Молекулярная идентификация изолятов anaplasmamarginale, обнаруженных в крови крупного рогатого скота на территории Московской области

Василевич Ф.И.; Ковальчук С.Н.; Бабий А.В.; Архипов А.В.; Архипова А.Л.; Глазко Т.Т.; Косовский Г.Ю.

УДК 619:616.993.192.6 DOI:

Поступила в редакцию: 08.12.2016 Принята в печать: 10.03.2017

Для цитирования:

Василевич Ф. И., Ковальчук С. Н., Бабий А. В., Архипов А. В., Архипова А. Л., Глазко Т. Т., Косовский Г. Ю. Молекулярная идентификация изолятов Anaplasma marginale, обнаруженных в крови крупного рогатого скота на территории Московской области // Российский паразитологический журнал. - М., 2017. -Т. 40, Вып. 2. - С.

For citation: Vasilevich F.I., Kovalchuk S.N., Babiy A.V., Arkhipov A.V., Arkhipova A.L., Glazko T.T., Kosovskiy G.Yu. Molecular identification of isolates Anaplasma marginale found in blood of cattle on the territory of Moscow region. // Russian Journal of Parasitology, 2017, V. 40, Iss.2, pp.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИЗОЛЯТОВ Anaplasma marginale, ОБНАРУЖЕННЫХ В КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ТЕРРИТОРИИ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

1 2 2 2 Василевич Ф. И. , Ковальчук С. Н. , Бабий А. В. , Архипов А. В. , Архипова А.

Л.2, Глазко Т. Т.2, Косовский Г. Ю.2

1 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина, 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23 Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, 127422, Москва, ул. Костякова, д. 12, стр.4, e-mail: info-ceerb@mail.ru

Реферат

Цель исследования - выявить и идентифицировать с помощью молекулярно-генетических методов изоляты Anaplasma marginale, циркулирующие на территории Московской области.

Материалы и методы. Образцы крови крупного рогатого скота были отобраны в 2015 г. на территории Московской области. ДНК выделяли из цельной крови с помощью набора Sorb-M. Выявление животных, инфицированных A. marginale, и оценку уровня паразитемии проводили методом ПЦР в реальном времени, разработанным нами ранее. Типирование штаммов A. marginale осуществляли на основе метода с модификацией в части структуры праймеров.

Полученные фрагменты гена были клонированы в клетках Escherichia соМ. Поиск целевых рекомбинантных клонов E. coli проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом продуктов реакции электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле.

Результаты и обсуждение. Показано, что семь из тридцати исследованных животных являлись носителями A. marginale с уровнем паразитемии в пределах 3,6 х 103-5,4 х 105 на 1 мл крови. Типирование обнаруженных изолятов на основе нуклеотидных последовательностей гена msp4 выявило их принадлежность к двум уже известным генотипам. Полученные результаты могут быть использованы при проведении эпидемиологического мониторинга анаплазмоза на территории Московской области, а также учитываться при разработке вакцин.

Ключевые слова: анаплазмоз, Anaplasma marginale, крупный рогатый скот, ПЦР, паразитемия, генотипирование.

Введение

Риккетсия Anaplasma marginale (отряд Шске1Ма1е8, семейство Лпар1а8ша1аееа) - облигатный внутриэритроцитарный паразит, возбудитель анаплазмоза крупного рогатого скота. Анаплазмоз у крупного рогатого скота протекает с признаками лихорадки, анемии, атонии желудочно-кишечного тракта и истощения [3]. Анаплазмоз приносит значительный экономический ущерб животноводческим хозяйствам вследствие потерь молочной и мясной продуктивности и гибели скота - летальность при анаплазмозе может достигать 100 % [5, 17]. Источником возбудителя являются инфицированные животные, переносчиками - около 20 видов клещей и кровососущие насекомые [15]. Возможна также механическая передача возбудителя от зараженных животных к здоровым через нестерильные инструменты при проведении зоотехнических мероприятий [1].

Анаплазмоз крупного рогатого скота зарегистрирован во многих тропических и субтропических странах; эндемичен для Мексики, Центральной и Южной Америки, Карибских островов, Африки и Азии [5, 12]; распространен фактически по всей территории США, а также в некоторых странах Европы, главным образом средиземноморских [10]. Случаи заболевания крупного рогатого скота анаплазмозом зарегистрированы на территории Украины, Белоруссии, Молдовы, Казахстана, государств Средней Азии и Закавказья. В Российской Федерации неблагополучными по анаплазмозу согласно ветеринарной отчетности являются субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского ФО [2, 4].

К настоящему времени установлены полные последовательности геномов четырнадцати, преимущественно американских, изолятов A. marginale [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/404]. Для A. marginale характерен небольшой размер генома (около 1,2 Mb), что является результатом регрессивной эволюции и типично для внутриклеточных паразитов [16]. Сравнительный анализ геномов A. marginale показал, что число однонуклеотидных полиморфизмов между разными штаммами варьирует от 0,20 до 0,58 % генома [7].

Для оценки генетической вариабельности изолятов и штаммов A. marginale был предложен метод сиквенс-типирования по генам белков внешней мембраны mspla и msp4 [8, 9]. Показано, что для гена mspla характерна высокая скорость мутирования в пределах даже одного штамма, поэтому его используют для выявления генетического разнообразия изолятов A. marginale [11, 14]. Наиболее подходящим маркером для геногеографических исследований изолятов и штаммов A. marginale является ген msp4 [8]. На его основе был разработан метод сиквенс-типирования [8], с помощью которого на сегодняшний день идентифицировано 110 изолятов A. marginale, большинство из которых было обнаружено на территории Мексики и США

[http://www.ncbi.n1ш.nih.gov/nuccore/?terш=Лnap1asшa+шargina1e+шsp4+coшp1ete].

Подобные исследования в России до настоящего времени не проводились.

Цель наших исследований - с помощью молекулярно-генетических методов выявить и идентифицировать изоляты A. marginale, циркулирующие на территории Московской области.

Материалы и методы

Образцы крови крупного рогатого скота были отобраны в мае 2015 г. на территории Московской области. ДНК выделяли из цельной крови животных с помощью набора Sorb-M. Выявление животных, инфицированных A. marginale, и оценку уровня паразитемии проводили методом ПИР в реальном времени, разработанным нами ранее [6].

Типирование штаммов A. marginale осуществляли на основе метода [8] с модификацией в части структуры праймеров, амплификацию гена msp4 - с помощью набора реактивов FastStartHiFi PCR System, праймеров MSP4phyl-D: 5'-ATGAATTACAGAGAATTGTTTAC-3' и Msp4phyl-R: 5'-

TTAGCTGAACAGGAATCTTGC- 3' в концентрации 0,5 мкМ каждого и 3 мкл ДНК, выделенной из крови инфицированных животных, ПЦР - при следующих условиях: начальная денатурация в течение 2 мин при 95 °С; 45 циклов (15 с при 95 °С, 15 с при 62 °С, 40 с при 72 °С).

Полученные фрагменты гена msp4 длиной 849 п. н. были клонированы в клетках Escherichia coli XL-blue с помощью набора реактивов CloneJET™. Поиск целевых рекомбинантных клонов E. coli проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом продуктов реакции электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле, очистку плазмидной ДНК - с использованием набора GeneJET Miniprep Kit, секвенирование плазмид - в обоих направлениях по методу Сэнгера с помощью набора ABI Prism Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit и праймеров М13 согласно рекомендациям изготовителя.

Поиск гомологов полученных нами последовательностей гена msp4 проводили с помощью программы BLASTN

[https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi].

Результаты и обсуждение

С целью выявления изолятов A. marginale, циркулирующих на территории Московской области, были получены и исследованы методом ПЦР в реальном времени тридцать образцов ДНК, выделенной из цельной крови голштинизированного черно-пестрого крупного рогатого скота одного из животноводческих хозяйств Московской области. По результатам исследования семь из тридцати животных (23,3 %) оказались анаплазмоносителями. Была проведена количественная оценка уровня паразитемии методом, описанным нами ранее [6], результаты которой приведены в таблице. Уровень паразитемии у

3 5

исследованных животных находился в пределах от 3,6 х 10 до 5,4 х 10 анаплазм в 1 мл крови.

Таблица 1

Результаты количественной оценки уровня паразитемии _ у инфицированных животных_

№ образца Титр A. marginale (число клеток A. marginale в 1 мл крови)

1 5,43 х 105

2 8,33 х 104

3 6,53 х 104

4 3,01 х 104

5 4,83 х 105

6 4,53 х 103

7 3,55 х 103

Идентификацию выявленных изолятов A. marginale проводили на основе нуклеотидной последовательности кодирующего участка гена msp4 методом, описанным ранее [8] с модификацией структуры праймеров с учетом имеющихся на сегодняшний день в базе данных GenBank последовательностей гена msp4. Ампликоны длиной 849 п. н., полученные в результате ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК инфицированных животных, были клонированы в клетках E. coli, и по три клона для каждого ампликона были секвенированы в обоих

направлениях. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLASTN [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi] показал, что четыре из полученных семи ампликонов полностью идентичны гену msp4 изолята A. marginale 50 (G16) (GenBank accession no. EU315782.1), обнаруженному ранее на территории Венгрии [13]. Остальные три ампликона полностью идентичны гену msp4 штамма A. marginale Israeli non-tailed (accession no AY786993) и изолята 1.6 (GenBank accession no AY666006), обнаруженным ранее на территории Израиля и Зимбабве, соответственно.

Заключение

Молекулярно-генетическое типирование изолятов A. marginale, выявленных в крови крупного рогатого скота на территории Московской области, выявило изоляты, относящиеся к двум известным генотипам. Полученные результаты могут быть использованы при проведении эпидемиологического мониторинга анаплазмоза на территории Московской области, а также учитываться при разработке вакцин.

Литература

1. Василевич Ф. И., Белименко В. В., Гулюкин М. И., Георгиу Х. Практическое руководство по борьбе с кровепаразитарными болезнями домашних животных. - М.: ЗооВетКнига, 2015. - С. 86.

2. Георгиу Х., Белименко В. В. Современные лабораторные методы диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец // Рос. вет. журнал. С/х животные. - 2014. - № 3. - С. 31-32.

3. Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В., Христиановский П. И., Саруханян А. Р. Кровепаразитарные болезни домашних животных (Атлас). - М.: ЗооВетКнига, 2013. - С. 86.

4. Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) // Рос. вет. журнал. С/х животные. - 2013. - № 2. - С. 36-40.

5. Казаков Н. А. Минимальная заражающая доза возбудителей (A. marginale, A. ovis) при анаплазмозе КРС и овец критерий объективной оценки иммуногенных свойств противоанаплазмозных адьювантных инактивированных эмульгированных вакцин // Ветеринарная патология. - 2008. - № 2. - С. 68-70.

6. Ковальчук С. Н., Косовский Г. Ю., Архипов А. В., Глазко Т. Т., Глазко В. И. Разработка метода выявления Anaplasma marginale с использованием ПЦР в реальном времени // Сельскохозяйственная биология. 2015.- Т. 50, № 6. - С. 825831.

7. Dark M. J., Herndon D. R., Kappmeyer L. S., Gonzales M. P., Nordeen E., Palmer G. H. Conservation in the face of diversity: multistrain analysis of an intracellular bacterium. BMC Genomics, 2009, vol. 10, p.16.

8. Fuente J., Van Den Bussche R. A., Kocan K. M. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae). Veterinary parasitology, 2001, vol. 97, pp. 65-76.

9. Fuente J., Passos L. M., Van Den Bussche R. A., Ribeiro M. F., Facury-Filho E. J., Kocan K. M. Genetic diversity and molecular phylogeny of Anaplasma marginale isolates from Minas Gerais, Brazil. Vet. Parasitol., 2004, vol. 121 (3-4), pp. 307- 316.

10. Fuente J., Lew A., Lutz H., Meli M. L., Hofmann-Lehmann R., Shkap V. Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development. Anim. Health Res. Rev., 2005, vol. 6, pp. 75-89.

11. Fuente J., Rubial P., Mtshali M. S., Naranjo V., Shuqing L., Mangold A. J. Analysis of world strains of Anaplasma marginale using major surface protein 1a repeat sequence. Vet. Microbiol., 2006, vol. 119, pp. 382-390.

12. Guglielmone A. A. Epidemiology of babesiosis and anaplasmosis in South and Central America. Vet. Parasitol., 1995, vol. 57, pp. 109-119.

13. Hornok S., Foldvari G., Elek V., Naranjo V., Farkas R., de la Fuente J. Molecular identification of Anaplasma marginale and rickettsial endosymbionts in blood-sucking flies (Diptera: Tabanidae, Muscidae) and hard ticks (Acari: Ixodidae). J. Vet. Parasitol., 2008, vol. 154 (3-4), pp. 354-359.

14. Kocan K. M., Blouin E. F., Barbet A. F. Anaplasmosis control: past, present and future. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2000, vol. 916, pp. 501-509.

15. Kocan K. M., Fuente J., Blouin E. F., Coetzee J. F., Ewing S. A. The natural history of Anaplasma marginale. Vet. Parasitol., 2010, vol. 167, pp. 95-107.

16. Ogata H., Audic S., Renesto-Audiffren P., Fournier P. E., Barbe V., Samson D., Roux V., Cossart P., Weissenbach J., Claverie J. M., Raoult D. Mechanisms of evolution in Rickettsia conorii and R prowazekii. Science, 2001, vol. 293, pp. 20932098.

17. Wall D. T. Anaplasmosis control and diagnosis in South Africa. Ann N. Y. Acad. Sci., 2000, no 916, p. 474-83.

References

1. Georgiu Kh., Belimenko V.V. Modern laboratory methods for diagnostics of anaplasmosis in cattle and sheep]. Ros. vet. zhurnal [Russ. Vet. J.], 2014, no. 3, pp. 3132. (In Russian)

2. Gulyukin M.I., Zablotskiy V.T., Belimenko V.V., Khristianovskiy P.I.,

Sarukhanyan A.R. Kroveparazitarnye bolezni domashnikh zhivotnykh (Atlas) [Blood parasitic diseases of domestic animals (Atlas)]. M., Zoovetkniga, 2013. 86 p. (In Russian)

3. Gulyukin M. I., Zablotskiy V. T., Belimenko V. V. Monitoring of epizootic situation on protozoan blood parasitic diseases of domestic animals in Russian Federation (2007-2012). Ros. vet. zhurnal. S/h zhivotnye. [Russ. Vet. J. Farm Animals], 2013, no. 2, pp. 36-40. (In Russian)

4. Kazakov N. A. The highest infective dose of pathogenic agents (A. marginale, A. ovis) at anaplasmosis in cattle and sheep - objective assessment criteria of immunogenic properties of adjuvant inactivated emulsified anaplasmosis vaccines. Veterinarnayapatologiya [Veterinary pathology], 2008, no. 2, pp. 68-70. (In Russian)

5. Koval'chuk S. N., Kosovsky G. Yu., Arkhipov A. V., Glazko T. T., Glazko V. I. Development of real-time PCR for detection of Anaplasma marginale. Sel'skohozyaystvennaya biologiya [Agricultural biology], 2015, vol. 50, no 6, pp. 825831. (In Russian)

6.Vasilevich F. I., Belimenko V. V., Gulyukin M. I., Georgiu Kh. Prakticheskoe rukovodstvo po bor'be s kroveparazitarnymi boleznyami domashnikh zhivotnykh. [A practical guide on struggle against blood parasitic diseases of domestic animals]. M., ZooVetKniga, 2015, 86 p. (In Russian)

7. Dark M. J., Herndon D. R., Kappmeyer L. S., Gonzales M. P., Nordeen E., Palmer G. H. Conservation in the face of diversity: multistrain analysis of an intracellular bacterium. BMC Genomics, 2009, vol. 10, pp.16.