CC BY
33МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ. (Часть!) Введение. Современная этиологическая классификация вирусных гепатитов (ВГ) включает по меньшей мере 6 нозологических форм. Возбудители вирусных гепатитов (ВВГ), обладающие тропностью к клеткам печени человека, относятся к различным семействам вирусов и обозначаются буквами латинского алфавита:
вирус гепатита A (HAV) - сем. Picornaviridae, род Hepatovirus; вирус гепатита В (HBV) - сем. Hepadnaviridae, род Orthohepadnavirus; вирус гепатита С (HCV) - сем. Flaviviridae, род Hepacivints; вирус гепатита D (HDV) - не входит пи в одну из токсономических категорий, floating genus ("плавающий род") Deltavirus;
вирус гепатита Е (HEV) - в настоящий момент выведен из таксономической классификации в floating genus Hepatitis E-like viruses;
вирус гепатита G (HGV) - сем. Flaviviridae, род Hepacivirm.
В последнее десятилетие, благодаря развитию молекулярно-генетических методов исследований и их применению в вирусологии., убедительно показана гетерогенность популяций ВВГ, обусловленная значительной генетической вариабельностью, которая легла в основу современной классификации изолятов. Основываясь на проценте гомологии между нуклеотидными последовательностями геномов, вирусы гепатитов внутри родов подразделяют на генотипы, субтипы, изоляты и квазивиды в зависимости от особенностей каждого возбудителя.
Изоляты HAV подразделяют на 7 генотипов, которые обозначаются римскими цифрами от I до VII (Robertson B.H. et al., 1992). Генотипы вируса I, II, III и VII вызывают заболевание у человека, а генотипы IV, V VI - у обезьян. Различия между изолятами HAV, выделенными в различных регионах мира, по нуклеотидной последовательности геномной РНК составляют 1525% и 7,5% на уровне генотипов и субтипов соответственно. При этом аминокислотные последовательности изолятов HAV достаточно консервативны, что объясняет наличие всего одного серотипа данного ВВГ.
О гетерогенности популяции HBV стало известно еще в середине 70-х годов прошлого столетия, когда экспериментально серологическими методами было показано существование субтипов поверхностного антигена вируса - HBsAg. При этом была обнаружена одна общая детерминанта «а», которая в комбинации с 2 дополнительными детерминантами d/y и w/r образовывала 4 субтипа HBsAg: adw, ayw, adr, ayr. Позднее были описаны новые варианты детерминант, и общее количество субтипов достигло 9. На основе анализа нуклеотидных последовательностей S гена, изоляты HBV, выделенные в различных регионах мира, объединили в 8 основных генотипов, которые обозначили заглавными буквами латинского алфавита: А, В, С, D, Е, F, G и Н (Okamoto H. et all, 1988; Stuyver L. et al., 2000; Arauz-Ruiz P. et a., 2002). Следует отметить, что полного соответствия между генотипами HBV и серотипами HBsAg не установлено. Так, изоляты HBV, относящиеся к четырем совершенно разным генотипам А, В, С и F, могут иметь один и тот же серотип adw2 (Табл. 2).
Вирус гепатита С характеризуется самой высокой генетической вариабельностью генома среди ВВГ. Согласно наиболее употребляемой классификации, все изоляты HCV группируются в 6 главных генотипов, обозначаемых арабскими цифрами от 1 до б. Внутри каждого генотипа выделяют субтипы, которые включают изоляты, состоящие из квазивидов. На принадлежность изолята к определенному субтипу указывают прописные латинские буквы, которые пишутся вслед за арабской цифрой: НСVIa, HCVlb, HCVlc, HCV2a и т.д. В настоящее время известно более 100 субтипов HCV.
Изоляты HDV сгруппированы в 3 генотипа, обозначаемые римскими цифрами - I, II, III. Для HEV пока нет общепринятой классификации, разделяющей циркулирующие варианты на генотипы или субтипы. Однако показано, что выделенные во время вспышек изоляты возбудителя значительно отличаются друг от друга по нуклеотидным последовательностям их геномов. Изоляты HGV объединены в 4 генотипа, которые обозначаются, также как изоляты HCV, арабскими цифрами от 1 до 4 (MuerhoffA.S. et al., 1997).
Таким образом, популяции ВВГ насчитывают сотни генетических вариантов. В связи с этим, использование рутинных лабораторных методов диагностики ВВГ, основанных на
определении антигенов и антител, не может дать информацию об особенностях циркуляции различных вариантов ВВГ среди населения, о наличии связи между изолятами ВВГ, выделенными как от отдельных пациентов, так и групп пациентов, вовлеченных во вспышки инфекций, количество которых за последние годы значительно возросло. На эти вопросы позволяют ответить молекулярно-геиетические методы типирования изолятов ВВГ.
В России генетическое типирование изолятов ВВГ наиболее часто проводится с использованием методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР): ПЦР с тип-специфическими праймерами, либо PCR-RFLP (см. раздел 3). Данные методы позволяют дифференцировать только уже хорошо охарактеризованные гено/субтипы ВВГ, но не дают детальной подробной характеристики генома возбудителя. При этом изоляты, геномы которых имеют отличные, даже незначительно, генетические особенности от стандартных гено/субтипов, остаются не типируемыми. Таким образом, данные методы используются только для выявления основных циркулирующих генотипов ВВГ. Для изучения молекулярно-генетической характеристики каждого изолята ВВГ и генетических взаимоотношений между различными изолятами ВВГ используют наиболее информативный метод генетического типирования возбудителей - анализ нуклеотидных последова-тельностей их геномов (Cristina J etal.,2002).
В настоящее время молекулярно-генетические методы типирования ВВГ составляют основу молекулярной эпидемиологии вирусных гепатитов, которую можно определить как часть эпидемиологии, имеющей целью изучение циркуляции отдельных генетических вариантов возбудителей и их причинной связи с возникновением и распространением инфекционных заболеваний.
В последние годы в России стал достаточно широко использоваться метод ПЦР для диагностики многих инфекций. Поскольку ПЦР является основой методов генетического типирования возбудителей, есть основания полагать, что в ближайшее время молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов получит свое развитие в стране.
Предлагаемое пособие призвано восполнить недостаток информации при применении молекулярно-генетических методов для решения конкретных задач молекулярной эпидемиологии.
3.1, Молекулярно-генетические методы тнпнровапня изолятов.
В настоящее время разработаны несколько методов генетического типирования ВВГ, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР):
1) ПЦР с тип-специфическими праймерами;
2) гибридизация ПЦР-продуктов с тип-специфическими олигонуклеотидами;
3) анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции ПЦР-продуктов (PCR-RFLP);
4) прямое секвенирование ПЦР-продуктов.
В данном пособии описываются два последних метода, которые нашли широкое применение в молекулярной эпидемиологии вирусных гепатитов А, В и С во всем мире.
Все этапы исследования осуществляются в специализированных лабораториях, использующих для диагностики полимеразную цепную реакцию.
3.1.1. Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции продуктов полимеразной цепной реакции (PCR-RFLP).
Рис. 1. Схематическая иллюстрация постановки PCR-RFLP для геиотипирования ВВГ. В овалах приведены последовательно реакции, используемые при постановке PCR-RFLP. Реакция, отмеченная звездочкой, проводится только для РНК-с о держащих вирусов.
Исходным материалом для выделения геномной РНК HAV, РНК HCV или ДНК HBV служит сыворотка крови пациента. Кровь отбирают в стерильные, полистирольные пробирки и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Полученную сыворотку аликвотируют и хранят при -20° С.
Для выделения геномной РНК/ДНК ВВГ используют стандартный фенол-хлороформный метод выделения нуклеиновых кислот или коммерческие наборы, выпускаемые различными российскими и зарубежными фирмами.
При исследовании HAV и HCV выделенную из сыворотки крови тотальную РНК используют для постановки реакции обратной транскрипции, в результате которой на геномной РНК матрице синтезируется комплементарная ДНК (кДНК), которую можно хранить не более 30 дней при -20° С.
ПЦР проводят в режиме автоматической амплификации (термостат с программируемым термическим циклом) в пробирках для микропроб однократного применения объемом 0,5 мл. Для повышения чувствительности и контроля специфичности ПЦР проводят в две стадии (гнездная ПЦР) с внешними и внутренними праймерами соответственно. Для каждого ВВГ используют соответствующий набор праймеров с подобранным термальным профилем. Количество циклов может варьировать от 30 до 40.
Для оптимального разделения амплифицированных фрагментов ДНК или рестрицированных ПЦР-продуктов размером 100-2000 п.н. используют аппараты для электрофореза в горизонтальном геле. При этом следует подбирать такое напряжение
постоянного электрического тока, чтобы фронт красителя - бромфенолового синего (БФ), входящего в состав буфера для нанесения проб, проходил 1 см за 10 мин.
Реакцию рестрикции проводят в соответствии с прилагаемым к рестриктазе описанием на водяной бане или в термоциклере. Разделение фрагментов рестрикции в агарозном геле проводят немедленно. На рис. 2 и 3 представлены типичные результаты генотипирования методом RFLP HCV и ВГВ соответственно.
Рис. 2. Электрофореграмма (негатив) рестрикционных паттернов, полученных с помощью рестриктаз, BstUI (А) и BstNI (В), 2-ого PCR-продукта из 5'некодирующей области генома HCV: дорожки 1-7. М - маркер молекулярной массы. Из рис. А, анализируя размеры паттернов, можно сделать вывод о том, что данные изоляты принадлежат либо к генотипу 1Ь, либо к генотипу За. Затем, обратившись к рис. В, можно сделать окончательное заключение о генотипе изолятов: паттерны на дорожках 1-3 и 5-7 характерны для генотипа 1Ь, на дорожке 4 -для генотипа За.
Рис. 3. Электрофореграмма (позитив) рестрикционных паттернов, полученных с помощью рестриктаз, Ndell и Avail, 2-ого PCR-продукта из S области генома HBV, а также не обработанный рестриктазами 2-ой PCR-продукт. Размер паттернов на дорожке 1 соответствует генотипу С, на дорожках 2 и 3- генотипу D.
3.1.2. Определение нуклеотидпых последовательностей участков генома методом лимитированного секвенировапия. Для получения надежной информации о взаимоотношениях между различными изолятами ВВГ большое внимание следует уделять выбору секвенируемого участка генома. Данный участок должен быть достаточно вариабельным, чтобы обеспечить возможность дифференцировки различных изолятов одного и того же варианта ВВГ. Дополнительным фактором, определяющим выбор данного участка, является количество доступных в международном банке данных EMBL (GenBank www:) нуклеотидных последовательностей изучаемой области. В настоящее время в EMBL банк внесено небольшое количество полноразмерных нуклеотидных последовательностей всего генома ВВГ, но имеется огромное количество нуклеотидных последовательностей из различных участков геномов различных изолятов ВВГ.
Для постановки реакции секвенирования ПЦР-продукты очищают, используя коммерческий набор реагентов для очистки фрагментов ПЦР (GFX PCR DNA and Gel Band purification kit, Amersham Pharmacia Biotech) согласно прилагаемой инструкции. Реакцию секвенирования проводят, следуя инструкции, прилагаемой к набору для секвенирования BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kits (PE Biosystems, version 3.0), используя один из праймеров, работавших в ПЦР реакции. Термоциклер программируют, основываясь на
рабочей температуре праймера. Гель-электрофорез и чтение гелей проводят на автоматическом секвенаторе (ABI PRISM 377 или 310, Applied Biosystems).
3.1.3. Анализ нуклеотидных последовательностей геномов. Нуклеотидные последовательности читают, собирают и обрабатывают с помощью пакета программ LASERGENE (DNA STAR Inc., Madison, WI) или других аналогичных пакетов. Множественное выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных последовательностей из GenBank выполняют с помощью программы Clustal X.
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводят с помощью пакета программ PHYLIP версия 3.53 (Felsenstein A., 1993; Б.Вейр, 1995). Попарные генетические расстояния оценивают, используя двухпараметрический метод коррекции (Kimura's two parameter, программа DNASIST). Филогенетические деревья строят с помощью методов объединения ближайших соседей (neighbor-joining, программа NEIGHBOR) или невзвешенного парногруппового метода (UPGMA, программа NEIGHBOR). Обработку полученного филогенетического дерева выполняют с помощью программы TREEVIEW. Статистическую достоверность совпадения кластеров на филогенетическом дереве проверяют с помощью процедуры бутстрэшшга (bootstrap) как минимум па 500 повторах (программы SEQBOOT и CONSENSE). Значение бутстрэпипга >70 соответствует достоверности филогенетической группировки (кластеризации) при вероятности > 95% (р<0,05 и выше) (Б.Вейр, 1995).
3.2.1. Молекулярная эпидемиология гепатита А. За последние годы накоплено достаточно много данных о генетических вариантах HAV, циркулирующих в различных регионах мира. В таблице 1 суммированы материалы, дающие представление о географическом распространении различных генотипов вируса. Повсеместно превалирует I генотип HAV и его субтипы IA и IB. При этом наиболее часто от больных ГА выделяли изоляты, относящиеся к субтипу IA. Значительно реже обнаруживается циркуляция субтипа IIIA. Генотип VII был выявлен только в африканской стране Сьерра-Леоне.
Таблица №1
Географическое распространение генетических вариантов HAV
Континент Страна субтипы HAV
Европа Испания IB
Франция IA, IB, IIIA
Голландия IA, IB
Италия IA,IB
Германия IA
Азия Южная Корея IA
Япония IA
Америка Аргентина IA
Бразилия IA,IB
Куба IA
Коста-Рика IA
США IA, IB, IIIA
Панама IIIA
Уругвай IA
Африка Сьерра-Леоне VII
Южно-Африканская республика IA, IB
Австралия IB
На протяжении ряда лет в Санкт-Петербургском Институте имени Пастера совместно с Институтом национального здравоохранения Финляндии (Dr Martti Valle, Dr Irja Davidkin) проводилось изучение циркулирующих вариантов HAV на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области.
На основе филогенетического анализа все 34 российские изолята HAV, выделенные в период 1997-2002 гг., принадлежали к субтипу !Л. Внутри субтипа изоляты вируса группировались в 4 кластера: 1-4, что свидетельствовало о гетерогенности популяции HAV, циркулирующей на изучаемой территории, 28 из 31 изучаемых изолятов формировали два больших кластера: 1 и 2. При этом кластер N2 состоял только из изолятов HAV, выделенных в период 1999-2002 гг. в Санкт-Петербурге и Ленинградской области. Тогда как в кластер N1, наряду с изучаемыми изолятами, выделенными в период 1999-2002 гг. входили два российских изолята, выделенных в 1996 г., а также два изолята, выделенных на территории СССР в 1983 и 1987 гг. Эти два кластера вместе с небольшим кластером N3, включающим российские и финские изоляты HAV, формировали отдельную ветвь на филогенетическом дереве, указывая на генетическое отличие российских изолятов от европейских. Важно отметить, что изоляты, выделенные в Санкт-Петербурге в 1997-1998 гг., когда отмечалась очень низкая заболеваемость гепатитом А, не группировались с изолятами, выделенными в 1999-2002 гг. когда отмечался период эпидемического роста заболеваемости. Эти данные в определенной мере поддерживают гипотезу о формировании эпидемических штаммов HAV, которые могут распространяться более интенсивно, вызывая рост заболеваемости.
Другим важным заключением, которое можно сделать на основе филогенетического анализа, является вывод о происхождении изолята вируса, вызвавшего заболевание у пациента. Например, изолят HAV субтипа ]Л, Fin-3-2002, выделенный в 2002 г. от больного ГА в Финляндии - стране с очень низким уровнем заболеваемости ГА, в основном, связанным с заносом возбудителя из других регионов мира, был идентичен изолятам, активно циркулирующим в Санкт-Петербурге на протяжении 2000-2002 гг. Учитывая то, что данные изоляты входят в отдельный кластер, сформированный только изолятами HAV, характерными для Санкт-Петербурга и Ленинградской области, можно сделать заключение, что пациент из Финляндии был инфицирован ГА именно в этом городе. Эпидемиологическое расследование показало, что этот пациент посещал Санкт-Петербург в пределах инкубационного периода заболевания.
Однако не всегда можно сделать однозначное заключение о происхождении изолятов вируса только на основе филогенетического анализа. Например, рассмотрим изоляты БШ-12-2000 и RUS-2-2000 идентичные между собой. То, что изолят, выделенный в 2001 г. в Санкт-Петербурге, RUS-6-2001, также идентичен этим двум изолятам не может свидетельствовать о том, что данный вариант вируса изначально циркулировал па территории Санкт-Петербурга, и пациент из Финляндии был инфицирован именно в этом городе. С равной вероятностью пациент из Санкт-Петербурга мог быть инфицирован па территории Финляндии и привести данный вариант вируса в Санкт-Петербург. Это вытекает из того, что эти три изолята входят в небольшой кластер N3, который не включает большинство изолятов, циркулирующих в Санкт-Петербурге в этот период (кластер 1 и 2), а состоит как из российских, так и финских изолятов HAV. В данном случае можно сделать следующие предположения: (1) наличие общего источника заражения; (2) один из пациентов послужил источником инфекции для другого. Окончательное заключение может дать лишь детальное эпидемиологическое расследование. С.Л.Мукомолов, О.В.Калинина, Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.
СОВРЕМЕННЫЙ ПОДХОД к ВЫБОРУ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СРЕДСТВ в ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОМ УЧРЕЖДЕНИИ. В последнее время резко возросло значение проблемы внутрибольничных инфекций для здравоохранения всех стран, вне зависимости от уровня экономического развития.
По данным официальной статистики в России ежегодно регистрируется до 60 тысяч случаев внутрибольничного инфицирования. Реальные цифры в 40-50 раз превышают эти данные. Минимальный экономический ущерб, наносимый ВБИ ежегодно, по мнению экспертов, составляет 5 млрд. рублей [Концепция профилактики внутрибольничных инфекций, утвержденная 06.12.1999 г. МЗ РФ.-М.:1999].
