CC BY
69
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ДИССЕРТАЦИОННЫМ
ТЕМАМ
УДК: 579.84:597.67:577.21.08
Код специальности ВАК: 14.02.02
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ
ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГА ПРОТИВ ACINETOBACTER BAUMANNII
О.С. Федотова1, Ю.А. Захарова2,
1ФБУН «Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций», г. Екатеринбург, 2ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет» им. акад. Е.А. Вагнера МЗ РФ, г. Пермь
Захарова Юлия Александровна - e-maii: [email protected]
Дата поступления 09.01.2018
Цель: разработка экспериментальной серии препарата бактериофага против Acinetobacter baumannii на основе актуальных госпитальных штаммов микроорганизмов. Материал и методы. Изучен микробный пейзаж 27 отделений 8 многопрофильных стационаров, включая 415 образцов. Выделенные бактериальные изоляты Acinetobacter baumannii идентифицированы классическими методами. Производственная серия препарата бактериофага против A. baumannii, полученная согласно разработанному на предприятии регламенту, изучена на степень литиче-ской активности по методу Аппельмана и Грация с использованием 8 контрольных и 116 региональных штаммов A. baumannii. Результаты. В результате проведенных исследовании изучен микробный пейзаж многопрофильных стационаров, установлен высокий уровень циркуляции A. baumannii. Выделено 405 актуальных госпитальных штаммов возбудителя, на основе которых сформирована коллекция штаммов продуцентов бактериофага A. baumannii из 60 изолятов. Из сточных вод и клинического материала получен и в дальнейшем охарактеризован ацинетобак-терный бактериофаг. Литическая активность препарата бактериофага против A. baumannii, оцененная на 53 региональных штаммах, выделенных из ОРИТ, составила 81,0% и была существенно выше, чем чувствительность штаммов к ципрофлоксацину (3,4%), имипенему (23,7%), амикацину (47,0%). Выводы. Таким образом, экспериментальная серия препарата бактериофага против A. baumannii, разработанная в производственных условиях, показала высокий уровень специфической и литической активности, что предполагает его широкое использование как средства биологической дезинфекции.
Ключевые слова: Acinetobacter baumannii, бактериофаг, специфическая активность,
госпитальные штаммы микроорганизмов.
Objective. Developing a batch of Acinetobacter baumannii bacteriophage preparation based on the current hospital microorganism strains. Materials and methods. The microbial landscape in 27 units of 8 multi-specialty hospitals was studied using 415 specimens. The A. baumannii isolates detected were identified using conventional techniques. A batch of A. baumannii bacteriophage obtained in compliance with the in-house regulations was studied for lytic activity by Appelman and Grazia on 8 control A. baumannii strains. Results. The study resulted in identification of the microbial landscape in the multi-specialty hospitals, and a high A. baumannii circulation rate was established. 405 current hospital strains of the causative agent were isolated to form a basis for a collection of A. baumannii bacteriophage producer strains containing its 60 isolates. Sewage waters and clinical materials were used to obtain an Acinetobacter bacteriophage which was then characterized. The lytic activity of A. baumannii bacteriophage evaluated using 53 regional strains isolated from ICUs was 81,0%, which was considerably higher than the sensitivity of the microorganism strains to ciprofloxacin (3,4%), imipenem (23,7%) and amikacin (47,0%). Conclusions. In summary, a batch of A. baumannii bacteriophage developed in a productive environment demonstrated high levels of specific and lytic activity, which suggests its wide application as a biological disinfectant.
Key words: Acinetobacter baumannii, bacteriophage, specific activity,
hospital microorganism strains.
Введение
Большинство инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), развивается вследствие инфицирования пациентов госпитальными штаммами [1]. Среди возбудителей гнойно-септических инфекций по литературным данным наиболее значимы штаммы грамотрицатель-ных микроорганизмов, среди которых лидирующее место занимает Acinetobacter Ьаитаппи [2, 3]. Прежде всего, это относится к отделениям реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) и ожоговым стационарам [4]. Воротами ацине-тобактерной инфекции чаще являются дыхательные пути, раны разного происхождения, органы желудочно-кишечного тракта, мочевыводящая система. Данный микроорганизм является причиной развития сепсиса, госпитальных пневмоний, инфекций кожи и мягких тканей (в том числе у больных с термическими поражениями), менингитов, абсцессов мозга, эндокардитов, перитонитов, урологических катетерассоциированных инфекций [5].
Вместе с тем увеличилась частота встречаемости А. Ьаитаппи в поликлинических условиях, что, вероятно, обусловлено расширением оказания амбулаторной помощи населению и заносом возбудителя в период реабилитации пациентов из отделений стационара.
Высокая выживаемость на объектах внешней среды и способность персистировать в течение продолжительного периода времени в условиях лечебного окружения увеличивают риск передачи этого микроорганизма через руки медицинского персонала и предметы обихода. На фоне интенсивного использования антибиотиков широкого спектра действия происходит быстрое распространение А. Ьаитаппи и растет его антибиотикорезистентность [6, 7].
В этой связи разработка препарата бактериофага с направленностью против А. Ьаитаппи как метода сочетан-ной этиотропной терапии и профилактической дезинфекции представляется нам весьма актуальной.
Цель исследования: обосновать целесообразность разработки бактериофага против Асте^Ьайег Ьаитаппи, получить экспериментальную серию препарата с высокой литической и специфической активностью.
Материал и методы
В период 2002-2010 гг. в ходе микробиологического мониторинга традиционными бактериологическими методами изучен микробный пейзаж биологического материала от пациентов и проб с объектов госпитальной среды 27 отделений 8 многопрофильных стационаров (ОРИТ, хирургии, урологии, терапии, отоларингологии, сомато-психиатрии, микрохирургии глаза). Изучено 415 образцов, выделено 957 штаммов микроорганизмов.
Проведен анализ видового состава неферментирующих грамотрицательных бактерий (НГОБ), колонизирующих пациентов и контаминирующих больничные объекты. Проведена их сравнительная характеристика.
В 2010-2014 гг. на базе ФГУП «НПО "Микроген"» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» в отделе бактериофагов была создана музейная коллекция штаммов А. Ьаитаппи из 405 представителей, полученных из лечебных организаций (ЛО) гг. Москвы, Санкт-Петербурга, Перми, Калининграда, Минска. Бактериальные изоляты выделены из клинического материала от пациентов (раневое отделяемое, тканевые биоптаты, мокрота, бронхоальвеолярный ла-
важ, плевральная жидкость, моча, содержимое дренажей) и смывов с объектов внешней среды. Первичную идентификацию штаммов проводили на клинических базах ЛО по месту выделения, в соответствии с нормативными документами [8]. Реидентификацию изолятов A. baumannii проводили на базе лаборатории ФГБУЗ ПКЦ ФМБА России, использованы наборы Микро-Ла-Тест® NEFERM test 24 (производство «Erba Lachema», Чехия).
Для определения чувствительности A. baumannii к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтона использовали диски с ци-профлоксацином (5 мкг), хлорамфениколом (30 мкг), имипенемом (10 мкг), тигециклином (15 мкг), амикацином (30 мкг), полимиксином (300 ед.), цефоперазон/сульбак-тамом (50/50 мкг). Результаты интерпретировали, руководствуясь оценочными критериями EUCAST [9], МУК 4.2.1890-04 [10] и клиническими рекомендациями [11].
Одновременно в ЛО г. Перми и г. Санкт-Петербурга (из сточных вод и биологического материала от пациентов) был получен ацинетобактерный бактериофаг.
Диапазон и степень активности бактериофага определяли в производственных условиях согласно разработанному регламенту, количественно, по методу Аппельмана, путем приготовления десятикратных последовательных разведений препарата от 10-1 до 10-6.
Для определения концентрации фаговых частиц в бактериофаге по методу Грация применяли двухслойный агар, состоящий из 1,5% мясо-пептонного агара (нижний слой) и 0,7% мясо-пептонного агара (верхний слой) [12].
Специфическую активность экспериментальной серии препарата бактериофага изучали на восьми контрольных штаммах A. baumannii из коллекции микроорганизмов Центра экспертизы и контроля МИБП ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России. Диапазон действия бактериофага оценивали капельным методом (спот-тестом) на тест-штаммах микроорганизмов из производственной коллекции ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»: Staphylococcus aureus (10 шт.), Streptococcus spp. (10 шт.), Proteus vulgaris (5 шт.), Proteus mirabilis (5 шт.), Klebsiella pneumoniaе (10 шт.), Escherichia coli (10 шт.), Shigella spp. (10 шт.), Salmonella spp. (10 шт.), Yersinia
100 nm
РИС. 1.
Бактериофаг A. baumannii (электронная микроскопия).
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
enterocolitica (10 шт.), Acinetobacter baumannii (20 шт.). Испытуемый бактериальный штамм в виде 18-часовой бульонной культуры распределяли по поверхности чашки Петри с питательным агаром. На газон с впитавшейся культурой наносили по 1 капле (0,03 мл) экспериментальной серии бактериофага с последующей инкубацией при температуре 37±1°С в течение 18 часов. Наличие полной зоны лизиса на посевном газоне свидетельствовало о чувствительности штамма к бактериофагу.
Дополнительно специфическую активность экспериментальной серии бактериофага оценивали выше описанным способом на 116 штаммах A. baumannii. Региональные штаммы выделены в 2015 году в ЛО г. Перми. Параллельно проводили оценку их чувствительности к профильным антибиотикам: ципрофлоксацину, хлорам-фенику, имипенему, тигециклину, амикацину, полимик-сину, цефоперазон/сульбактаму.
Результаты исследования
На протяжении периода эпидемиологического наблюдения (2002-2010 гг.) за циркуляцией условно-патогенных микроорганизмов в 27 отделениях 8 многопрофильных ЛО Пермского края (изучено 957 штаммов) нами было установлено, что представители НГОБ в их общей структуре составили 25,8%, стафилококки - 29,0%, эн-теробактерии - 22,6%, энтерококки - 19,4% и корине-бактерии - 3,2%. Среди пациентов НГОБ встречались в 15,4% случаев, во внешней среде - в 4,9%, что подтверждает мнение специалистов о том, что при проведении микробиологического мониторинга в первую очередь необходимо обследовать биологические материалы от пациентов, а не объекты внешней среды [13]. Отметим, что среди больничных объектов, контаминиро-ванных НГОБ, чаще встречались санитарно-техническое оборудование, необработанные предметы от пациентов и дезинфицирующие средства. Основными представителями НГОБ были Pseudomonas aeruginosa (33,6%), Acinetobacter baumannii (30,8%), Stenotrophomonas maltophilia (12,5%). Существенно меньшую долю занимали Acinetobacter Iwoffi (8,1%), Alcaligenes faecalis (5,3%), Alcaligenes denitrificans (3,6%), Acinetobacter junii (3,2%), Alcaligenes calcoaceticus (2,8%). При этом, если во внешней среде преобладала P. aeruginosa -61,1%, то среди пациентов доминировал A. baumannii -
38,2%. Вероятно, это связано с тропностью А. Ьаитаппи к локусам человека, в то время как Р. аeruginosa - водный сапрофит.
Учитывая ведущие позиции А. Ьаитаппи в структуре микрофлоры ЛО и их преобладание среди пациентов, на базе ФГУП «НПО "Микроген"» МЗ РФ «Пермское НПО "Биомед"» была проведена работа по созданию препарата бактериофага против А. Ьаитаппи.
Совместно с сотрудниками СПбГМА им. И.И. Мечникова из биологического материала от пациентов и сточных вод стационара в 2014 г. был получен специфический бактериофаг с литической активностью против А. Ьаитаппи.
Экспериментальная серия препарата, созданная в производственных условиях, была подвергнута электронной микроскопии на базе лаборатории молекулярной биоинженерии Института биоорганической химии РАН им. акад. М.М. Шемякина, Ю.А. Овчинникова (Москва) (рис. 1).
Бактериофаг А. Ьаитаппи был отнесен к морфогруппе С1 семейства Podoviridae, имел форму правильного икосэ-адрического капсида диаметром 55 нм с коротким несократимым хвостом 5-7 нм без видимых минорных элементов (шипов, фибрилл, аксессуарных капсомер).
Из сформированной коллекции культур 405 штаммов А. Ьаитаппи в отделе бактериофагов научно-производственного объединения были отобраны 60 изолятов, лизирующихся в высокой степени полученным бактериофагом, для включения их в производственную коллекцию штаммов-продуцентов бактериофага с целью получения наибольшего количества бактериальной массы при минимальных экономических затратах. Основными условиями включения штаммов в производственную коллекцию явились типичные биологические свойства, лизис маточным бактериофагом в титре 10-6 по методу Аппельмана.
Центром экспертизы и контроля МИБП ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России были предоставлены контрольные штаммы для проверки специфичности экспериментальной серии бактериофага. Контрольные штаммы А. Ьаитаппи в количестве 8 штук обладали типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.
В ходе эксперимента установлено, что специфическая активность ацинетобактерного бактериофага по методу
ТАБЛИЦА.
Диапазон действия экспериментальной серии препарата бактериофага против А. baumannii
РИС. 2.
Чувствительность к антимикробным препаратам штаммов A. baumannii (%).
Наименование организмов Количество штаммов (n=100) Фаголизабель-ность
Staphylococcus aureus 10 отсутствует
Streptococcus spp. 10 отсутствует
Proteus vulgaris 5 отсутствует
Proteus mirabilis 5 отсутствует
Klebsiella pneumoniae 10 отсутствует
Escherichia coli 10 отсутствует
Shigella spp. 10 отсутствует
Salmonella spp. 10 отсутствует
Yersinia enterocolitica 10 отсутствует
Acinetobacter baumannii 20 100%
Аппельмана (на жидкой питательной среде при последовательных десятичных разведениях препарата от 10-1 до 10-8) составила 10-4-10-5, концентрация фаговых частиц методом Грация - 3,2 Х 105 - 3,4 Х 106.
Следующая серия опытов включала оценку специфичности действия препарата капельным методом (стоп-тест) в отношении 100 штаммов микроорганизмов различных видов, родов, семейств из производственной коллекции (таблица).
Результаты исследования позволили сделать вывод о высокой (100%) специфической активности препарата: бактериофаг лизировал только штаммы А. Ьаитаппп и не влиял на ростовые характеристики перечисленных в таблице тестируемых микроорганизмов.
Оценка фаголизабельности препарата была изучена нами в 2015 г. на 116 региональных штаммах микроорганизмов, циркулирующих в урологических, терапевтических, отоларингологических, сомато-психиатрических отделениях стационаров и выделенных от пациентов амбулаторного звена ЛО г. Перми. В их числе 53 изолята, выделенные в ОРИТ. Преимущественными местами локализации А. Ьаитаппп явились отделяемое ран - 28,4% и БАЛЖ - 20,6%. Из мочи идентифицировано 13,7% штаммов, из отделяемого зева - 11,8%, из носа - 4,0%, из уха -5,1%, дренажей - 0,9%, цервикального канала - 2,6%, кишечника - 1,7%, секционного материала - 6,0%, с объектов внешней среды - 5,2%.
Из 116 штаммов к цефоперазон/сульбактаму и поли-миксину были чувствительны 97,4±1,5%, тигециклину -87,0±3,1%. Существенно ниже оказался уровень чувствительности к амикацину - 59,4±4,6%, имипенему -52,2±4,6% и ципрофлоксацину - 33,6±4,3%. Низкой антибактериальной активностью характеризовался хлорам-феникол - 11,1±2,9%. Чувствительность А. Ьаитаппп, выделенных в ЛО г. Перми, к экспериментальной серии бактериофага в целом на момент определения составила 51,7±4,6% (рис. 2).
При этом изоляты из ОРИТ имели показатель чувствительности к бактериофагу 81,0%, на фоне чувствительности к амикацину - 47,0%, имипенему - 23,7%, ципрофлоксацину - 3,4%, хлорамфениколу - 1,7%.
Заключение и выводы
Таким образом, разработанная экспериментальная серия препарата бактериофага против А. Ьаитаппп показала высокий уровень литической и специфической активности. Перспективы дальнейшего использования препарата продиктованы высоким уровнем устойчивости возбудителей к антибиотикам, прежде всего в ОРИТ, где бактериофаг может быть использован с лечебной и профилактической целью, в т. ч. как средство биологической дезинфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акимкин В.Г. Актуальные направления научных исследований в области неспецифической профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Поликлиника. 2014. № 6. С. 6-9.
Akimkin V.G. Aktual'nye napravleniya nauchnyh issledovanij v oblasti nespecificheskoj profilaktiki infekcij, svyazannyh s okazaniem medicinskoj pomoshchi. Poliklinika. 2014. № 6. S. 6-9.
2. AL-Kadmy I.M.S., Salman I.M.A., Khazaal S.S. Molecular characterization of Acinetobacter baumannii isolated from Iraqi hospital environment Kadmy. New Microbes New Infect. 2017. № 3 (21). Р. 51-57.
3. Darvishi M. Virulence factors profile and antimicrobial resistance of Acinetobacter baumannii strains isolated from various infections recovered from immunosuppressive patients. Biomed Pharmacol J. 2016. № 9 (3).
4. Shamsizadeh Z., Nikaeen М., Esfahani B.N. et al. Detection of antibiotic resistant Acinetobacter baumannii in various hospital environments: potential sources for transmission of Acinetobacter infections. Environmental Health and Preventive Medicine. 2017. № 22. Р. 44.
5. Горбич Ю.Л., Карпов И.А., Кречикова О.И. Инфекции, вызванные Acinetobacter baumannii: факторы риска, диагностика, лечение, подходы к профилактике. Медицинские новости. 2011. № 5. С. 31-39.
Gorbich Ju.L., Karpov I.A., Krechikova O.I. Infekcii, vyzvannye Acinetobacter baumannii: faktory riska, diagnostika, lechenie, podhody k profilak-tike. Medicinskie novosti. 2011. № 5. S. 31-39.
6. Богомолова Н.С., Большаков Л.В., Кузнецова С.М. Проблема лечения гнойно-воспалительных осложнений, обусловленных Acinetobacter. Анестезиология и реаниматология. 2014. № 1. С. 26-32.
Bogomolova N.S., Bol'shakov L.V., Kuznecova S.M. Problema lecheniya gnojno-vospalitel'nyh oslozhnenij, obuslovlennyh Acinetobacter. Anestezi-ologiya i reanimatologiya. 2014. № 1. S. 26-32.
7. Горбич Ю.Л., Карпов И.А. Антибактериальная терапия инфекции, вызванной Acinetobacter baumannii. Здравоохранение. Минск. 2013. № 6. С. 68-73.
Gorbich YU.L., Karpov I.A. Antibakterial'naya terapiya infekcii, vyzvannoj Acinetobacter baumannii. Zdravoohranenie. Minsk. 2013. № 6. S. 68-73.
8. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. Приказ Минздрава СССР от 22.04.1985. № 535.
Ob unifikacii mikrobiologicheskih (bakteriologicheskih) metodov issledo-vaniya, primenyaemyh v kliniko-diagnosticheskih laboratoriyah lechebno-pro-filakticheskih uchrezhdenij. Prikaz Minzdrava SSSR ot 22.04.1985. № 535.
9. http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/ QC/v_8.0_EUCAST_QC_tables_routine_and_extended (дата обращения 04.01.2018).
10. МУК 4.2.1890-04. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: утв. Глав. гос. санит. врачом Рос. Федерации: введ. в действии с 04.03.04. - Москва: Минздрав России, 2004.- 75 с.
MUK4.2.1890-04. Metodicheskie ukazaniya po opredeleniyu chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam: utv. Glav. gos. sanit. vrachom Ros. Federatsii: vved. v dejstviis 4.03.04. - Moskva: MinzdravRossii, 2004.- 75s.
11. http://www.antibiotic.ru/minzdrav/clinical-recommendations/ (дата обращения 10.10.2017).
12. Адамс М. Бактериофаги / пер. с анг. под. ред. А.С. Кривинского. М. 1961. 527 с.
Adams M. Bakteriofagi/per. sang. pod. red. A.S. Krivinskogo. M. 1961.527s.
13. Захарова Ю.А., Фельдблюм И.В. Сравнительная характеристика микрофлоры, выделенной из очагов гнойно-септических инфекций с множественными и единичными случаями. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009. № 5. С. 16-21.
Zakharova J.A., Fel'dblyum I.V. Sravnitel'naya harakteristika mikroflory, vydelennoj iz ochagov gnojno-septicheskih infekcij s mnozhestvennymi i edinichnymi sluchayami. EHpidemiologiya i infekcionnye bolezni. 2009. № 5. S. 16-21. \
