матричной бактериальной ДНК. Реакцию амплификации проводили в следующем режиме: 95°С — 5 мин (95°С — 30 с, 55°С — 30 с, 72°С — 30 с) — 30 циклов. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле в трис-боратном буфере (TBE) с последующим окрашиванием раствором бромида эти-дия (5 мкг/мл).
Реакционную смесь для расщепления ампликонов эндону-клеазой рестрикции A/uI, содержащую 0,2 мкг ДНК (5 мкл ПЦР-продукта), инкубировали согласно инструкции производителя ("Fermentas", Литва). Электрофорез проводили в 2% агарозном геле в TBE. Размеры A/uI-фрагментов, определенные с помощью Photo-CaptMw Version 99.04, сравнивали in si/ico [4] с размерами соответствующих A/uI-фрагментов гена 16S рРНК штаммов А.baumannii с установленными нуклеотидными последовательностями, размещенными в GenBank (CP000863.1, CP000521.1, CP001172.1, CU459141.1 и CP001182.1).
Кроме того, штаммы идентифицировали посредством определения генов видоспецифических ß-лактамаз OXA-51 и родственных ферментов (bla^^^-remi) методом ПЦР с использованием праймеров, описанных ранее [21].
Генотипирование. Генетическое типирование штаммов А. baumannii проводили методом ПЦР с произвольными прай-мерами (RAPD): Wil2 (5'-TCACGATGCA-3') [20] и 1247 (5'-AAGAGCCCGT-3') [3]. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 75 мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25°C), 20 мМ (NH4)2S04, 0,01 % Tween 20, 2 мМ MgCl2, 0,4 мкМ прай-мера, 200 мкМ каждого дНТФ, 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы и 10—50 нг бактериальной ДНК. Реакцию амплификации проводили в следующем режиме: 94,5°С — 3 мин, (94°С — 1 мин, 35°С — 1 мин, 72°С —2 мин) — 5 циклов, (94°С — 30 с, 35°С — 30 с, 72°С — 2 мин) — 40 циклов, 72°С — 10 мин. Детекцию продуктов амплификации осуществляли посредством электрофореза в 1,5% агарозном геле в TBE-буфере. Кластерный анализ RAPD-профилей проводили с помощью программного обеспечения Bionumerics 5.1 ("Applied Math NV", Бельгия) с использованием алгоритма Ward и коэффициента Cosine.
Размножение, концентрирование и очистка бактериофага. В качестве штамма-хозяина бактериофага AP22 использовали штамм А. baumannii 1053, выделенный из раневого отделяемого больного ожогового центра Челябинска. Чистый препарат фага получали из изолированной негативной колонии после трех последовательных пересевов на газоне данного штамма.
Для получения фаголизата ночную культуру штамма А. baumannii 1053 засевали в 200 мл LB-бульона, выращивали при температуре 37°С с аэрацией до OD600 = 0,3—0,4, заражали бактериофагом таким образом, чтобы множественность инфицирования составляла 1 бактериофаг на 10 бактериальных клеток, и инкубировали до заметного лизиса жидкой культуры.
Очистку фаголизата проводили дифференциальным центрифугированием. Клеточный дебрис осаждали в низкоскоростном режиме (7000 g, 30 мин), фаголизат концентрировали ультрацентрифугированием в течение 2 ч при температуре 4°С, 25 000 об/мин (центрифуга Весктап, ротор БШ28). Осадок осторожно суспендировали в БМ-буфере (10 мМ 1л8-НС1 рН 7,5, 10 мМ MgSO4•7 Н20, 150 мМ ЫаС1), центрифугировали при 13 000 g, супернатант обрабатывали ДНКазой (1 мкг/мл) и РНКазой (1 мкг/мл) при температуре 37°С. Нуклеазы удаляли хлороформом.
Литический спектр бактериофага. Специфичность и спектр антибактериального действия бактериофага определяли методом спот-тестирования и стандартным двухслойным методом. В случае спот-тестирования 0,3 мл бульонных бактериальных культур (~ 108—109 КОЕ/мл) смешивали с 4 мл полужидкого агара (ЬВ с добавлением 0,6% агарозы и 400 мкг/мл хлорида кальция) при температуре 45°С и распределяли по поверхности минимальной среды М9 [14]. После застывания верхнего агара на поверхность наносили 10 мкл бактериофага (~108 БОЕ/мл) и инкубировали при температуре 37°С в течение 18—24 ч. При визуальном осмотре на чашках с чувствительными культурами А. Ъаишаппи рост бактериального газона отсутствует в местах внесения бактериофага (прозрачное пятно лизиса). В случае стандартного двухслойного метода к бактериальной культуре чувствительного штамма добавляли необходимое разведение бактериофага, смешивали с полужидким агаром и наносили на поверхность питательной среды.
Результаты и обсуждение
Основными объектами исследования явились множественно-устойчивые штаммы А. Ъаишаппи, выделенные от больных ожоговых отделений, отделений плановой и экстренной хирургии, терапевтического отделения, отделений реанимации и интенсивной терапии, а также урологического отделения в 2005—
Рис 1. Идентификация штаммов A. baumannii методом ПЦР-ПДРФ.
а — электрофореграмма продуктов гидролиза амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК клинических штаммов. 1 — ампликон, наработанный в ПЦР с использованием праймеров на ген 16S рРНК одного из штаммов A. baumannii (1490 п. н.); 2—5 — продукты гидролиза ампликонов эндонуклеазой рестрикции A/uI; L — маркер Gene Ruler™ 100 bp DNA Ladder Plus; б — анализ in si/ico (http://insilico.ehu.es/). Распределение A/uI-фрагментов в пределах анализируемых ампликонов, характерное для геномов A. baumannii, представленных в GenBank (на примере штамма A baumannii ACICU, CP000861.1).
2010 гг. Источниками выделения штаммов являлись раневое отделяемое (45%), мокрота (18%), отделяемое дренажей (13%), смывы с объектов госпитальной среды (5%) и др.
Поскольку на сегодняшний день не существует ни одного стандартного набора биохимических тестов для однозначной идентификации даже наиболее распространенных видов внутри рода ЛстеШЬа^ег [6, 8, 12], в данной работе принадлежность выделенных бактериальных культур к Л. ЬаитаппИ (гено-мовид 2) определяли с помощью моле-кулярно-генетических методов. Один из них — анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов амплификации гена 16Б рРНК (ПДРФ-ПЦР) — хорошо воспроизводимый мо-лекулярно-генетический референс-ме-тод для внутривидовой идентификации ацинетобактерий [12].
Размер ампликонов, наработанных в ПЦР с использованием праймеров на ген 16Б рРНК Л. ЬаитаппИ, составляет 1490 пар нуклеотидов. При расщеплении ампликонов рестриктазой ЛМ образуются фрагменты, размеры которых полностью соответствуют ЛМ-фрагментам известных генов 16Б рРНК штаммов Л. ЬаитаппИ, определенных т игИсо (рис.1). Полученные данные подтверждают принадлежность анализируемых клинических штаммов к геномовиду 2. В ходе проведенных исследований методом ПДРФ-ПЦР было идентифицировано в общей сложности 130 штаммов Л. ЬаитаппИ.
Известно, что для А. ЬаитаппИ характерны локализованные в хромосоме видоспецифические Ь/аОХА_51-подобные гены, объединяющие группу близкородственных вариантов, ответственных за синтез оксациллингидролизующих Р-лактамаз класса Б: ОХА51, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 75, 76, 77, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 94 и 95 [5, 9, 12, 16]. Фенотип карбапенемрезистентности обеспечивается гиперпродукцией Ь/аОХА_51-подобных генов, обусловленной наличием вышерасположенной инсерционной последовательности 1БЛЬа1, которая предоставляет промотор для данных генов [17]. На сегодняшний день остается открытым вопрос, присутствуют ли Ь1аОХА 51-подобные гены у всех изолятов А. ЬаитаппИ и встречаются ли они у других видов микроорганизмов. В связи с этим представлялось целесообразным определить их наличие в идентифицированных нами штаммах Л. ЬаитаппИ методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативным нукле-отидным последовательностям Ь/аОХД51-подобных генов [21]. В результате анализа было установлено, что все исследованные штаммы (п = 130) содержат последовательности генов Ь/аОХА_51_11ке. В то же время в ацине-тобактериях Л. ]октопИ, Л. shindleri, Л. ¡м>оЛ^11, а также штаммах ЛстеЮЬа^ег геномовидов 3 и 10 Ь1а ОХА51-подобных генов не выявлено (рис. 2).
Для дальнейшего генетического типирования штаммов А. ЬаитаппИ использовали метод ЯАРБ-ПЦР. Несмотря на то что данный вариант ПЦР харак-
Рис 2. Анализ штаммов Acinetobacter методом ПЦР с праймерами на видоспеци-фические гены b/aOXA-51-like (1,5% агарозный гель). 1, 2 — Acinetobacter геномовид 3; 3 — A. johnsonii; 4 — A. shindleri; 5, 6 — A. Iwoffii; 7 — Acinetobacter геномовид 10; 8—11 — А. baumannii; 12 — Pseudomonas aeruginosa; 13 — H2O; L — маркер Gene Ruler™ 100 bp DNA Ladder Plus ("Fermentas", Литва).
теризуется низкой межлабораторной воспроизводимостью, он остается достаточно удобным и быстрым методом анализа конкретной коллекции штаммов, выделенных в одном или нескольких стационарах, и, безусловно, является ценным с эпидемиологической точки зрения.
На основании кластерного анализа РАРБ-профилей 130 штаммов Л. ЬаитаппИ была построена дендрограмма, отражающая степень генетического родства исследуемых штаммов (рис. 3). При анализе дендрограммы было выявлено, что изучаемые штаммы входят в состав двух кластеров, условно обозначенных А и В, при степени гомологии более 90%. Кластер А (61% исследуемых клинических штаммов Л. ЬаитаппИ) представлен 6 генотипами или кло-нальными группами, в то время как кластер В (39% штаммов) объединяет 4 генотипа. В состав каждого кластера входит по одной доминирующей группе, т. е. группе, включающей наибольшее количество штаммов с идентичными ЯАРБ-профилями (одинаковыми генотипами): группа А1 в кластере А, включающая 48% штаммов из всех исследованных, и группа В1 в кластере В (35% штаммов), а также минорные группы, представленные единичными уникальными штаммами, отличающимися по генотипу от представителей других ЯАРБ-групп: группы А2, А4, А6 (кластер А) и группа В4 (кластер В).
Таким образом, выявлены две основные генетические группы штаммов Л. ЬаитаппИ, циркулирующих на протяжении нескольких лет в условиях больничного окружения в стационарах разных городов России.
Идентифицированные нами штаммы Л. ЬаитаппИ характеризовались высокими уровнями устойчивости к большинству антибиотиков, за исключением инги-биторзащищенного цефалоспорина — сульперазона и карбапенемов (имипенема и меропенема). Множественная устойчивость к антибактериальным препаратам является характерной чертой практически всех
Рис. 3. Дендрограмма кластеризации штаммов A. baumannii.
Для каждого генотипа (ЯДРО-группы) отмечены: ЯДРО-профиль штамма-представителя; 1 — буквенное обозначение генотипа; 2 количество штаммов, входящих в генотип; 3 — место выделения штаммов: Ч — Челябинск, НН — Нижний Новгород, М Петербург; 4 — количество штаммов внутри генотипа, лизируемых бактериофагом АР22 (в %).
общее Москва, СП — Санкт-
нозокомиальных штаммов А. baumannii, что обусловливает трудность лечения А. Ьаитапп/'/'-ассоциированных инфекций и затрудняет элиминацию возбудителя из стационаров лечебных учреждений. Применение лити-ческих бактериофагов может быть одним из перспективных подходов для ограничения распространения антибиотикорезистентых штаммов А. Ьаитаппп.
Одна из задач нашего исследования заключалась в оценке литической активности бактериофага АР22 [2] по отношению к штаммам А. Ьаитаппп разных генетических групп.
Бактериофаг АР22 выделен из клинического материала, полученного в ожоговом центре Научно-исследовательского института скорой помощи им. Н. В. Склифосовского (г. Москва) и депонирован в коллекции музея микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ под номером РЬ42.
Рис. 4. Морфология негативных колоний бактериофага АР22 на культуре штамма А. Ьаитаппп 1053 (нижний слой — минимальная среда М9, верхний слой — полужидкий агар на основе ЬБ-бульона).
На культуре чувствительных бактериальных штаммов А. Ьаитаппп бактериофаг формирует круглые прозрачные негативные колонии диаметром около 2—3 мм с ореолом (рис. 4). Диаметр ореола варьирует от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров и увеличивается с течением времени. Негативные колонии формируются на чашках уже после 4 ч инкубации при температуре 37°С. Титр бактериофага при размножении в жидкой культуре составляет около 1010 БОЕ/мл.
В серии проведенных экспериментов установлено, что бактериофаг АР22 лизирует в общей сложности 69% (89 из 130) антибиотикорезистентных клинических штаммов А. Ьаитаппп и не обладает литической
Специфичность бактериофага AP22 (спот-тестирование)
Вид микроорганизма
Наличие(+)или отсутствие (—) лизиса
Acinetobacter baumannii (130) *
A. genomospecies 3 (2) A. genomospcies 10 (2) A. johnsonii (1) A. shindleri (1) Acinetobacter Iwoffii (6) Acinetobacter calcoaceticus (2) Acinetobacter anitratus (4) Pseudomonas aeruginosa (5) Escherichia coli (3) Yersinia pseudotuberulosis (3) Yersinia enterocolitica (3) Klebsiella pneumoniae (3) Klebsiella oxytocae (3) Enterobacter cloacae (3) Pasteurella multocida (3) Salmonella еnteritidis (3)
+ (89) — (41)
Примечание. * — в скобках указано количество штаммов данного вида, используемых при проверке.
активностью по отношению к представителям других геномовидов Acinetobacter, а также бактериям других родов и семейств (см. таблицу). Таким образом, бактериофаг обладает специфичностью и в отличие от других известных фагов A. baumannii достаточно широким литическим спектром. Так, фаг AB1 [22], выделенный из образца морских отложений, лизирует только 1 из 5 выбранных для проведения исследования штаммов. Другой описанный бактериофаг фАВ2 [11], выделенный из образцов сточных вод больницы, проявляет литическую активность по отношению к 25 из 125 полирезистентных штаммов A. baumannii. Недавно охарактеризованный фаг Abp53 лизирует 27% исследуемых штаммов A. baumannii [10].
Необходимо отметить, что бактериофаг AP22 обладает более выраженной литической активностью по отношению к представителям доминантных RAPD-групп А1 и В1, распространенных в нескольких крупных стационарах России, лизируя 82 % (88 из 107) данных штаммов A. baumannii (см. рис. 3).
Таким образом, выраженная видоспецифичность и широкий спектр литической активности бактериофага AP22 позволяют рассматривать его в качестве потенциального компонента комбинированного лечебного фагового препарата для контроля A. baumannii-инфекций, а также использовать бактериофаг AP22 для идентификации A. baumannii при бактериологическом анализе клинического материала.
Работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы "Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации" (на 2011—2015 гг.); Гос. регистрационный № 01201172662 (тема № 045). Авторы выражают глу -бокую благодарность М. А. Поповой (Городская клиническая больница № 6, Челябинск), Т. Г. Спиридоновой (НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского, Москва), Н. А. Гординской (Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России, Нижний Новгород), А. Е. Гончарову (Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург), Н.К. Фурсовой (ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск) и М. В. Эдельштейну (НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленск) за предоставление бактериальных штаммов, клинических изолятов и образцов для проведения исследования.
Сведения об авторах
Попова Анастасия Владимировна — мл. науч. сотр. ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии; e-mail: popova_nastya86@mail.ru;
Мякинина Вера Павловна — науч. сотр. ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии;
Платонов Михаил Евгеньевич — канд. биол. наук, науч. сотр. ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии; e-mail: platonov@obolensk.org;
Воложанцев Николай Валентинович — канд. биол. наук, зав. лаб. молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии; e-mail: nikvol@obolensk.org.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мартинович А. А. // Клин. микробиол. и антимикроб. химио-тер. — 2010. — Т. 12. — С. 96—105.
2. Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АР22 для идентификации бактерий Acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для получения препарата против внутрибольничныхA. èaumannii-инфекций. — Пат. № 2439151, 2012, РФ.
3. Akopyanz N., Bukanov N. O., Westblom T. U. et al. // Nucl. Acids Res. — 1992. — Vol. 20. — P. 5137—5142.
4. Bikandi J., San Millàn R., Rementeria A., Garaizar J. // Bioinformatics — 2004. — Vol. 20. — P. 798—799.
5. Brown S., Young H. K., Amyes S. G. // Clin. Microbiol. Infect. — 2005. — Vol. 11. — P. 15—23.
6. Chang H. C., Wei Y. F., Dijkshoorn L. et al. // J. Clin. Microbiol. —
2005. — Vol. 43. — P. 1632—1639.
7. de OliveiraA. C., Damasceno Q. S. // Rev. Esp. Enferm. — 2010. — Vol. 44. — P. 1118—1123.
8. Ehrenstein B., Bernards A. T., Dijkshoorn L. et al. // J. Clin. Microbiol. — 1996. — Vol. 34. — P. 2414—2420.
9. Héritier C., Poirel L., Fournier P. E. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. — 2005. — Vol. 49. — P. 4174—4179.
10. Lee C. N., Tseng T. T., Lin J. W. et al. // Appl. Environ. Microbiol. — 2011. — Vol. 77. — P. 6755—6762.
11. Lin N. T., Chiou P. Y., ChangK. C.et al. // Res. Microbiol. — 2010. — Vol. 161. — P. 308—314.
12. Peleg A. Y., Seifert H., Paterson D. L. // Clin. Microbiol. Rev. — 2008. — Vol. 21. — P. 538—582.
13. Perez F., Hujer A. M., Hujer K. M. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. — 2007. — Vol. 51. — P. 3471—3484.
14. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. // New York: Cold Spring Harbor Lab., 1989.
15. TownerK. J. // J. Hosp. Infect. — 2009. — Vol. 73. — P. 355—363.
16. Turton J. F., WoodfordN., Glover J.et al. // J. Clin. Microbiol. —
2006. — Vol. 44. — P. 2974—2976.
17. Turton J. F., Ward M. E., Woodford N. et al. // FEMS Microbiol. Lett. — 2006. — Vol. 258. — P. 72—77.
18. Webster C. A., Crow M., Humphreys H., Towner K. S. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. — 1998. — 17. — P. 171—176.
19. Wendt C., Dietz B., Dietz E., Ruden H. // J. Clin. Microbiol. — 1997. — Vol. 35. — P. 1394—1397.
20. Williams J. G., Hanafey M. K., Rfalski J. A., Tingey S. V. // Meth. Enzymol. — 1993. — Vol. 218. — P. 704—740.
21. Woodford N., Ellington M. J., Coelho J. M. // Int. J. Antimicrob. Agents. — 2006. — Vol. 27. — P. 351—353.
22. Yang H., Liang L., Lin S., Jia S. S. // BMC Microbiol. — 2010. — Vol. 10. — P. 131.
Поступила 28.02.12
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE MULTIDRUG-RESISTANT ACINETOBACTER BAUMANNII STRAINS AND ASSESSMENT OF THEIR SENSITIVITY TO THE PHAGE AP22
A. V. Popova, V. P. Myakinina, M. E. Platonov, N. V. Volozhantsev State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russia
The molecular analysis of 130 multidrug-resistant nosocomial Acinetobacter baumannii strains was performed. The strains were obtained from patients admitted to different Russian hospitals (Chelyabinsk, Moscow, Nizhni Novgorod, and St. Petersburg) in 2005-2010. Species identification was performed using the amplified 16S rRNA gene restriction analysis and by determining intrinsic for A. baumannii bla _51-like genes using PCR. The genetic typing of the strains was performed by RAPD-PCR. All strains fell into two clusters: A and B with dominant RAPD-groups A1 and B1, respectively, including 82% (107 of 130) of all studied strains. The susceptibility to the bacteriophage AP22 of the strains was determined. The phage was found to infect specifically and to constitute 69% of 130 strains and 82% (88 of 107) of the A. baumannii strains from the dominant RAPD groups. The ability of the bacteriophage AP22 to constitute a broad range of the clinically relevant A. baumannii strains makes it an attractive candidate for designing the phage cocktails intended to control the A. baumannii-associated nosocomial infections. Moreover, the phage can be used for the identification of A.baumannii in bacteriological analysis of clinical materials.
Key words: Acinetobacter baumannii, species identification, ge-notyping, bacteriophage
