CC BY
17МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ. (Часть 2)
Молекулярная эпидемиология гепатита В. К настоящему времени накоплен обширный банк пуклсотидпых последовательностей геномов изолятов который постоянно пополняется
новыми вариантами вируса. Обнаружено, что различные генотипы HBV циркулируют па определенных, достаточно крупных географических пространствах (Табл. 2). Генотип А превалирует и Северной Европе, США и Южной Африке. Генотипы В и С, в основном, цпркулприруют в Юго-Восточной Азии. Генотип D называют средиземноморским, поскольку он особенно часто встречается в странах Средиземного моря. Генотип G встречается в США и Франции. Генотип Е обнаружен лишь в странах Западной Африки, а генотип F - практически только в Южной и Центральной Америке. В этом же регионе недавно описан новый генотип Н (Arauz-Ruiz P С al., 2002).
Таблица 2.
Географическое распространение генотипов HBV
Генотип I-IBV Ссротип Географический регион
А adw2 Северо-Запад Европы, Южная Африка, США
ау^ Центральная Африка
В adw2 Индонезия, Китай
aywl Вьетнам
С adw2 Восточная Азия
adrq-+ Южная Корея. Китай, Япония
аёщ- Полинезия
ауг Вьетнам
Б ayw2 Средиземноморье
ayw3 Индия
ayw4 Ближний и Средний Восток
Е ayw4 Западная Африка
F adw4 Центральная и Южная Америка
adw2 Южная Америка
ayw4 Центральная и Южная Америка
G adw2 США, Франция
И adw4 Никарагуа, Мексика, Калифорния
В Санкт-Петербургском Институте им. Пастера в течение ряда лет проводится изучение генотипов HBV методами PCR-RFLP и секвеппровапия ограниченных участков генома вируса. Использование этих методов позволило установить, что в Санкт-Петербурге доминирует генотип D HBV (более 95%). Другая независимая группа исследователей из НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург) выявила ту же закономерность (Морозов В.М. с соавт., 2002). Дополнительно к генотипу D в городе были обнаружены нзоляты HBV, принадлежащие к генотипам А (7,6%) и С (1,7%), Изоляты HBV генотипа С выявлены только среди выходцев из Юго-Восточной Азии, приехавших в Санкт Петербург относительно недавно. Учитывая, что генотип С является доминирующим в Юго-Восточной Азии, можно сделать заключение о выявлении возможного пути проникновения данного генотипа в популяцию города через выходцев из ТОго-Восточпой Азии. Па основе филогенетического анализа удалось выявить значительную гетерогенность санкт-петербургских изолятов HBV генотипа D, выделенных от больных как острым, так и хроническим ГВ (рис. 5).
Аналогичные данные были получены при изучении изолятов HBV, циркулирующих в г. Самара. На основе филогенетического анализа было доказано доминирование генотипа D, a также выявлены случаи инфицирования пациентов изолятами IIBV генотипа A ^1ос^геп E. et а!., 2000).
Рис. 5. Филогенетический анализ 30 изолятов HBV па основе 684 нуклеотидов из S гена, выполненный с помощью программы Clustal X. Изолят Woolly monkey HBV был использован как внешняя группа при кластерном анализе. Латинские буквы над отдельными узлами показывают принадлежность к генотипу вируса. Наименования изолятов HBV указаны справа от каждой ветви в соответствии с их идентификационным номером в GenBank.
Молекулярная эпидемиология гепатита С. Современное глобальное географическое распространение различных генотипов HCV, как и в случае IIAV и HBV, достаточно хорошо документировано. Некоторые генотипы встречаются по всему миру, тогда как другие циркулируют в определенных географических зонах (Табл. 3). Генотипы 1, 2 и 3 получили наибольшее распространение, при этом тот или иной их субтип доминирует в разных географических зонах. Генотипы 4, 5 и б имеют более локальное распространение. Генотип 4 -основной тип IICV в Центральной и Северной Африке, в Заире и па Среднем Востоке. Генотип 5 выявлен исключительно в Южной Африке, и это единственный генотип, который включает лишь один субтип 5а. Генотип б широко представлен в странах Юго-Восточной Азии (Табл.3).
Таблица 3.
Географическое распространение гепо/субтипов HCV
Континент Страна Гсно/субтнпы IICV
Европа Германия 1b (44%), 1 а (36%), 2а, 2Ь,2с, За, 4,5
Швеция 1а (40%), За (29%), 2Ь (21%), 1b
Франции 1 Ь (32%), За (24%), 1а (22%), 2а, 4, 5
Австрия 1b (54%), 1 а (15,6%), 3а (15,6%), 4,5
Испания 1b (63,7%), 1a (17%), 2а, 2с, 3а, 4с, 4d
Италия 1b (36%), 1а (22%), 2 (21%), 3а (22%)
Словения 1b(54,4%), 1 a (24,6%), 2, 3а
Финляндии 3а (41%), 1b(24%),2b, la
Эстония 1b(32%), la/b(28%), 2a, 3а
Саудовская Арлвпя 4 c,d,h,e (74%), 1b, 2b,3a, 5a,6a
Азия
Япония lb(68,7%), la, 2a, 2b, За
Ib (60,1%), 2a (15,5%), la, 2b, За
Тайвань
Таиланд 1b (39,1%), 3а (39,1), la, 3b;6a
Китай 1b(87,6%),2a, 3b,6a
1b (64,2%), 3а (25%), 2a, la, 2b, 3b
Узбекистан
3c, 3d, 3с, 3f
Непал*
3b(67%), la, 1b, 3а
Мьянма (Бирма)
3 (54%), 2 (25%), 1
Индия
1b (58,8%), 6a (27%), la, 2a,2b,3a
Гон-Конг (Китай)
Америка Бразилия la (32%), Ib (31%), За (26%), 2a, 2 b
la (58%), lb(21%), 2b (13%), 2a, 3а, 4а
США
Африка Камерун 4^38%),2^38%),1а(24%)
4(100%)
Габон
Египет 4 (73,3%)
ЮАР 5(40%), 1 (33%), 2,3,4
Марокко lb(47,6%),2a/c<37,l%),la
Австралия Квинеленд 3а (36,8%), la (34,8%), Ib, 2a, 2b
Новый Южный Уэльс 1 (52%), 3 (32%), 2,4,6
Примечание: Жирным шрифтом выделены превалирующие гено/субтипы HCV, в скобках указана доля конкретного гено/субтипа в сумме всех вариантов.
*Точная структура генотипов для Непала неизвестна. Данные показаны для выделения территории со специфическими субтипами HCVгенотипа 3.
Ситуации о распространенности генотипов HCV в России и странах СНГ посвящено небольшое количество публикаций. Во всех регионах России, а также в Молдавии, Туркменистане, Казахстане отмечено доминирование HCV субтипа 1b (не менее 68,9%), которое сохранялось до настоящего времени согласно недавним исследованиям в большинстве регионов этих стран. Субтипы 1а и 3а делят второе место по частоте встречаемости. Помимо этого, были зафиксированы случаи инфицирования HCV субтипов 2а, 2b и 2с.
В Санкт-Петербургском институте им. Пастера совместно со Шведским институтом по контролю за инфекционными заболеваниями (Dr. Lars Magnius. Dr. Helene Norder) были изучены изоляты HCV, циркулирующие в Санкт-Петербурге.
Проведенный филогенетический анализ пуклеотидных последовательностей из NS5B области генома 150 изолятов HCV, полученных от анти-HCV позитивных пациентов различных стационаров г. Санкт-Петербурга в 1999, включая пациентов из групп риска (лиц, употребляющих внутривенно наркотические средства - ВВП, и пациентов отделений гемодиализа (ОГД), дифференцировал б субтипов HCV: la, lb, 2а, 2с, 3а и 4а.
Данные эпидемиологического расследования позволили определить особенности циркуляции выявленных субтипов HCV в Санкт-Петербурге. Наблюдалось значительное различие в распространении субтипов HCV в зависимости от вероятных путей инфицирования пациентов.
Среди больных гепатитом С, находившихся на лечении в инфекционных отделениях стационаров и представлявших основное население Санкт-Петербурга, выявлено пять субтнпов ITCV: la, lb, 2а, За и 4а. Тогда как среди апти-HCV позитивных пациентов ОГД - только три: lb, 2с и За. Субтпп HCV За (50%) доминировал в основной популяции Санкт-Петербурга независимо от наличия в анамнезе пациентов употребления внутривенно наркотических средств. Субтпп lb в этой группе пациентов занимал лишь второе место (39%), тогда как ранее па всей территории России, включая Санкт-Петербург, его доля достигала 58-76%. При этом большинство ВВП (55%) было инфицировано нзолятами HCV субтипа За. Доминирование этого субтипа среди всех возрастных групп ВВН свидетельствовало о длительной его циркуляции в этой среде. Среди не-ВВН HCV субтипа 3а доминировал лишь у лиц моложе 20 лет (67%). Высокая частота распространения субтипа За среди молодых пациентов, не зависящая от внутривенного употребления ими наркотических средств, и данные о том, что в 1998-1999 годах в Санкт-Петербурге молодые пациенты составляли 85% всех больных острым ГС, позволили заключить, что субтип За стал относительно недавно интенсивно циркулировать и в основной популяции Санкт-Петербурга (Kalinina О. ct al, 2001). Филогенетический анализ также выявил, что большинство Санкт-Петербургских нзолятов HCV субтипа За формировали четкую отдельную ветвь, в которой изоляты от ВВН были перемешаны с изолятами от не-ВВН, включая изоляты, выделенные от медицинского персонала различных больниц и пациентов, находившихся па лечении в стационарах города. Это явилось "не только дополнительным доказательством того, что в последние годы субтип За начал активно распространяться за пределы группы ВВН, по также свидетельством формирования в Санкт-Петербурге собственных вариантов II CV субтипа За, отличных от европейских и азиатских изолятов HCV данного субтппа.
Среди апти-HCV позитивных пациентов всех трех ОГД частота выявления вариантов HCV существенно отличалась от таковой среди населения города в целом. В этой группе пациентов доминирующим оказался субтип 1b (89%). Только в одном из трех отделений гемодиализа Санкт-Петербурга помимо основного субтипа lb было выявлено дополнительно два других субтипа - 2с (4%) и За (7%). Более того, субтип 2с не был обнаружен у пациентов инфекционных клиник Санкт-Петербурга.
Дальнейшее углубленное эпидемиологическое расследование вместе с данными анализа генетических взаимоотношений между всеми изолятами HCV, выделенными от апти-HCV позитивных пациентов, позволило выявить возможные пути распространения вируса ГС в ОГД Санкт-Петербурга.
Уникальная ситуация сложилась в ОГД-1, где все апти-HCV позитивные пациенты были инфицированы изолятами HCV субтипа lb. Частота выявления аиш-1-HCV среди пациентов
этого отделения в период годичного проспективного наблюдения увеличилась практически вдвое и достигла 48,3%. У 23 анти-HCV позитивных пациентов была выявлена РНК HCV методом ОТ-ПЦР. У 22 из 23 изолятов HCV были определены нуклеотидпые последовательности участка NS5D области генома и установлено, что все эти изоляты HCV принадлежат к субтипу 1Ь. Филогенетический анализ пуклеотидных последовательностей выявил, что 17 из 22 изолятов формировали обособленный четкий кластер, который не группировался с другими кластерами, образованными изолятами HCV из Санкт-Петербурга (рис. 7, правая часть). Шесть из указанных 17 изолятов HCV имели полную гомологию (100%) нуклеотндных последовательностей, включая один изолят, выделенный от пациента, который только в период наблюдения стал анти-HCV позитивным. Еще 5 из 17 изолятов были получены от пациентов, инфицированных HCV в период наблюдения. Все эти изоляты входили в более мелкие кластеры, которые включали изоляты ПСУ, полученные от пациентов с хроническим ГС
При сопоставлении этих данных со схемой распределения пациентов по гемодиализным машинам и сменам прохождения процедуры была выявлена следующая картина. Все анти-HCV-позитивные пациенты проходили диализ только в одном из двух залов. Пациенты, изоляты которых имели явное родство, могли быть в разных сменах, по получать диализ па одной установке (например, N160 и N105, N122 и N172); в одной смене, по получать диализ па разных машинах (например, N120 и N148); а также в разных сменах и получать диализ па разных машинах (например, N104 и N132).
Изложенное позволяет сделать заключение о том, что распространение HCV в данном ОГД происходило, по-видимому, не только за счет недостаточной стерилизации диализных машин, по и за счет недостаточного соблюдения персоналом мер предосторожности во время процедуры гемодиализа. Распространение возбудителя среди пациентов, прикрепленных к разным диализным машинам и получавших процедуру в разные смены, указывает на то, что существуют другие, неустановленные пути и факторы передачи HCV в ОГД.
Рис. 7. Слева: распределение анти-НСУ-позитивных пациентов ОГД-1 по гемодиализным машинам (номера 1-7) и сменам прохождения процедуры (А - понедельник, среда, пятница, В -вторник, четверг, суббота; с утро, ё - день, е вечер). Справа: фрагмент ветви филогенетического дерева, формирующей субтип 1Ь (метод иРОМА). Цифры над узлами -процент бутстрэинга. Наименование и происхождение изолятов Н^ указаны справа от каждой ветви. N - пациенты ОГД, которые стали апти-HCV позитивными в период
наблюдения. Скобка охватывает изоляты с полной гомологией нуклеотидных по следовательностей.
Более того, идентичность нуклеотидных последовательностей у всех 17 изолятов HCV субтипа 1b, формировавших общий кластер, составила не менее 95,5%, а у 15 из них превышала 98,4%. Эти данные говорят о том, что все эти изоляты HCV произошли от одного общего предшественника. Согласно анамнезу, 9 из 17 пациентов стали аити-НСУ-позитивными уже несколько лет назад: с 1995-N110, с 1996-N116, с 1997 - N160, N165, с 1998 - N105, N117, N146, N115, N118. Учитывая, что скорость мутаций в NS5B области позволяет определять давнее родство между изолятами HCV, приведенные данные указывают на то, что данный вариант HCV субтипа 1b стал циркулировать в ОГД достаточно давно. Принимая во внимание, что 17 изолятов HCV формировали па филогенетическом дереве отчетливый кластер, не группировавшийся с другими Санкт-Петербургскими изолятами HCV (данные не показаны), можно сделать заключение о том, что к моменту исследования в данном отделении хронического гемодиализа сформировался, так называемый, «внутригоспитальный» вариант HCV, который может достаточно долго циркулировать в условиях, благоприятствующих его поддержанию.
3.3. Пример последовательности действий при эпидемиологическом расследовании возможной передачи HCV в условиях тесного бытового контакта.
Распространение HCV в условиях тесного бытового контакта, включая половую передачу, оценивается в пределах 2-9%. В ряде публикаций были приведены отрицательные результаты исследования спермы и вагинальных выделений на наличие вирусного генома. В других исследованиях анализ наличия РНК HCV в моче и слюне выявил присутствие генома в очень низких титрах (Marino N. et al., 1994). Тем не менее, случаи распространения HCV в условиях бытового контакта известны, что не позволяет пренебрегать данным фактором риска.
При эпидемиологическом расследовании семейных очагов HCV достаточно сложно сделать заключение об источниках и путях передачи возбудителя, основываясь только на использовании данных рутинного лабораторного обследования членов семьи. В этих случаях необходим специальный алгоритм обследования, включающий методы молекулярной эпидемиологии. На примере реальной ситуации приводится последовательность действий при эпидемиологическом расследовании семейного очага (рис.8 А-С).
Пациенты N778, N779, N780 и N781 являлись членами одной семьи: оба родителя (N778 и N779) и двое детей (мальчик 12 лет - N780, девочка 17лет — N781). У всех из них были выявлены антитела к HCV (рис. 8А). Первоначально клинические проявления гепатита были зафиксированы у мальчика 12 лет. Тестирование крови родителей и сестры на анти-HCV показало позитивный результат. Дети не имели каких-либо медицинских вмешательств в анамнезе в последние 12 месяцев до выявления антител к вирусу ГС, а также отрицали употребление инъекционных наркотических средств. Следует отметить, что мать заболевшего работала стоматологом. С помощью ОТ-ПЦР у всех четырех в сыворотке крови была обнаружена РНК HCV. Основываясь на данных лабораторного исследования, включая результаты ОТ-ПЦР, можно было бы сделать вывод о внутрисемейном распространении инфекции. Логическим заключением об источнике инфекции мог бы послужить факт, что один из членов семьи являлся медицинским работником из группы высокого риска инфицирования -стоматологом. Дополнительно эту гипотезу поддерживали данные клинико-биохимического обследования женщины, показавшие наличие .хронического процесса в печени. Тем не менее, учитывая только данные о наличии РНК HCV в образцах сыворотки крови, нельзя было сделать заключение
Рис. 8. Схематическое изображение расследования семейного очага вирусного ГС (описание в тексте).
об общности источника инфекции. Для подтверждения возможного внутрисемейного распространения инфекции необходимо было определить субтип ^V у каждого из членов семьи. В результате проведенного генотипирования было установлено, что отец заболевшего мальчика был инфицирован HCV субтипа 1а, мать (стоматолог) - HCV субтипа 1Ь, а оба ребенка - HCV субтипа За (рис. 8В). Таким образом, полученные данные не подтвердили полностью предположение о распространении ИСУ-инфекции внутри семьи. Только дети были инфицированы одним и тем же вариантов ИСУ, что не исключало передачи ИСУ между ними. Для подтверждения последней гипотезы требовалось проведение филогенетического анализа
для установления генетических взаимоотношений между изолятами HCV, выделенными от детей. Филогенетический анализ выявил полную идентичность нуклеотидных последовательностей обоих изолятов HCV (рис. 8С), что явилось убедительным доказательством того, что дети заразились от общего не установленного источника, либо кто-либо из детей послужил источником инфекции для другого.
C.Л.Мукомолов, О.В.Калинина, Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург.
ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ПОСТВАКЦИПАЛЫЮГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ГЕПАТИТА В. Изучение длительности поствакциналыюго иммунитета к гепатиту В является одним из наиболее важных вопросов иммунопрофилактики этой инфекции. Это прежде всего определяется чисто практическими вопросами:
• как долго человек, получивший полный цикл вакцинации и ответивший на неё выработкой антител, будет надёжно защищён от гепатита В?
• когда необходимо вводить бустсрпую дозу вакцины для обеспечения дальнейшей защиты?
Первые вакцины против гепатита В, промышленно изготовленные в конце 70-х годов XX века па основе высокоочищенного HBsAg, нашли широкое применение в практическом здравоохранении многих стран мира. Исходя из этого, первый опыт длительного наблюдения за результатами вакцинации против гепатита В был получен при использовании «плазменных» вакцин. Анализ результатов определения продолжительности поствакцинального иммунитета после применения этих вакцин позволил прийти к следующим выводам:
• падежная защита от гепатита В зарегистрирована у лиц с наличием анти-HBs в концентрации 10 мМЕ/мл («защитный» или «протективный» уровень антител против HBsAg);
• чем выше концентрация апти-HBs после первого введения вакцины против гепатита В, тем дольше по времени они сохраняются в организме вакцинированного;
• в течение последующих лет после завершения вакцинации происходит постепенное уменьшение концентрации апти-HBs до уровня, который недоступен для методов их детекции. Исходя из этого, регистрируется увеличение процента лиц, у которых не удается определить апти-HBs в концентрациях выше 10 мМЕ/мл. Так, по данным китайских исследователей, изучивших частоту выявления поствакцинальных антител среди детей, вакцинированных плазменной вакциной против гепатита В, лишь половина из них имела апти- Bs в «протективной» концентрации по прошествии 15 лет [Liao SS, Li RC, Li Metal., 1999].
Начиная с середины 80-х годов прошлого века, началось внедрение в практическое здравоохранение многих стран вакцин против гепатита В нового поколения, полученных по рекомбинантной технологии. Применение этих вакцин вновь определило необходимость изучения уровня поствакцивального иммунитета и его продолжительности. Прежде всего, были подтверждены общие закономерности антительного ответа на введение вакцин, зарегистрированные при изучении «плазменных» вакцин против гепатита В.
Подтверждено, что при использовании рскомбинантных вакцин защитный уровень анти-HBs так же, как и для плазменных вакцин, соответствует 10 мМЕ/мл. Вместе с тем, в некоторых странах (Швеция, Германия, Италия, Бельгия) протективпым уровнем принято считать концентрацию аити-HBs в 100 мМЕ/мл 1. По мнению органов здравоохранения этих стран увеличение порога протективпого уровня антител представляется важным для отбора лиц, подлежащих последующей ревакцинации, что приводит к более падежной защите населения от гепатита В.
Изучение поствакцииалыюго иммунитета среди лиц с нормальным иммунным статусом продемонстрировало, что у подавляющего большинства иммунизированных людей защита от гепатита В сохраняется как минимум 5 лет. В дальнейшем происходит постепенное уменьшение числа лиц, имеющих концентрации анти-HBs па протективном уровне. По данным индийских ученых через 10 лет примерно у 60 % вакцинированного взрослого населения
