CC BY
230
УДК [616-002.5-036.22:579](470.1/.2)
МОЛЕКУЛЯРНАЯ .. ТУБЕРКУЛЕЗА В ЧЕТЫРЕХ АДМИНИСТРАТИВНЫХ ТЕРРИТОРИЯХ БАРЕНЦ-РЕГИОНА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
© 2007 г. А. А. Баранов, А. О. Марьяндышев,
*Ю. М. Маркелов, **Г. Бьюне, ***У. Дале
Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск Петрозаводский государственный университет, г. Петрозаводск **Университет г. Осло,
***Национальный институт общественного здоровья, г. Осло, Норвегия
В статье описывается молекулярная эпидемиология микобактерий туберкулеза (М. туберкулеза) среди впервые выявленных случаев заболевания туберкулезом в четырех административных территориях Баренц-региона Российской Федерации. С помощью двух методов молекулярной биологии - сполиго-типирования и RFLP установлено, что превалирующим генотипом М. туберкулеза является генотип Beijing (47,1 %). Данный генотип обладает самым высоким уровнем кластерности среди всех генотипов, что свидетельствует о его активной передаче.
Ключевые слова: туберкулез, микобактерии туберкулеза, сполиготипи-рование, RFLP, генотип Beijing.
Впервые молекулярно-генетические методы для описательной эпидемиологии микобактерий туберкулеза (М. туберкулеза) были применены в начале 1990-х годов. Нью-Йорк (США) считается одним из первых мест, где эти методы помогли расследованию вспышки туберкулезной инфекции [10]. С тех пор появилось множество других молекулярногенетических методов анализа М. туберкулеза, которые постоянно совершенствуются [11, 17]. Это стало возможным благодаря как лучшему пониманию генетики М. туберкулеза, так и развитию молекулярной биологии в целом. Геном М. туберкулеза был полностью расшифрован в 1998 году группой авторов под руководством S. T Cole [8], и в настоящее время молекулярная генетика М. туберкулеза считается одной из наиболее изученных среди других микроорганизмов.
Однако, несмотря на успехи лабораторной медицины и пристальное внимание мировой медицинской общественности к проблемам туберкулеза, во многих частях мира пока не удается остановить распространение эпидемии туберкулеза. Согласно определению Всемирной организации здравоохранения туберкулез остается ведущей причиной смерти среди излечимых инфекционных заболеваний [19]. Каждый год в мире туберкулезом заболевают 8,9 миллиона и умирают от него 1,7 миллиона человек [20].
Россия входит в число 22 стран с наиболее высокими показателями по распространенности туберкулеза [18].
Для того чтобы предпринимать эффективные меры по контролю туберкулеза, необходимо охарактеризовать настоящую эпидемию заболевания и выявить ее особенности.
Целью настоящего исследования стало проведение анализа молекулярной эпидемиологии штаммов М. туберкулеза, циркулирующих в четырех административных территориях Баренц-региона Российской Федерации.
Методы исследования
Всего было проанализировано 176 штаммов М. туберкулеза, выделенных от больных с впервые выявленными случаями заболевания легочным туберкулезом из гражданского сектора четырех административных территорий Северо-Западного федерального округа Российской Федерации (Архангельская, Мурманская области, Республики Карелия и Коми) за период 2004 — 2006 годов. Молекулярно-генетический анализ был проведен в Национальной референс-лаборатории для микобактерий в Национальном институте общественного здоровья (Норвегия, Осло).
Для молекулярно-генетического анализа штаммов М. туберкулеза были применены два метода молекулярной биологии — сполиготи-
05613787
пирование (англ. spoligotyping) и генотипирование по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism typing
— RFLP) с использованием вставочной последовательности IS6110.
Сполиготипирование представляет собой быстрый метод идентификации микобактерий и классификации их по известным генотипам. Он основывается на полиморфизме одного хромосомного локуса, который называется областью прямых повторов (direct repeat region).
Сполиготипирование осуществлялось по следующей методике [13]: ДНК микобактерий выделялась из клеток и очищалась от других органических соединений. Проводилась полимеразная цепная реакция с использованием одной пары праймеров против нуклеотидных последовательностей в области прямых повторов, причем один из праймеров был биотинилорованным — для последующей регистрации результатов. Затем выполнялась гибридизация с набором из 43 олигонуклеотидов, иммобилизированных на мембране. Вслед за этим мембрану инкубировали в streptavidin peroxidase и результат был визуализирован на рентгеновских пленках с помощью хеми-люминесценции.
Полученные при сполиготипировании паттерны сравнивали с паттернами, опубликованными в глобальной базе данных SpolDB4 [7] для определения генотипов циркулирующих штаммов М. туберкулеза.
RFLP с использованием вставочной последовательности IS6110 в настоящее время считается лучшим методом выявления генетического сходства между сравниваемыми штаммами М. туберкулеза, он позволяет оценить уровень трансмиссии заболевания среди популяций. Это возможно благодаря высокой стабильности вставочных элементов IS6110 в геноме микобактерий — период их полужизни составляет 3—4 года [9].
Вкратце процедура RFLP заключалась в следующем [17]: ДНК микобактерий, выделенная из клеток и очищенная от других органических соединений, расщеплялась на части рестрикционным ферментом Pvull. Вслед за этим фрагменты рестрикции распределялись согласно их молекулярному весу в агарозном геле при проведении электрофореза. С помощью южного блоттинга (Southern blotting) рестрикционные фрагменты ДНК переносились на ДНК-связывающую мембрану. Далее проводилась гибридизация ДНК к внутреннему элементу вставочной последовательности IS6110 и результаты визуализировались с помощью коммерческого лабораторного набора (digoxigenin-dUTP labeling and detection kit; Boehringer, Germany).
Для анализа полученных методом RFLP паттернов ДНК была применена специальная компьютерная программа Bionumerics (AppliedMaths, Kortrijk, Belgium), версия 1.5. Перед проведением анализа ДНК паттерны были нормализованы с помощью генетических маркеров с известным молекулярным
весом. Для выявления сходства между полученными паттернами ДНК был произведен кластерный анализ с использованием невзвешенного пара-группа усредненного метода (unweighted pair-group average method) с расчетом коэффициента сходства Диса (Dice similarity coefficient).
Результаты
Данные сполиготипирования представлены в таблице. На основании анализа полученных при споли-готипировании паттернов можно прийти к выводу о наличии трех превалирующих генотипов в исследуемой популяции. Наиболее распространенным является генотип Beijing, который встретился в 83 (47,1 %) случаях. Далее следуют генотип T — 43 (24,4 %) и генотип Haarlem — 21 (11,9 %) случай. Остальные 26 (14,8 %) штаммов принадлежат к генотипам LAM, MANU, U, CAS и S. Паттерны сполиготипирования трех штаммов (1,8 %) на настоящий момент не описаны в глобальной базе данных SpolDB4, поэтому эти штаммы не были классифицированы.
Анализ RFLP-паттернов и кластерный анализ выявили 10 кластеров в исследуемой выборке. Размеры кластеров составили от 2 до 10 штаммов М. туберкулеза. Кластер — это два и более штамма М. туберкулеза, RFLP-паттерны которых обладают полным сходством между собой. Считается, что штаммы, входящие в один кластер, являются идентичными.
Девять из десяти обнаруженных кластеров включают штаммы, принадлежащие к генотипу Beijing, таким образом, штаммы данного генотипа обладают самым высоким уровнем кластерности в исследуемой выборке. Кроме того, при визуальном анализе паттернов RFLP можно заключить, что в целом штаммы М. туберкулеза генотипа Beijing обладают наибольшим генетическим сходством между собой при сравнении со штаммами других генотипов. Оба этих факта свидетельствуют об активной передаче штаммов генотипа Beijing.
Обсуждение
Генотип Beijing был выявлен во многих частях мира. В разных странах характер распространения М. туберкулеза данного генотипа варьирует — от почти полного отсутствия и эндемических случаев до эпидемий [6]. Наибольшее распространение генотип Beijing получил в странах Азии и бывшего Советского Союза. Более того, в некоторых странах была установлена взаимосвязь между туберкулезом, вызванным микобактериями данного генотипа, и лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам [6].
Некоторые исследователи предполагают наличие у штаммов М. туберкулеза генотипа Beijing повышенной вирулентности [12] или наличие возможности обойти иммунную защиту организма, сформированную вакциной БЦЖ [5]. Однако на настоящий момент реальные механизмы, способствующие распространению генотипа Beijing, остаются неясными.
Паттерны сполиготипирования штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных от больных с впервые выявленными случаями легочного туберкулеза, в четырех административных территория Баренц-региона Российской Федерации (n = 176)
3б
В Российской Федерации генотип Beijing является превалирующим почти повсеместно — это было выявлено исследованиями, проведенными в московском регионе [1], Самарской области (в том числе в системе исполнения наказаний) [2], Кавказском регионе [1], Республике Тыва [3], Архангельской области (как в гражданском секторе, так и в системе исполнения наказаний) [15, 16], Восточной Сибири [4].
Нашим исследованием было выявлено, что в Баренц-регионе Российской Федерации генотип Beijing встречается почти в половине (47,1 %) всех впервые выявленных случаев заболевания легочным туберкулезом. Это подтверждает эпидемический характер распространения данного генотипа.
С помощью RFLP мы установили, что почти все Beijing-штаммы М. туберкулеза обладают высокой степенью схожести между собой и среди них имеется большое количество кластеров. Это свидетельствует об активной передаче штаммов туберкулеза данного генотипа. Более того, в состав многих кластеров входят штаммы, выделенные от больных туберкулезом в различных регионах Северо-Западного федерального округа России. По всей видимости, это связано с активными миграционными процессами.
Можно предположить, что генотип Beijing обладает каким-то преимуществом по сравнению с другими генотипами, которое способствует его обширному распространению. В Архангельской области ранее проведенным исследованием была выявлена взаимосвязь между данным генотипом и наличием лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам [16]. Кроме того, было продемонстрировано, что принадлежащие к генотипу Beijing М. туберкулеза не теряют фитнес (выраженный как скорость роста), приобретая лекарственную устойчивость, — в отличие от других генетических групп М. туберкулеза [14]. Таким образом, пациенты, зараженные М. туберкулеза генотипа Beijing, возможно, дольше остаются эпидемически опасными для окружающих людей. Это может быть одним из объяснений столь широкого распространения данного генотипа.
Выводы
1. Наиболее часто встречающимся генотипом М. туберкулеза в Баренц-регионе Российской Федерации является генотип Beijing, который обнаруживается почти в половине (47,1 %) новых случаев заболевания легочным туберкулезом. Тем не менее в исследуемых территориях также обнаружено довольно высокое распространение генотипов T и Haarlem.
2. Генотип Beijing обладает самым высоким уровнем кластерное™ среди всех превалирующих генотипов, что свидетельствует об активной передаче М. туберкулеза этого генотипа.
3. Многие RFLP-кластеры включают штаммы, выделенные от больных в различных административных территориях Северо-Западного федерального округа. Это отражает миграционные процессы и вызывает необходимость усиления и координирования противотуберкулезных программ во всех регионах.
Список литературы
1. Андреевская С. Н. Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область) / С. Н. Андреевская, Л. Н. Чер-ноусова, Т. Г. Смирнова и др. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2006. — № 1. — С. 29—35.
2. Балабанова Я. М. Преобладание штаммов Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing и факторы риска их трансмиссии в Самарской области / Я. М. Балабанова, В. В. Николаевский, М. Радди и др. // Там же.
- № 2. - С. 31-37.
3. Матракшин А. Г. Генотипическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis из Республики Тыва / А. Г. Матракшин, Е. М. Месько, Н. К. Белякова и др. // Там же. — 2004. — № 3. — С. 37-40.
4. Медведева Т. В. MIRU-VNTR-генотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis в Восточной Сибири: семейство Beijing против Kilimanjaro / Т. В. Медведева, О. Б. Огарков, О. М. Некипелов и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2004. - № 4.
- С. 33-38.
5. Abebe F. The emergence of Beijing family genotypes of Mycobacterium tuberculosis and low-level protection by bacille Calmette-Guerin (BCG) vaccines: is there a link? / F. Abebe, G. Bjune // Clin. Exp. Immunol. - 2006. -Vol. 145, N 3. - P 389-397.
6. Beijing/W genotype Mycobacterium tuberculosis and drug resistance // Emerg. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 12, N 5. - P. 736-743.
7. Brudey K. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligo-typing database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology / K. Brudey, J. R. Driscoll, L. Rigouts et al. // BMC Microbiol. - 2006. - Vol. 6.
- P. 23.
8. Cole S. T. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence / S. T. Cole, R. Brosch, J. Parkhill et al. // Nature. - 1998. - Vol. 393, N 6685. - P. 537-544.
9. de Boer A. S. Analysis of rate of change of IS6110 RFLP patterns of Mycobacterium tuberculosis based on serial patient isolates / A. S. de Boer, M. W. Borgdorff, P. E. de Haas et al. // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol. 180, N 4. - P. 1238-1244.
10. Edlin B. R.. An outbreak of multidrug-resistant tuberculosis among hospitalized patients with the acquired immunodeficiency syndrome / B. R. Edlin, J. I. Tokars, M. H. Grieco et al. // N. Engl. J. Med. - 1992. - Vol. 326, N 23. - P. 1514-1521.
11. Kremer K. Discriminatory power and reproducibility of novel DNA typing methods for Mycobacterium tuberculosis complex strains / K. Kremer, C. Arnold, A. Cataldi et al. // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43, N 11. -P. 5628-5638.
12. Lopez B. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes / B. Lopez, D. Aguilar, H. Orozco et al. // Clin. Exp. Immunol. — 2003. — Vol. 133, N 1.
- P. 30-37.
13. Spoligotyping kit manual. — Isogen Life Science, 2005.
14. Toungoussova O. S. Impact of drug resistance on fitness of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing genotype / O. S. Toungoussova, D. A. Caugant, P. Sandven et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. — 2004. — Vol. 42, N 3. — P. 281—290.
15. Toungoussova O. S. Molecular epidemiology and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolates in the Archangel prison in Russia: predominance of the W-Beijing clone family / O. S. Toungoussova, A. Mariandyshev, G. Bjune et al. // Clin. Infect. Dis. — 2003. — Vol. 37, N 5. — P. 665—672.
16. Toungoussova O. S. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia / O. S. Toungoussova, P. Sandven, A. O. Mariandyshev et al. // J. Clin. Microbiol. — 2002. — Vol. 40, N 6. — P. 1930—1937.
17. Van S. D. Molecular epidemiology of tuberculosis and other mycobacterial infections: main methodologies and achievements / S. D. Van // J. Intern. Med. — 2001. — Vol. 249, N 1. — P. 1—26.
18. WHO. The world health report 2004: changing history. — Geneva : World Health Organization, 2004.
19. WHO. The world health report 2004: changing history. — Geneva : World Health Organization, 2004.
20. WHO. Tuberculosis fact sheet. — 2006. — N 104.
MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF TUBERCULOSIS IN FOUR ADMINISTRATIVE TERRITORIES OF BARENTS REGION IN RUSSIAN FEDERATION
А. А. Baranov, А. О. Maryandyshev, *Yu. М. Мarkelov, **G. Bjune, ***U. Dale
Northern State Medical University, Arkhangelsk *Petrozavodsk State University, Petrozavodsk **Oslo University,
***National Institute of Public Health, Oslo, Norway
In the article, molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis among new cases of tuberculosis morbidity rate in four administrative territories of the Barents region in the Russian Federation has been described. With the help of two methods of molecular biology - spoligo-identification and RFLP - it has been established that a prevailing genotype was the genotype Beijing (47,1%). This genotype has the highest level of clusters’ number among all genotypes, what is evidence of its active communication.
Key words: tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, spoligo-identification, RFLP, the genotype Beijing.
Контактная информация:
Баранов Антон Алексеевич - аспирант кафедры фтизиопульмонологии Северного государственного медицинского университета
Адрес: 163000, г. Архангельск, пр. Троицкий, д. 51, СГМУ
Тел. (8182) 66-05-64
Статья поступила 14.11.2006 г.
