Молекулярно-эпидемиологический анализ штаммов Acinetobacter baumannii, выделенных у пациентов с ожоговой травмой Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



молекуляр

штам

у па

DOI: 10______________

УДК 616-036.22-001. Поступила 17.03.201

.федры эпидемиологии и военной эпидемиологии1;

......_______г-......-федры эпидемиологии и военной эпидемиологии1;

ЛА Скурихина, к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории генетики2;

В.Б. туркутюков, д.м.н., профессор, зав. кафедрой эпидемиологии и военной эпидемиологии1

.курихма, Т.Д. Ибрагимова, аспирант к

Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток, 690002, пр. Острякова, 2; нститут биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, Владивосток, 690041, л. Пальчевского, 17

У больных с ожоговой травмой последние годы отмечается постоянный рост частоты инфекций, вызванных Acinetobacter spp., особенно A. baumannii. Госпитальные популяции микроорганизмов, складывающиеся в условиях стационара, всегда состоят из штаммов с высокой вирулентностью и антибиотикоустойчивостью. Анализ с использованием молекулярных маркеров позволяет судить об эпидемической связи между штаммами, выявить наличие в стационаре госпитальных штаммов и определить источник инфицирования пациентов.

Цель исследования — при помощи молекулярно-генетических методов — полимеразно-цепной реакции (ПЦР) — оценить характер распространения эпидемически значимых штаммов Acinetobacter baumannii у пациентов с ожоговой травмой, выявить преобладающий генотип, определить наличие госпитальных штаммов.

Материалы и методы. Методом ПЦР исследованы некоторые важнейшие факторы вирулентности и резистентность к антибиотикам 60 штаммов A. baumannii, выделяемых в течение более двух лет от пациентов ожогового отделения. Проведен анализ генов анти-биотикорезистентности и факторов вирулентности OXA-23, ISAbal, csuE, tonB. Полиморфизм генотипов оценивали с помощью теста Х-квадратов (Raymond M., Rousset F., 1995).

Результаты. У исследованных штаммов выявлен высокий уровень резистентности к карбапенемам, у 40% штаммов определен ген csuE, который является одним из показателей склонности бактерий к формированию биопленок. Ген tonB, кодирующий свойства бактерий, позволяющие вызвать бактериемию в короткие сроки, выделен в 15% случаев. По исследуемым генам, кодирующим анти-биотикорезистентность и факторы вирулентности, выявлен незначительный уровень генетической дифференциации штаммов (всего 9 комбинированных генотипов с преобладанием трех генотипов: А — 50%, F и I — по 10% случаев), что говорит как об экзогенном внутрибольничном инфицировании пациентов, так и о наличии госпитальных штаммов в отделении.

Заключение. Исследование генетической структуры штаммов A. baumannii с помощью ПЦР-анализа генов OXA-23, ISAbal, csuE, tonB позволяет эффективно оценить наличие эпидемической связи между штаммами, выявить преобладающий генотип и определить эпидемически важные свойства штаммов.

Ключевые слова: Acinetobacter baumannii; госпитальные штаммы; антибиотикорезистентность; биопленки; антибиотики.

Как цитировать: Skurikhina Yu.E., Ibragimova T.D., Skurikhina L.A., Turkutyukov V.B. Molecular epidemiological analysis of Acinetobacter baumannii strains isolated in patients with burn injury. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(1): 134-139, http://dx.doi.org/10.17691/ stm2016.8.1.18.

English

Molecular Epidemiological Analysis of Acinetobacter Baumannii strains Isolated in Patients with Burn Injury

Yu.E. skurikhina, MD, PhD, Associate Professor, Department of Epidemiology and Military Epidemiology1; T.D. Ibragimova, PhD Student, Department of Epidemiology and Military Epidemiology1; L.A. skurikhina, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Genetics2;

V.B. Turkutyukov, MD, DSc, Professor, Department of Epidemiology and Military Epidemiology1 1Pacific State Medical University, 2 Ostryakov Avenue, Vladivostok, 690002, Russian Federation;

Для контактов: Скурихина Юлия Евгеньевна, e-mail: eesku@mail.ru

/////////////////////^^^^

134 СТМ J 2016 — том 8, №1 Ю.Е. Скурихина, Т.Д. Ибрагимова, Л.А. Скурихина, В.Б. Туркутюков

2A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, 17 Palchevskogo St., Vladivostok, 690041, Russian Federation

Recently, there is a steady increase of infections caused by Acinetobacterspp, especially A. baumannii in patients with burn injury. Hospital populations of microorganisms always include highly virulent and antibiotic-resistant strains. The analysis using molecular markers enables to estimate the epidemiologic relation between strains, reveal the presence of hospital strains, and identify the infection source.

The aim of the investigation was to assess the nature of the spread of significant epidemic strains Acinetobacter baumannii in burn patients, and identify a predominant genotype to determine the presence of hospital strains using molecular genetic techniques (polymerase chain reaction (PCR)).

Materials and Methods. By means of PCR we investigated some major virulence factors and antibiotic resistance of 60 of A. baumannii strains being isolated for more than two years from the burn unit patients. The antibiotic resistance of genes and virulence factors of OXA-23, ISAbal, csuE, tonB were studied. The polymorphism of genotypes was evaluated using x-square test (Raymond M., Rousset F., 1995).

Results. The strains under study were revealed to have a high resistance level to carbapenems, csuE gene was identified in 40% strains, the gene being one of the film formation susceptibility factors of bacteria. tonB gene encoding the bacteria properties enabling to cause bacteremia promptly was isolated in 15% cases. In the genes encoding antibiotic resistance and virulent factors, we revealed a slight genetic differentiation level of strains (total, 9 combined genotypes with three genotypes predominating: A — 50% cases, F and I — 10% cases) that indicates both exogenous nosocomial infection of patients, and the presence of hospital strains in the department.

Conclusion. The study of the genetic structure of A. baumannii strains using PCR analysis of OXA-23, ISAbal, csuE, tonB genes enables to assess efficiently the epidemic relationship between strains, reveal a predominant genotype and identify epidemiologically important properties of the strains.

Key words: Acinetobacter baumannii; hospital strains; antibiotic resistance; biofilms; antibiotics.

Среди возбудителей инфекций, вызывающих осложнения, в том числе у пациентов ожоговых отделений, в последние годы все более устойчивые позиции занимают грамотрицательные неферментирующие бактерии. Отмечается постоянный рост частоты инфекций, вызванных Аапе1оЬас1ег spp., особенно А. ЬаитаппИ [1-3].

АшеЮЬа^ег spp. — свободно живущие в окружающей среде неферментирующие бактерии, способные сохраняться и размножаться в госпитальных условиях, используя в качестве субстрата почти все природные органические соединения. Они контаминируют самые разнообразные растворы, в том числе и некоторые из дезинфектантов (фурацилин, риванол и др.), а также медицинский инструментарий и оборудование, особенно в местах скопления жидкости. Основными особенностями ацинетобактеров являются резистентность ко многим группам антибактериальных химиопрепаратов; способность к формированию биопленок (как на тканях живого организма, так и на полимерных материалах, используемых в медицине); наличие сигнальной системы «кворум-сенсинг», что позволяет усиливать защиту бактерий от антибиотиков, дезинфектантов, иммунной системы человека. Главные факторы вирулентности: полисахаридная капсула, пили, фермент, который разрушает липиды тканей макроорганизма, токсин, вызывающий гибель лейкоцитов [1, 4, 5].

Микробиологический мониторинг формирования ан-тибиотикорезистентности является важным методом оценки эффективности антибиотикотерапии и возможности эмпирического назначения антибактериальных химиопрепаратов [6]. Устойчивость А. ЬаитаппИ к карбапенемам все больше распространяется в стационарах по всему миру. Наиболее важный механизм устойчивости к этому классу антибиотиков — действие карбапенемаз и оксациллиназ. У ацинетобактеров описано несколько классов оксациллиназ, но, по данным

некоторых исследований [7-9], наибольшее значение имеет ОХА-23 и встречается она чаще всего у мульти-резистентных штаммов. Инсерционный элемент ^АЬа1 содержит промоторы, которые играют важную роль в экспрессии генов, кодирующих ОХА-23, что приводит к нарастанию устойчивости к антибиотикам в условиях среды стационара. Этот инсерционный элемент можно считать эпидемиологически значимым маркером лекарственно-резистентных госпитальных штаммов А. ЬаитаппИ.

Белок, кодируемый геном 1опВ-зависимого рецептора, входит в состав наружной мембраны бактериальной клетки, отвечает за усвоение железа и является важным фактором вирулентности, поскольку необходим для выживания бактерий в крови и легких. Клоны, имеющие данный ген, способны вызвать бактериемию у пациентов в короткие сроки [10]. СsuE — это один из генов, участвующих в регуляции формирования биопленок. Он отвечает за наличие пилей у бактериальных клеток [11]. Для идентификации штаммов А. ЬаитаппИ используют полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) или ПЦР-мультиплекс с конститутивными генами ирЕ, adk, ти1У, рра, которые присутствуют всегда, поскольку необходимы для основных процессов жизнедеятельности бактериальной клетки [12].

Ожоговым отделениям свойственна более высокая частота появления госпитальных штаммов ацинето-бактеров и их длительная циркуляция в условиях стационара [13]. Результаты исследований, проводимых в европейских странах, показывают, что происходит появление и быстрое распространение «эпидемических» клонов А. ЬаитаппИ с высокой степенью родства, т.е. госпитальных штаммов [14]. Работ отечественных авторов по данному направлению явно недостаточно, представлены данные только по некоторым регионам европейской части России [15], в Дальневосточном регионе подобных исследований не проводилось.

Для эффективного эпидемиологического контроля необходима идентификация возбудителя по штаммам и слежение за генетической структурой госпитальной популяции, что в полной мере возможно лишь при использовании молекулярно-генетических методов. В настоящей работе проведен генотипический анализ штаммов, полученных в ожоговом отделении Дальневосточного окружного медицинского центра ФМБА России (Владивосток).

В настоящее время в мире «золотым стандартом» для генотипического анализа является метод МЛСТ (мультилокусное сиквенс-типирование, MLST). Для ацинетобактеров используются две схемы: института Пастера (Pasteur's MLST) [16] и Оксфордская (PubMLST) [17]. Несмотря на неоспоримые преимущества этого метода, такие как большая разрешающая способность и стандартизация условий, проведение МЛСТ доступно очень ограниченному числу лабораторий из-за высокой стоимости оборудования и расходных материалов. Предлагаемый метод ПЦР гораздо более доступен.

Цель исследования — при помощи молекулярно-генетических методов оценить характер распространения эпидемически значимых штаммов Acinetobacter baumannii, выявить преобладающий генотип, определить наличие госпитальных штаммов.

Материалы и методы. Исследовано 60 штаммов A. baumannii, выделенных в 2011-2013 гг. у пациентов ожогового отделения Дальневосточного окружного медицинского центра ФМБА России (Владивосток). Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили микробиологическими методами [18] и с помощью молекулярно-генетического анализа [19]. ДНК выделяли методом кипячения: петлю суточной культуры переносили в 1,5 мл пробирку Эппендорфа со 100 мкл очищенной от нуклеаз воды, кипятили в течение 5 мин на водяной бане, после чего центрифугировали при скорости 12 000 об./мин в течение 3 мин. Надосадочную

Таблица 1

Праймеры, используемые для генотипирования изолятов A. baumannii

Праймер Нуклеотидные последовательности Литература

OXA-23 F: 5'-ACTTGCTATGTGGTTGCTTCTC-3' R: 5'-TGTCAAGCTCTTAAATATTCAGC-3' [8]

ISAbal F: 5'-CACGAATGCAGAAGTTG-3' R: 5'-CGACGAATACTATGACAC-3' [8]

csuE F: 5'-TAGCGGGCCTGATGGCAATT-3' R: 5'-ACCCAGGGCTCTCAAAGAAG-3' [11]

tonB F: 5'-GGACTGGTGATAAAGCACTAT-3' R: 5'-GCCGCATAGAGTTATCACATC-3' [10]

adk F: 5'-TCAACCTGACTGCGTGAATGGTTGT-3' R: 5'-TACGTTCTACGATTTCTTCATCAGGTACATC-3' [12]

mutY F: 5'-TCGTGCCCGCAATTTGCATAAAGC-3' R: 5'-TAATGCCGGGTAGTGCAATCCATTCTTCTAG-3' [12]

PPa F: 5'-TGGTTATGTACCAAATACTTTGTCTGAAGATGG-3' R: 5'-TGACGGCATCGATACCACCGTC-3' [12]

trpE F: 5'-TGAGATTGCTGAACATTTAATGCTGATTGA-3' R: 5'-TTGTACATTTGAAACAATATGCATGACATGTGAAT-3' [12]

жидкость (супернатант) переносили автоматической микропипеткой в стерильные пробирки и использовали для анализа.

Полимеразную цепную реакцию проводили в тер-моциклере ThermalCycler С 1000™ (Bio-Rad, США). Используемые в работе праймеры представлены в табл. 1.

Рабочая смесь содержала 1 единицу Taq ДНК-полимеразы («СибЭнзим», Россия), 1хбуфер (10х: 600 ммоль Tris-HCl; 250 ммоль KCl; 15 ммоль MgCl2; 100 ммоль 2-меркаптоэтанол; 1% Тритон X-100, pH=8,5), 0,8 ммоль смеси дезоксинуклеозидтрифосфа-тов (по 0,2 ммоль каждого), 0,25 мкмоль каждого прай-мера и 50 нг ДНК.

Амплификацию гена OXA-23 проводили при следующих условиях: предварительная денатурация при 94°С — 5 мин; последующие 35 циклов при 94°С — 30 с, при 52°С — 40 с, при 72°С — 50 с и окончательная достройка цепей при 72°С — 5 мин. Для амплификации остальных генов использовали такие условия: предварительная денатурация при 95°С — 5 мин, 8 циклов при 95°С — 30 с, начиная с 48°С при каждом цикле температуру отжига повышали на 0,9°С, при 72°С — 20 с, последующие 36 циклов при 95°С — 15 с, при 56°С — 20 с, при 72°С — 20 с и окончательная достройка цепей при 72°С — 5 мин. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 2,0% агарозном геле (Agarose Biotechnology Grade, Amresco, США) с окраской ДНК этидиум бромидом. Маркером молекулярной массы служил стандартный набор фрагментов ДНК, кратных 100 парам нуклео-тидов (п.н.) («СибЭнзим», Россия). Для определения размеров амплифицированных фрагментов использовали программу TotalLab v. 2.01.

Присутствие или отсутствие ампликонов рассматривалось как бинарный признак, в соответствии с чем для всех исследуемых изолятов A. baumannii и всех используемых праймерных последовательностей была создана бинарная матрица. Впоследствии каждый изолят типировался по всем парам праймеров, в результате чего были получены комбинированные генотипы. Полиморфизм генотипов оценивали с помощью теста %-квадратов [20] для каждой пары изолятов в программе ARLEQUIN v. 3.5 [21]. Поиск оптимальной дендрограммы максимальной экономии МР (Maximum Parsimony tree) выполняли по алгоритму PENNY

[22] в пакете программ PHYLIP (Phylogeny Inference Package) v. 3.67

[23]. Устойчивость кластеризации оценивали в 1000 итераций бутстреп-ана-лиза [24]. Графическое изображение дендрограммы получено в программе TreeView (http://taxonomy.zoology.gla. ac.uk/rod/treeview.html).

Результаты и обсуждение. Гены adk, mutY, ppa и trpE амплифициро-вались у всех исследуемых штаммов

/////////////////////^^^^

136 СТМ J 2016 — ТОМ 8, №1 Ю.Е. Скурихина, Т.Д. Ибрагимова, Л.А. Скурихина, В.Б. Туркутюков

A. baumannii. Гены OXA-23 и ISAbal амплифицирова-лись в 70 и 80% случаев соответственно, что указывает на наличие резистентности к карбапенемам. Ген csuE определен у 40% штаммов. Он имеет 4 модификации с разной молекулярной массой. Есть основания полагать, что это обусловлено мутациями в гене, являющемся одним из показателей склонности бактерий к формированию биопленок. Это свойственно многим госпитальным штаммам. Ген tonB, кодирующий свойства бактерий, позволяющие вызвать бактериемию в короткие сроки, определен у 15% штаммов. В ходе анализа для каждого штамма объединяли все полученные данные по присутствию/отсутствию признака, получая таким образом комбинированный генотип, соответствующий определенному набору генов и являющийся

генетической характеристикой данного штамма. По исследуемым генам, кодирующим антибиотикорезистент-ность и факторы вирулентности, было выделено 9 комбинированных генотипов. Наиболее часто встречался генотип А (в 50% случаев). Генотипы F и I встречались в 10%, остальные — в 5% случаев (табл. 2).

Оценки генетических различий генотипов A. baumannii, полученные с помощью теста х-квадра-тов для каждой пары изолятов, показали, что только генотипы F и I достоверно отличаются при 95% уровне значимости (табл. 3). Существенных различий между другими генотипами не выявлено. На основании анализа генетического полиморфизма изолятов A. baumannii построена MP-дендрограмма (см. рисунок). Также как и данные генетической дифференциации исследуемых

Таблица 2

Генотипирование изолятов A. baumannii по результатам ПЦР-анализа

Генотип OXA-23 csuE* Частота

ISAbal a b c d tonB встречаемости, %

A + + - - - - + 50

B + + + - - - + 5

C - + - - - - + 5

D - - - + - - + 5

E - - - ++ - - 5

F - -- -- -- 10

H - + - + - - + 5

I + + - + - - + 10

K + + - - - + + 5

* — размеры амплифицированного фрагмента гена csuE: a — 180 п.н., b — 200 п.н., c — 220 п.н., d — 285 п.н. Здесь п.н. — пары нуклеотидов.

Таблица 3

Генетическая дифференциация изолятов A. baumannii

Генотип ABCDEFHIK

A - - - - + - + -

B 0.09066± 0.0017 - - - - - - -

C 0.08981± 0.0016 1.00000± 0.0000 - - - - - -

D 0.09199± 0.0011 1.00000± 0.0000 1.00000± 0.0000 - - - - -

E 0.09165± 0.0015 1.00000± 0.0000 1.00000± 0.0000 1.00000± 0.0000 - - - -

F 0.01574± 0.0006 0.33194± 0.0026 0.33358± 0.0019 0.33724± 0.0020 0.33191± 0.0015 - - -

H 0.09408± 0.0022 1.00000± 0.0000 1.00000± 0.0000 1.00000± 0.0000 1.00000± 0.0000 0.33340± 0.0023 - -

I 0.01499± 0.0006 0.33328± 0.0028 0.32977± 0.0023 0.33343± 0.0027 0.33206± 0.0024 0.33073± 0.0026 0.33406± 0.0018 -

к 0.09075± 1.00000± 1.00000± 1.00000± 1.00000± 0.33578± 1.00000± 0.33345± к 0.0007 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0021 0.0000 0.0018_

Примечание. Ниже диагонали приведены оценки генетических различий, выше диагонали — достоверность различий для уровня значимости р=0,05: «-» — различия недостоверны, «+» — различия достоверны.

МР-дендрограмма, построенная на основании анализа полиморфизма генов OXA-23, ISAba1, csuЕ, tonЕ штаммов А. ЬаитаппИ. Цифрами показаны оценки бутстреп-поддер-жки (процент от 1000 реплик)

изолятов (см. табл. 3), дендрограмма указывает на их тесную генетическую близость, о чем свидетельствуют низкие значения (не более 50%) бутстреп-поддержек.

Таким образом, исследование генетической структуры 60 изолятов А. ЬаитаппИ с помощью ПЦР-анали-за генов ОХА-23, ¡БАЬа1, овиЕ, ЮпВ свидетельствует о незначительном уровне их генетической дифференциации. Полученные данные указывают на длительное существование госпитальных штаммов в среде стационара и на высокую частоту внутрибольничного экзогенного инфицирования пациентов, поскольку эндогенное инфицирование разными штаммами давало бы гораздо большее разнообразие признаков. Данные факты говорят о необходимости соблюдения всех требований инфекционного контроля в лечебных учреждениях и использования принципов рациональной антибиотико-терапии в повседневной врачебной практике, а также о совершенствовании и унификации методов эпидемиологического надзора за формированием госпитальных штаммов.

По сравнению с методом МЛСТ предлагаемая нами методика применения ПЦР для определения спектра госпитальных штаммов является материально малозатратной, поскольку используемое для данного метода оборудование имеется в большинстве исследовательских и клинических лабораторий, а стоимость

расходных материалов существенно ниже стоимости реактивов для секвенирования. Полученные с помощью этого метода результаты легко воспроизводимы и статистически достоверны, что свидетельствует о возможности его широкого применения.

Заключение. Исследование генетической структуры штаммов A. baumannii с помощью ПЦР-анализа генов OXA-23, ISAbal, csuE, tonB позволяет эффективно оценить наличие эпидемической связи между штаммами, выявить преобладающий генотип и определить эпидемически важные свойства штаммов.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками и конфликт интересов, связанный с данным исследованием, отсутствует.

Литература

1. Карабак В.И., Гельфанд Е.Б., Белоцерков-ский Б.З., Попов Т.В., Краснов В.Г. Проблемные госпитальные микроорганизмы. Acinetobacter spp. — возбудитель или свидетель? Инфекции в хирургии 2008; 1: 12-19. Karabak V.I., Gel'fand E.B., Belocerkovskij B.Z., Popov T.V., Krasnov V.G. Problematic hospital microorganisms. Acinetobacter spp. — pathogen or a witness? Infektsii v khirurgii 2008; 1: 12-19.

2. Руднов В.А., Зубарев А.С. Инфекции в отделениях реанимации и интенсивной терапии, вызванные P. aeruginosa и Acinetobacter spp. Consilium medicum 2008; 1: 37-44. Rudnov V.A., Zubarev A.S. Infections in the intensive care unit caused by P. aeruginosa and Acinetobacter spp. Consilium medicum 2008; 1: 37-44.

3. Di Popolo A., Giannouli M., Triassi M., Brisse S., Zarrilli R. Molecular epidemiological investigation of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strains in four Mediterranean countries with a multilocus sequence typing scheme. Clin Microbiol Infect 2011; 17(2): 197-201, http://dx.doi.org/10.11117j.1469-0691.2010.03254.x.

4. Туркутюков В.Б., Ибрагимова Т.Д., Фомин Д.В. Молекулярные особенности морфологии биопленок, формируемых штаммами неферментирующих грамнегативных бактерий. Тихоокеанский медицинский журнал 2013; 4: 4447. Turkutyukov V.B., Ibragimova T.D., Fomin D.V. Molecular and morphological features of biofilms developed by gramnegative non-fermentable bacterial strains. Tikhookeanskiy meditsinskiy zhurnal 2013; 4: 44-47.

5. Сатосова Н.В. Эпидемиология и профилактика инфекций кровотока в отделении ожоговой реанимации и интенсивной терапии. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб; 2012. Satosova N.V. Epidemiologiya i profilaktika infektsiy krovotoka v otdelenii ozhogovoy reanimatsii i intensivnoy terapii. Avtoref. dis. ... kand. med. nauk [Epidemiology and prevention of bloodstream infections in the department of burn intensive care. PhD Thesis]. Saint Petersburg; 2012.

6. Туркутюков В.Б., Скурихина Ю.Е., Скурихи-на Л.А., Баян В.П. Молекулярно-генетический мониторинг за формированием резистентности к антибиотикам штаммов микроорганизмов, выделенных у пациентов специализированных стационаров. Дальневосточный журнал инфекционной патологии 2009; 14: 46-50. Turkutyukov V.B., Skurikhin Y.E., Skurikhina L.A., Bayan V.P. Molecular and genetics monitoring for the formation of strains

//////////////////////^^^^

138 СТМ J 2016 — TOM 8, №1 Ю.Е. Скурихина, Т.Д. Ибрагимова, Л.А. Скурихина, В.Б. Туркутюков

resistant to antibiotics microorganisms isolated in specialized hospitals patients. Dal'nevostochnyy zhurnal infektsionnoy patologii 2009; 14: 46-50.

7. Mugnier P.D., Poirel L., Naas T., Nordmann P. Worldwide dissemination of the blaOXA-23 carbapenemase gene of Acinetobacter baumannii. Emerg Infect Dis 2010; 16(1): 35-40, http://dx.doi.org/10.3201/eid1601.090852.

8. Carvalho K.R., Carvalho-Assef A.P., Santos L.G., Pereira M.J., Asensi M.D. Occurrence of blaOXA-23 gene in imipenem-susceptible Acinetobacter baumannii. Mem Inst Oswaldo Cruz 2011; 106(4): 505-506, http://dx.doi.org/10.1590/ S0074-02762011000400020.

9. Соломенный А.П. Инсерционная последовательность ISAba1 в геноме эпидемически значимых штаммов Acinetobacter. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2008; 5: 98-100. Solom^ny A.P. ISAbal insertion sequence in genome of epidemically relevant Acinetobacter strains. Zh Mikrobiol (Moscow) 2008; 5: 98-100.

10. Acosta J., Merino M., Viedma E., Poza M., Sanz F., Otero J.R., Chaves F., Bou G. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Harboring OXA-24 carbapenemase, Spain. Emerg Infect Dis 2011; 17(6): 1064-1067, http://dx.doi.org/10.3201/ eid/1706.091866.

11. Gaddy J., Actis L. Regulation of Acinetobacter baumannii biofilm formation. Future Microbiol 2009; 4(3): 273-278, http:// dx.doi.org/10.2217/fmb.09.5.

12. Ecker J.A., Massire C., Hall T.A., Ranken R. Pennella T.T., Agasino Ivy C., Blyn L.B., Hofstadler S.A. Endy T.P., Scott P.T., Lindler L., Hamilton T., Gaddy C., Snow K. Pe M., Fishbain J., Craft D., Deye G., Riddell S., Milstrey E. Petruccelli B., Brisse S., Harpin V., Schink A., Ecker D.J. Sampath R., Eshoo M.W. Identification of Acinetobacter species and genotyping of Acinetobacter baumannii by multilocus PCR and mass spectrometry. J Clin Microbiol 2006; 44(8): 29212932, http://dx.doi.org/10.1128/JCM.00619-06.

13. Соломенный А.Л., Яфаев Р.Х., Гончаров А.Е., Асланов Б.И., Крылов К.М., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Генетическое разнообразие Acinetobacter baumannii в отделении ожоговой реанимации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2006; 2: 25-30. Solomennyi A.P., Yafaev R.Kh., Goncharov A.E., Aslanov B.I., Krylov K.M., Maksimov A.Yu., Demakov V.A. Genetic variety of Acinetobacter baumannii in an intensive care unit for burn patients. Zh Mikrobiol (Moscow) 2006; 2: 25-30.

14. Lyytikäinen O., Köljalg S., Härmä M., Vuopio-Varkila J. Outbreak caused by two multi-resistant Acinetobacter baumannii clones in a burns unit: emergence of resistance to imipenem. J Hosp Infect 1995; 31(1): 41-54, http://dx.doi.org/10.1016/0195-6701(95)90082-9.

15. Соломенный А.П., Максимов А.Ю., Мочалова Т.И. ПЦР-генотипирование госпитальных изолятов Acinetobacter. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2004; 6: 26-30. Solomennyi A.P., Maksimov A.Yu., Mochalova T.I. PCR genotyping of Acinetobacter hospital isolates. Zh Mikrobiol (Moscow) 2004; 6: 26-30.

16. Diancourt L., Passet V., Nemec A., Dijkshoorn L., Brisse S. The population structure of Acinetobacter baumannii: expanding multiresistant clones from an ancestral susceptible genetic pool. PLoS One 2010; 5(4): e10034, http://dx.doi. org/10.1371/journal.pone.0010034.

17. Bartual S.G., Seifert H., Hippler C., Luzon M.A., Wisplinghoff H., Rodriguez-Valera F. Development of a multilocus sequence typing scheme for characterization of clinical isolates of Acinetobacter baumannii. J Clin Microbiol 2005; 43(9): 4382-43890, http://dx.doi.org/10.1128/ JCM.43.9.4382-4390.2005.

18. Peleg A.Y., Seifert H., Paterson D.L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev 2008; 21(3): 538-582, http://dx.doi.org/10.1128/ CMR.00058-07.

19. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor; 1989.

20. Raymond M., Rousset F. An exact test for population differentiation. Evolution 1995; 49(6): 1280-1283, http://dx.doi. org/10.2307/2410454.

21. Excoffier L., Lischer H.E.L. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Mol Ecol Resources 2010; 10(3): 564-567, http://dx.doi.org/10.1111/j.1755-0998.2010.02847.x.

22. Hendy M.D., Penny D. Branch and bound algorithms to determine minimal evolutionary trees. Math Biosci 1982; 59(2): 277-290, http://dx.doi.org/10.1016/0025-5564(82)90027-x.

23. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.67. University Washington, Seattle; 2007.

24. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 1985; 39(4): 783-791, http://dx.doi.org/10.2307/2408678.