CC BY
142
УДК 616.89-008.485:575.8 ББК 56.14
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА РАССТРОЙСТВ АУТИСТИЧЕСКОГО СПЕКТРА
Т.В. ДОКУКИНА, ГУ РНПЦ психического здоровья, Минск, Республика Беларусь С.А. МАРЧУК, ГУ РНПЦ психического здоровья, Минск, Республика Беларусь И.В. ГАЙДУКЕВИЧ, ГУ РНПЦ психического здоровья, Минск, Республика Беларусь Г.В. СЕРГЕЕВ, ГУ РНПЦ психического здоровья, Минск, Республика Беларусь e-mail: Polak0208@mail.ru, Mar4ellini@yandex.ru
Аннотация
В статье представлены результаты молекулярно-генетического исследования расстройств аутистического спектра (РАС), целью которого являлось изучение роли полиморфизма генов металлотионеина (МТ3) в патогенезе аутистических расстройств.
Было проведено клиническое, патопсихологическое и молекулярно-генетическое обследование семей, в которых имеются дети с РАС и здоровые дети, не имеющими нарушений психического и физического развития. Разработана методика молекулярно - генетического исследования с проведением клинико-генетических корреляций и определением генетических маркеров. Сконструированы олигонуклеотидные праймеры для генотипирования. Создана электронная база данных, куда занесены результаты проведенных клинического и молекулярно-генетического исследований. Полученные в результате молекулярно-генетического исследования и проведения клинико-генетического сопоставления данные указывают на взаимосвязь SNP rs45570941 во втором интроне гена MT3 (G>C) с частотой развития РАС у детей в возрасте от 2 до 14 лет. Таким образом, изменения в структуре гена МТ3 и, как следствие, нарушенное функционирование белка металлотионеина, являются одними из важных этиопатогененических факторов развития аутистических расстройств. Диагностика наличия мутаций (G/C генотип) в SNP rs45570941 во втором интроне гена MT3 направлена на установление предрасположенности к развитию аутистических расстройств, а также нарушений функционирования иммунной системы, желудочно-кишечного тракта и микроэлементного статуса ребенка.
Ключевые слова: Аутизм, расстройства аутистического спектра, молекулярно-генетическаядиагностика, металлотионеин, МТ3.
Актуальность. Проблема аутизма является одной из наиболее актуальных в области детской психиатрии. Это объясняется как высокой частотой развития этих состояний, так и определенными трудностями своевременной диагностики и отсутствием детально разработанной системы специализированной помощи, что не может не привести к инвалидизации детей с аутистическими расстройствами.
Согласно современным представлениям, "аутизм" - это расстройство, которое обычно проявляется в течение первых трех лет жизни ребенка, характеризуется всесторонним дефицитом социального взаимодействия и общения различной степени выраженности, а также ограниченными интересами и повторяющимися (стереотипными) действиями. Для таких детей характерны эмоциональная и
поведенческая отгороженность, дефицит общения, "погружение в себя", поглощенность однообразной деятельностью, "уход" в свой мир, самый примитивный, на уровне моторных стереотипий. Расстройства, для которых характерны вышеописанные признаки и симптомы, но различной степени выраженности и имеющие свои особенности, относятся к расстройствам аутистического спектра (РАС)1.
В большой степени развитие аутизма связано с генами, однако генетика аутизма сложна и неясно, что оказывает превалирующее влияние
1 Башина В.М. Современные подходы к проблеме детского и атипичного аутизма / В.М. Башина, Н.В. Симашкова // Материалы конгресса по детской психиатрии, Москва. 2528 сентября, 2001г. - С.28.
на появление расстройств аутистического спектра - взаимодействие множества генов либо редкие мутации, имеющие сильный эффект2. Сложность обусловлена
многосторонними взаимодействиями большого количества генов, внешней среды и эпигенетических факторов, которые сами по себе не меняют код ДНК, однако могут наследоваться и модифицировать экспрессию генов3.
В ходе ранее проведенного нами исследования микроэлементного статуса детей с РАС и их родителей было установлено, что у каждого обследованного наблюдался дисэлементоз по содержанию цинка и меди либо в сторону дефицита, либо избыточного содержания4. Полученные нами данные сопоставимы с результатами исследований У. Уолша. Изучив анализы 503 пациентов с аутизмом в клинике, У. Уолш и его коллеги (2000) обнаружили, что 99% пациентов имели ненормальный метаболизм металлов, в частности, цинка и меди. Данные нарушения связаны с нарушением функции белка металлотионеина (МТ), выполняющего ряд важных функций в организме: защиты от токсичного действия тяжелых металлов и активных форм кислорода, поддержание гомеостаза цинка и меди, оказывает существенное влияние на развитие и функционирование иммунной системы, участвует в развитии нейронов мозга, предотвращает возникновению кишечных инфекций, участвует в развитии эмоциональной сферы и социализации.
Вследствие участия во всех этих жизненных функциях металлотионеина можно
предположить, что дефицит этого существенного белка может привести ко всем видам проблем в развитии ребенка. Наиболее вероятно существуют генетические нарушения, которые не манифестируются, пока система не испытывает перегрузку. Это может быть
2 Abrahams BS, Geschwind DH (2008). «Advances in autism genetics: on the threshold of a new neurobiology». Nat Rev Genet 9 (5): 341 -55.
3 London E (2007). «The role of the neurobiologist in redefining the diagnosis of autism». Brain Pathol 17 (4): 408 -11.
4 Марчук, С.А. О роли дисбаланса макро- и микроэлементов развитии расстройств аутистического спектра / С.А. Марчук, Т.В. Докукина// Вес. Смол. гос. мед. ак-мии 2013 / Смоленск, 25 апреля 2013. - С. 162.
вызвано вакцинами, бактериальной или вирусной инфекциями и т.д. Неблагоприятное воздействие среды во внутриутробном периоде, грудном периоде или в раннем детстве может нарушить систему металлотионеина, результатом чего будет замедленное или приостановленное развитие нейронов и возможное начало аутизма.
Металлотионеины представляют собой белки, участвующие в развитии антиоксидантного ответа и связывании ионов металлов. МТ состоит из 60 - 70 аминокислот и 7 атомов цинка. Металлотионеины - это богатые цистеином низкомолекулярные протеины с плейотропными функциями. В настоящий момент у человека известно 4 класса металлотионеинов, насчитывающие 16 изоформ. Металлотионеины имеют
молекулярную массу до 6-7 кДа и способны связывать широкий спектр металлов, в том числе и токсичных (РЬ, Cd). Металлы индуцируют экспрессию этих белков в различных тканях (мозг, печень, миокард и т.д.). Помимо металлов, металлотионеины индуцируются стероидами, канцерогенами, химическими веществами, вызывающими окислительный стресс, ионизирующей радиацией и ультрафиолетовым облучением.
В настоящее время выделяют гены четырех подсемейств металлотионеина: МТ-1 и МТ-2 экспрессируются в различных органах и тканях, экспрессия МТ-3 преобладает в головном мозге; МТ-4 - в базальном слое эпителия. Все гены расположены на отдельной хромосоме, а именно хромосоме 16 у человека.
Главной биологической особенностью МТ является индукция их синтеза рядом агентов и условий. Индукция МТ вызывается множеством разных факторов: свободными радикалами, тяжелыми металлами, гамма-излучением, УФ-излучением, радиацией, цитокинами острой фазы interleukin-1, interleukin-6, tumor necrosis factor, воспалительными агентами, такими как липополисахариды (inflammatory agents such as lipopolysaccharide (LPS)), алкилирующими агентами.
При поступлении токсического агента индукция металлотионеина наблюдается в первую очередь в печени, причем там синтезируются изоформы МТ-1, МТ-2. Однако, и другие клетки и ткани, включая лимфоциты, моноциты, и лимфоидные ткани, например тимус, могут также синтезировать
металлотионеины при адекватном
стимулировании. МТ-3 индуцируется в мозге в ответ на окислительный стресс, синтез МТ-4 выражен преимущественно в слоистом сквамозном эпителии.
Таким образом, имеется достаточно информации о структуре гена МТ. Однако, данных о влиянии полиморфизма гена, кодирующего данный белок, и изменений в структуре данного белка на развитие предрасположенности к аутистическим расстройствам не имеется.
Поскольку металлотионеины играет важную роль в регуляции баланса меди и цинка у здоровых людей, тот факт, что у большинства детей с аутизмом, обследованных на базе РНПЦ психического здоровья и в Пфейффер-центре, обнаружен дисбаланс меди и цинка, подтверждает, что дисфункция МТ является важной частью патологии при аутизме. Сочетания генетического дефекта,
нарушающего функцию металлотионеина, и неблагоприятного воздействия среды в ранний период жизни, приводит к прекращению функционирования этого белка. Полученные результаты позволяют предположить возможную роль изменений в структуре гена металлотионеина как этиопатогененического фактора развития РАС и дисэлементозов как симптомов данной патологии.
Для подтверждения гипотезы в 2013-2015 гг. на базе РНПЦ психического здоровья и института биоорганической химии НАН РБ было проведено молекулярно-генетическое исследование детей с аутистическими расстройствами.
Цель исследования - изучить роль полиморфизма генов металлотионеина (МТ) в патогенезе различных клинических вариантов расстройств аутистического спектра (РАС).
Материалы и методы исследования. Объектом исследования являлись дети с расстройствами аутистического спектра (РАС) и здоровые дети, не имеющие нарушений психического и физического развития, в возрасте от 2 до 14 лет, родившиеся и проживающие на территории Республики Беларусь, а также их родители. Дополнительные критерии включения в исследовательскую группу: отсутствие любых сопутствующих заболеваний, подписанное "информированное согласие" на участие в проекте. Изучались: история развития ребёнка, специфика психического и речевого развития.
Нозологическая диагностика проводится в соответствии с унифицированными
стандартными методами клинико-
патопсихологического, функционального и лабораторного исследований и установлением диагноза по МКБ-10.
В процессе выполнения задания проведено клиническое, патопсихологическое,
нейрофизиологическое и молекулярно-генетическое обследование 108 семей: 81 семьи, в которых имеется ребенок с РАС в возрасте от 2 до 14 лет, и 27 семей со здоровыми детьми, не имеющими нарушений психического и физического развития. Дети с аутизмом и их родители составили основные группы исследования. Здоровые дети и их родители включены в группы сравнения.
Методы диагностики и дополнительные исследования включали: комплексное клиническое обследование - объективный осмотр, сбор анамнестических сведений, тщательное клинико-лабораторное,
функциональное и инструментальное обследование, консультации узкими
специалистами; психолого-психиатрическое обследование - шкала CARS (Children Autistic Rating Scale, Шоплер, 1980); шкалы TEACCH-PEP (Psychoeducational Profile, Шоплер, 1979); Опросник анализа семейных взаимоотношений (АСВ); нейрофизиологическое обследование -визуальная и компьютерная ЭЭГ (регистрация осуществлялась на 19-канальном
электроэнцефалографе фирмы "Мицар" в монополярном с раздельными ушными электродами отведении, с последующей обработкой данных в режимах
периодометрического и спектрального анализа).
Результаты и их обсуждение. Разработана методика молекулярно - генетического исследования. В качестве биологического материала использовался буккальный эпителий. Методика забора буккального эпителия исключала прием пищи в течение 3-х часов. За 1 час до забора биологического материала каждый обследованный выполнял тщательное полоскание полости рта водой. Забор буккального эпителия производился соскобом клеток с внутренней стороны щеки разовым зондом с синтетическим ворсом. Далее в пробирку помещалась рабочая часть зонда. До доставки в лабораторию материал хранился при температуре -20°C.
Забор материала для исследования проводился на базе клинико-диагностической лаборатории, детского общепсихиатрического отделения стационара РНПЦ психического здоровья, психоневрологического отделения РНПЦ оториноларингологии. Молекулярно-генетические исследования проводились на базе Института биоорганической химии Национальной академии наук Республики Беларусь. В работе задействованы современные методы молекулярно-генетического анализа: полимеразная цепная реакция, секвенирование и др. Образцы анализировались с помощью амплификации участка гена MT3 и последующего рестрикционного анализа с использованием BamHI эндонуклеазы. В случае гомозиготы G/G (доминантный тип) на электрофорезе присутствовали только полосы длиной 164 и 225 п.н., в случае гетерозиготы G/C - полосы диной 389, 225 и 164 п.н., а при гомозиготе С/С (рецессивный тип) только полоса длиной 389 п.н. Следует отметить, что образцы с неясной рестрикционной картиной реамплифицировали и повторно подвергали рестрикционному анализу. Ряд образцов анализировали секвенированием, чтобы подтвердить полученные результаты рестрикции.
Сконструированы олигонуклеотидные
праймеры для генотипирования. Произведено выделение нуклеиновых кислот из образцов буккального эпителия. Идентифицированы экстрагированные соединения с
использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Для последующей обработки биологического материала и проведения полимеразной цепной реакции и секвенирования использованы праймеры на основе референсной последовательности из базы данных NCBI с регистрационным номером NC_000016 (участок 16 хромосомы).
Полученные результаты генотипирования представлены в таблице.
У 64 (79%) обследованных детей с РАС отмечались мутации в SNP rs45570941 во втором интроне гена MT-3. Из них 50 (61,7%) детей с аутистическими расстройствами имели генотип G/C, а у 14 (17,3%) детей отмечался генотип С/С, что свидетельствует о полной замене аллельного участка гена. В 47 (73,4%) семьях выявленные мутации отмечались как у детей с аутистическими расстройствами, так и у их родителей. В 17 (26,6%) семьях мутации
отмечались только у ребенка с РАС. При генотипе G/C не секвенограмме детектировались два пика одинаковой интенсивности в месте локализации искомого SNP (рисунок 1).
Таблица.
Результаты выявления мутации в ЗКГ ге45570941 во втором интроне гена MT3 в исследуемых группах детей
"т Т X С С i А т С С т С т с Â с т
Рисунок 1. Изображение секвенограммы участка интрона 2 гена МТ3 в месте локализации ге45570941
(выделен черным) при генотипе в/С
С с С Т Т А С С | А Т С С Т
Рисунок 2. Изображение секвенограммы участка интрона 2 гена МТ3 в месте локализации SNP rs45570941 (выделен черным) при генотипе G/G
Среди детей, не имеющих нарушений психического и физического развития, мутация в установленном SNP ге45570941 не была установлена ни в одном случае. Также мутация
Группы обследованных Отсутствие мутации Наличие мутации
Дети с РАС 17 (21%) детей 64 (79%) детей
G/G генотип G/C генотип С/С генотип
17 (21%) детей 50 (61,7%) детей 14 (17,3%) детей
Здоровые дети 27 (100%) детей Не отмечались
в искомом SNP не была выявлена у 15% обследованных детей с РАС. В случае присутствия генотипа G/G, детектировался один пик на секвенограмме (рисунок 2).
Выводы. Полученные в результате молекулярно-генетического исследования и проведения клинико-генетического
сопоставления данные указывают на взаимосвязь SNP rs45570941 во втором интроне гена MT3 (G>C) с частотой развития РАС у детей в возрасте от 2 до 14 лет.
Таким образом изменения в структуре гена МТ3 и, как следствие, нарушенное функционирование белка металлотионеина, являются одними из важных
этиопатогененических факторов развития различных клинических вариантов расстройств аутистического спектра. Предложенный метод молекулярно-генетической диагностики
предрасположенности к развитию РАС может быть использован в качестве инструментария для ранней диагностики аутистических расстройств. Диагностика наличия мутаций генотип) в SNP ге45570941 во втором интроне гена MT3 направлена на установление предрасположенности к развитию
аутистических расстройств, а также нарушений функционирования иммунной системы, желудочно-кишечного тракта и
микроэлементного статуса ребенка.
Список литературы
1. Башина В.М. Современные подходы к проблеме детского и атипичного аутизма /В.М. Башина, Н.В. Симашкова // Материалы конгресса по детской психиатрии, Москва. 25-28 сентября, 2001г. - С. 28.
2. Марчук С.А. О роли дисбаланса макро- и микроэлементов развитии расстройств аутистического спектра / С.А. Марчук, Т.В. Докукина//Вес. Смол. гос. мед. ак-мии 2013 / Смоленск, 25 апреля 2013. - С. 162.
MOLECULAR GENETIC DIAGNOSIS OF AUTISM SPECTRUM DISORDERS
T.V. DOKUKINA, RSPC of Mental Health, Minsk, Republic of Belarus S.A. MARCHUK, RSPC of Mental Health, Minsk, Republic of Belarus I.V. GAYDUKEVICH, RSPC of Mental Health, Minsk, Republic of Belarus G.V. SERGEEV, RSPC of Mental Health, Minsk, Republic of Belarus
Abstract
The results of molecular genetic studies of autism spectrum disorders (ASD), the purpose of which was to investigate the role of polymorphisms of genes metallothionein (MT 3) in the pathogenesis of autism spectrum disorders, presented in the article.
Clinical, pathopsychological and molecular genetic study of families with children with ASD and healthy children who do not have disorders of mental and physical development carried out. Methods of molecular - genetic research to conduct clinical and genetic correlations and determining the genetic markers developed. Oligonucleotide primers were are constructed for genotyping. The electronic database, which listed the results of the clinical and molecular genetic studies established. Data obtained as a result of the molecular genetic studies and clinical and genetic comparisons indicate the relationship SNP rs45570941 in the second intron of MT3 gene (G> C) with the incidence of ASD in children aged 2 to 14 years.
Thus, changes in the structure of the gene and MT3 consequently impaired functioning metallothionein protein, are among the important factors in the development of autistic disorder. Diagnosis of the presence of mutations (GC genotype) at SNP rs45570941 in the second intron of MT3 gene is aimed at establishing a predisposition to the development of autism spectrum disorders, and disorders of the immune system, gastrointestinal tract and microelement status of the child.
Keywords: Autism, autism spectrum disorders, molecular genetic diagnosis, metallothionein, MT3.
