CC BY
0
чт
сч о сч
сч
>-
и о
-J
о
и
DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-2-116-129
Модуляция активности генов гомологичной рекомбинации в опухолевых клетках молочной железы в модели in vitro
о
ее <
^ М.М. Цыганов1, 2, А.А. Фролова1, Е.А. Кравцова1, И.А. Цыденова1, М.К. Ибрагимова1, 2
ш 'Научно-исследовательский институт онкологии ФГБНУ«Томский национальный исследовательский медицинский центр
Российской академии наук»; Россия, 634009 Томск, пер. Кооперативный 5;
2 ФГБОУВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; Россия, 634050 Томск,
Z Московский тракт, 2
нн
ю
Ш
Контакты: Матвей Михайлович Цыганов TsyganovMM@yandex.ru
< >
о
<
о
о.
в;
£
Введение. Установлено, что наличие дефицита гомологичной рекомбинации в опухоли молочной железы связано с эффективностью лечения. При этом, несмотря на высокую химиочувствительность опухоли к ДНК-повреждающим агентам, полные патологические ответы на лечение очень редки. В основе этого процесса может лежать изменение соматического статуса BRCA1, т. е. происходят реверсия и возвращение аллеля дикого типа и восстановление функции репарации ДНК.
Цель исследования - оценить изменения хромосомных аберраций и экспрессионного профиля основных генов гомологичной рекомбинации в клеточных моделях рака молочной железы под действием цисплатина и доцетаксела. Материалы и методы. Исследование проведено на культурах опухолевых клеток рака молочной железы MCF-7, MDA-MB-231 и MDA-MB-468. Модель лекарственной устойчивости на клетках была получена для двух препаратов -цисплатина и доцетаксела. Из клеточной суспензии РНК и ДНК выделяли с помощью наборов RNeasy Plus Mini Kit и QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия) соответственно. Уровень экспрессии генов гомологичной рекомбинации оценивали с использованием обратно-транскриптазной количественной полимеразной цепной реакции. Для определения наличия хромосомных аберраций проводили микроматричный анализ на ДНК-чипах. i Результаты. Показано восстановление нормальной копийности генов BRCA1, CDK12, CHEK1 и RAD51D в MCF-7
^ под действием цисплатина. Для BRCA2 и PALB2 обнаружено появление амплификаций. Также продемонстрировано
О статистически значимое увеличение экспрессии генов BRCA1 (p = 0,04), BRCA2 (p = 0,02), PALB2 (p = 0,01) и RAD51D
^ (p = 0,05). В MDA-MB-231 показано, что все выявленные локусы с делециями, где локализованы гены BRCA2, BARD1,
CHEK2, PALB2 и RAD54L, под действием цисплатина восстанавливаются до нормальной копийности. Появление ам-плификаций зарегистрировано для генов BRCA1, BRIP1, FANCL, RAD51B и PARP1. Аналогичный результат показан о для доцетаксела. Увеличение уровня экспрессии характерно для генов BRCA1 (p = 0,02), BRCA2 (p = 0,02), CHEK2 (p = 0,05),
> FANCL (p = 0,04), PALB2 (p = 0,05), RAD51C (p = 0,02) и PARP1 (p = 0,02), что соответствует появлению амплификаций.
В клеточной культуре MDA-MB-468 наблюдалось увеличение копийности только гена BRCA1. Действие доцетаксела полностью не оказывало влияния на данную клеточную культуру. Уровень экспрессии гена BRCA1 повышался прямо пропорционально длительности действия препарата.
Заключение. Таким образом, проведенное исследование показало, что под действием цисплатина может происходить реверсия не только мутаций генов гомологичной рекомбинации, но и других нарушений.
Ключевые слова: рак молочной железы, клеточные культуры, BRCAness, дефицит гомологичной рекомбинации, экспрессия, делеция, амплификация, реверсия
Для цитирования: Цыганов М.М., Фролова А.А., Кравцова Е.А. и др. Модуляция активности генов гомологичной рекомбинации в опухолевых клетках молочной железы в модели in vitro. Успехи молекулярной онкологии 2024;11(2):116-29.
DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-2-116-129
Modulation of homologous recombination gene activity in breast tumor cells in an in vitro model
M. M. Tsyganov1,2, A .A. Frolova1, E.A. Kravtsova1, I.A. Tsydenova', M. K. Ibragimova1,2
Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences; 5 Kooperativny Line, Tomsk 634009, Russia;
2Siberian State Medical University, Ministry of Health of Russia; 2 Moscow Trakt, Tomsk 634050, Russia Contacts: Matvey MikhaiLovich Tsyganov TsyganovMM@yandex.ru
Introduction. It has been established that the presence of homologous recombination deficiency in a breast tumor is associated with the effectiveness of treatment. But despite the high chemosensitivity of the tumor to DNA-damaging agents, complete pathological responses to treatment are very rare. And this process may be based on a change in the somatic status of BRCA1, that is, a reversion and return of the wiLd-type aLLeLe occurs and the DNA repair function is restored. Aim. To evaLuate changes in the presence of chromosomaL aberrations and the expression profiLe of the main genes of homoLogous recombination in ceLL modeLs of breast cancer under the influence of cispLatin and docetaxeL. Materials and methods. The study was conducted on breast cancer tumor ceLL cuLtures: MCF-7, MDA-MB-231 and MDA-MB-468. A ceLL modeL of drug resistance was obtained for two drugs: cispLatin and docetaxeL. RNA and DNA were isoLated from ceLL suspension using the RNeasy PLus Mini Kit and QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany), respectiveLy. The expression LeveL of homoLogous recombination genes was assessed using reverse transcription poLymerase chain reaction. To assess the presence of chromosomaL aberrations, microarray anaLysis was performed on DNA chips.
Results. Restoration of normaL copy number for the BRCA1, CDK12, CHEK1 and RAD51D genes in MCF-7 under the influence of cispLatin was shown. For BRCA2 and PALB2, ampLifications were detected. A statisticaLLy significant increase in the expression of the BRCA1 (p = 0.04), BRCA2 (p = 0.02), PALB2 (p = 0.01) and RAD51D (p = 0.05) genes was aLso shown. MDA-MB-231 shows that aLL identified Loci with deLetions, where the BRCA2, BARD1, CHEK2, PALB2 and RAD54L genes are LocaLized, are restored to normaL copy number by cispLatin. The appearance of ampLifications was registered for BRCA1, BRIP1, FANCL, RAD51B, PARP1. A simiLar resuLt was shown for docetaxeL. An increase in the expression LeveL is typicaL for the genes BRCA1 (p = 0.02), BRCA2 (p = 0.02), CHEK2 (p = 0.05), FANCL (p = 0.04), PALB2 (p = 0.05), RAD51C (p = 0.02), PARP1 (p = 0.02), which corresponds to the appearance of ampLifications. In the MDA-MB-468 ceLL cuLture, an increase in the copy number of onLy the BRCA1 gene is observed. The effect of docetaxeL has no effect on this ceLL cuLture. The LeveL of BRCA1 expression increases in direct proportion to the duration of drug action.
Conclusion. Thus, the study showed that under the influence of cispLatin, reversion of not onLy homoLogous recombination gene mutations, but aLso other disorders can occur.
Keywords: breast cancer, ceLL cuLtures, BRCAness, homoLogous recombination deficiency, expression, deLetion, ampLification, reversion
For citation: Tsyganov M.M., FroLova A.A., Kravtsova E.A. et aL. ModuLation of homoLogous recombination gene activity in breast tumor ceLLs in an in vitro modeL. Uspekhi moLekuLyarnoy onkoLogii = Advances in MoLecuLar OncoLogy 2024;11(2):116-29. (In Russ.).
DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-2-116-129
чт
сч О СЧ
СЧ
>-
(J
о
—I
о и z о
ОС <
о ж.
to
< >
а
<
о
а.
в;
£
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время диагностика, лечение и профилактика рака молочной железы (РМЖ) у носителей мутаций генов BRCA1 или BRCA2 имеют ряд особенностей по сравнению с пациентами со спорадическим РМЖ. Рак данной локализации, фенотипически и генетически схожий с наследственной формой (BRCA1-ассоциированным РМЖ), обозначается как BRCAness (BRCA-подобные опухоли) [1]. При этом тактика лечения семейной формы РМЖ на сегодняшний день определена. Пациенты, имеющие терминальные мутации, обладают высокой чувствительностью к препаратам платины. Так, результаты последних метаанализов показали, что у больных с мутацией в гене BRCA1/2, которым проведена платиносодержащая неоадъювант-ная химиотерапия (ХТ), частота объективных ответов была значительно выше (отношение рисков (ОР) 1,91; 95 % доверительный интервал (ДИ) 1,48—2,47; р <0,00001; I2 = 32 %), как и показатели выживаемости без прогрессирования (ОР 1,13; 95 % ДИ 0,81-1,57; р = 0,47; I2 = 0 %) и общей выживаемости (ОР 1,89; 95% ДИ 1,22-2,92; р = 0,004; I2 = 0 %) [2].
Как правило, для лечения пациентов без герми-нальных мутаций используется стандартная тактика лечения, которая не всегда может быть эффективной. Тем не менее установлено, что в предполагаемых подгруппах BRCAness, т. е. у больных с дефицитом гомологичной рекомбинации (ГР), может наблюдаться чувствительность к платине и/или другим ДНК-повреждающим агентам. При этом предполагается, что расширение механизмов формирования BRCA-подобных опухолей в процессе канцерогенеза и прогрессии делает опухоли чувствительными к ДНК-повреждающим агентам; это перестает быть «выгодным» опухоли при воздействии химиопрепа-ратов. Иначе говоря, под действием терапии механизмы BRCAness должны нарушаться, а резистентные клоны, лишенные дефицита BRCA, наоборот, формироваться. В исследовании А.Р. Sokolenko и соавт. [3] установлено, что, несмотря на высокую химиочувствительность и быстрое уменьшение опухоли яичника с герминаль-ной мутацией BRCA после неоадъювантной ХТ, полные патологические ответы на лечение очень редки. Авторы показали, что в основе этого процесса может лежать изменение соматического статуса BRCA1 [4].
о Ж.
и >
чт
сч О сч
сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж.
ю
< >
а
<
о m
а. те
m
о ж.
U >
При проведении неоадъювантной ХТ происходят реверсия и возвращение аллеля дикого типа гена, что вызывает восстановление функциональной активности BRCA1 и формирование химиорезистентности опухоли, или под селективным действием соединений платины происходит пролиферация уже существующих клонов, несущих дикий аллель гена BRCA1.
Согласно нашей рабочей гипотезе, опухоли, в частности новообразования молочной железы, не обусловленные наличием герминальных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, обладают выраженной внутриопухо-левой гетерогенностью в отношении соматического статуса данных генов и генов ГР в целом. В связи с этим под действием ХТ могут происходить элиминация чувствительных опухолевых клонов (например, с делециями генов ГР) и распространение и/или замещение уже существующих опухолевых клонов, несущих в себе амплификации генов ГР. Во втором случае возможно возникновение новых мутационных изменений в генах под селективным действием ХТ, в том числе амплификация локуса 17q21.31, содержащего ген BRCA1, даже если изначально в опухоли была его аллельная делеция. Таким образом, широкий спектр нарушений механизмов ГР делает опухоли все более чувствительными к ДНК-повреждающим агентам, и это перестает быть «выгодным» опухоли уже при непосредственном воздействии химиопрепаратов. Иначе говоря, под влиянием терапии механизмы BRCAness должны претерпевать обратные канцерогенезу процессы и будут нарушаться. За счет этого формируются резистентные клоны, лишенные дефицита BRCA, способные переживать повреждающую ДНК ХТ. И это может являться одним из первых механизмов восстановления функциональности BRCA1.
Цель исследования — оценка хромосомных аберраций и экспрессионного профиля основных генов ГР в клеточных моделях РМЖ под действием цисплатина и доцетаксела.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на культурах опухолевых клеток РМЖ MCF-7, MDA-MB-231 и MDA-MB-468 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, Институт цитологии РАН Санкт-Петербург). После разморозки клетки культивировали в чашках Петри во влажной среде, содержащей 5 % CO2, при температуре 37 °C. Для культивирования клеток использовали полные питательные среды RPMI-1640 и DMEM 1 г/л (ООО «ПанЭко», Россия), содержащие 10 % термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (Biosera, Франция) и 5 % антибиотика (пенициллина, стрептомицина) (ООО «ПанЭко», Россия). Перед 3-м пассажем при достижении 90 % конфлю-энтности оценивали жизнеспособность клеточных культур с помощью автоматического счетчика клеток Luna-II (Logos Biosystems, Корея) с последующим проведением экспериментов.
Определение полулетальной дозы. Для определения полулетальной дозы (ЛД50) к препарату платины (ци-сплатин, 1 мг/мл, «Келун Казфарм», Казахстан) клетки культивировались в 96-луночных планшетах, куда при достижении 70 % конфлюэнтности добавляли цис-платин в концентрациях 10, 20, 30 и 40 мкг/мл. Жизнеспособность клеток измерена с помощью МТТ-теста через 24 ч после воздействия препаратом. Для этого к клеткам добавляли 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид тетразолий (МТТ, ООО «ПанЭко», Россия) в конечной концентрации 5 мг/мл, затем клетки инкубировали в течение 4 ч. После инкубации осадок растворяли диметилсульфокси-дом (ДМСО, ООО «ПанЭко», Россия) с последующим измерением оптической плотности полученных растворов с помощью спектрофотометра (Thermo Scientific Multiskan FC, США) на длине волны 620 нм и определяли процент жизнеспособных клеток относительно группы контроля (клетки без препарата).
Аналогичную процедуру проводили для препарата доцетаксел (1 мг/мл, новотакс, BIOCAD, Россия) в концентрациях 30, 35, 40, 45 и 50 мкг/мл. Для оценки пролиферативной активности клеток использовали систему многопараметрического анализа клеточных культур в режиме реального времени — RTCA iCELLigence. Для этого клетки вносили в планшеты (общее число лунок — 16, число лунок на группу — 4) в концентрации 40 тыс./лунку (объем лунки 700 мкл), затем инкубировали при 37 °С во влажной среде с 5 % СО2 в течение 24 ч с фиксацией клеточного индекса каждый час. После окончания инкубации проводили анализ полученных данных с помощью программного обеспечения RTCA Data Analysis Software 1.0.
Разработка моделей химиорезистентного клона. Модель лекарственной устойчивости на клетках РМЖ была получена для двух препаратов — цисплатина и доцетаксела. Клетки линий MCF-7, MDA-MB-231 и MDA-MB-468 высаживали в культуральные флаконы площадью 150 см2 в концентрации от 500 тыс. до 1 млн в зависимости от скорости пролиферации. При достижении конфлюэнтности в 70 % к клеткам добавляли препараты в ранее определенной концентрации ЛД50: цисплатин (10 и 40 мкг/мл), доцетаксел (40 мкг/мл). Инкубация с препаратом выполнялась в течение 24 ч, после чего осуществляли смену среды с последующим культивированием клеток до достижения 90 % кон-флюэнтности (от 7 до 14 дней). Далее проводили снятие клеток и повторный посев в культуральные флаконы перед следующей обработкой препаратом.
Для создания клинической ситуации цикл обработки клеток препаратами в ЛД50 повторяли 3 раза после восстановления клеточной пролиферации. В качестве контроля использовали необработанные клетки, содержащиеся в питательной среде с добавлением ДМСО. Повторение процедуры создания модели химиорезистентного клона для каждой клеточной линии выполняли не менее 3 раз.
Выделение РНК. После экспериментов суспензии опухолевых клеток помещали в раствор RNAlater (Ambion, США). Из клеточной суспензии с помощью набора RNeasy Plus mini Kit (Qiagen, Germany) выделяли РНК в соответствии с инструкцией производителя. Концентрация РНК измерялась с помощью флу-ориметра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Концентрация составила от 50 до 100 нг/мкл. Целостность РНК оценивали с использованием капиллярного электрофореза на приборе Tape Station (Agilent Technologies, США) и набора R6K Screen Tape (Agilent Technologies, США). Индекс целостности РНК (RIN) составил 5,6—8,4.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из опухолевых клеток с помощью набора QIAamp DNA mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрация ДНК измерялась с использованием флуориметра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, USA). Концентрация составила от 50 до 120 нг/мкл. Целостность ДНК оценивалась с помощью капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) с использованием набора Agilent Genomic DNA ScreenTape.
Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени. Уровень экспрессии генов ГР BRCA1, BRCA2, ATM, BARD1, BRIP1, CDK12, CHEK1, CHEK2, FANCL, PALB2, PPP2R2A, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD54L, PARP1 оценивали с помощью обратно-транс-криптазной количественной ПЦР в режиме реального времени по технологии TaqMan на амплификаторе Rotor-Gene-6000 (Corbett Research, Австралия). Для оценки уровня экспрессии исследуемых генов были использованы коммерческие наборы праймеров и зондов («ДНК-синтез», Россия). Полимеразную цепную реакцию ставили в 3 репликах в объеме 15 мкл, содержащем 250 мкМ dNTPs (SibEnzyme, Россия); 300 нМ прямого и обратного праймеров; 200 нМ зонда; 2,5 мМ MgCl2; 19 SE-буфер (67 мМ Tris-HCl pH 8,8 при 25 °C; 16,6 mM(NH4)2S04; 0,01 % Tween-20); 2,5 ед. HotStart Taq полимеразы (SibEnzyme, Россия) и 50 нг комплементарной ДНК (кДНК). Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл при 94 °С, 10 мин — предварительная денатурация; 40 циклов — 1-й шаг 10 с при 94 °С, и 2-й шаг — 20 с при 60 °С. В качестве референсных генов использовали 2 гена: GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase) и ACTB (ß-actin); уровень их экспрессии нормализовался по отношению к экспрессии данных генов в норме и измерялся в условных единицах. Относительная экспрессия генов оценена с помощью метода Pfaffl [5]. В качестве калибратора использовали усредненные данные по ПЦР, полученные от анализа РНК, выделенной из 30 образцов нормальной ткани молочной железы.
Микроматричный анализ. Для оценки наличия хромосомных аберраций (CNA — copy number aberrations of DNA) выполняли микроматричный анализ на микроматрицах (ДНК-чипах) высокой плотности
CytoScan™ HD Array (Affymetrix, США), которые содержали 1 млн 900 тыс. неполиморфных маркеров для анализа аберраций числа копий. Процедуры пробо-подготовки, гибридизации и сканирования проводили в соответствии с протоколом производителя на системе Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix, США). Для обработки результатов микрочипирования использовали программу Chromosome Analysis Suite 4.3 (Affymetrix, США). С ее помощью в хромосомах определяли несбалансированные хромосомные аберрации — делеции (loss) и амплификации (gain).
Поскольку в образцах опухолевой ткани обязательно присутствуют стромальные элементы и другие нормальные клетки, в полученной ДНК высок процент нормальной геномной ДНК. Микрочип CytoScan™ HD Array позволяет выявить 5 % и более мутантной ДНК. Мутантная опухолевая ДНК определялась на фоне нормальной ДНК. Процент мутантной ДНК — статус числа копий (CN-state) — колебался от 15 до 88 %. Нормальная копийность генов определялась как 2 копии на геном. Для делеций регистрировалась потеря 1 копии гена, для амплификации — увеличение копий-ности до 2 и 4 вариантов.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое и среднюю квадратичную ошибку. Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий Вил-коксона—Манна—Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для определения изменений спектра нарушений генов ГР при индукции резистентности к препаратам платины и таксанам условно были отобраны клеточные линии с наличием дефицита ГР (MCF-7 и MDA-MB-231) и без такового (MDA-MB-468) (табл. 1, 2). При отборе клеточных культур мы оценили наличие хромосомных аберраций в исследуемых генах (см. табл. 1, 2) и их экспрессию в клеточных культурах РМЖ до воздействия химиопрепаратами (рис. 1).
Согласно данным, представленным в табл. 1 и 2, в клеточных культурах MCF-7 и MDA-MB-231 наблюдается наличие делеций в 31,2 % случаев (в том числе и в BRCA1), что также соотносится с экспрессионным портретом. MDA-MB-468 показано полное отсутствие делеций и наличие в 25 % случаев амплификаций генов ATM, CHEK1, RAD54L и PARP1, что также коррелирует с высокой экспрессией данных генов (см. рис. 1). Таким образом, согласно рабочей гипотезе в клеточной культуре с наличием дефицита ГР под действием препаратов будет происходить сужение спектра нарушений генов ГР и возможное развитие структурной и функциональной компенсаторности дефицита ГР, что приводит к развитию резистентности к ДНК-по-вреждающим агентам.
чт
сч о сч
сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о
а.
в;
£
о ж.
и >
чт
сч О сч
сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю ш и
Z <
>
а
<
о ы X
о о
X а. те
£
ш те о
ж.
и >
Таблица 1. Наличие хромосомных аберраций в генах системы гомологичной рекомбинации в исследуемых клеточных культурах MCF-7, MDA-MB-231 и MDA-MB-468
Table 1. Presence of chromosomal aberrations in the genes of the homologous recombination system in the studied cell cultures MCF-7, MDA-MB-231 and MDA-MB-468
MCF-7
MDA-MB-231
MDA-MB-468
BRCA1 Del N N
BRCA2 N Del N
ATM Del N Ampl
BARD1 N Del N
BRIP1 Ampl N N
CDK12 Del N N
CHEK1 Del N Ampl
CHEK2 N Del N
FANCL N N N
PALB2 N Del N
PPP2R2A N N N
RAD51B Ampl N N
RAD51C Ampl N N
RAD51D Del N N
RAD54L N Del Ampl
PARP1 N N Ampl
Примечание. Del — Note. Del — deletion; n делеция; n — нормальная копийность; ampl — амплификация. — normal copy number; ampl — amplification.
Таблица 2. Частота встречаемости аберраций числа копий ДНК в исследуемых клеточных культурах MCF-7, MDA-MB-231 и MDA-MB-468, абс. (%)
Table 2. Frequency of occurrence of DNA copy number aberrations in the studied cell cultures MCF-7, MDA-MB-231 and MDA-MB-468, abs. (%)
Хромосомная аберрация MCF-7 MDA-MB-231 MDA-MB-468
Делеция Deletion 5(31,2) 5(31,2) 0 (0)
Нормальная копийность Normal copy number 8 (50,0) 11 (68,8) 12 (75,0)
Амплификация Amplification 3 (18,8) 0 (0) 4 (25,0)
Дефицит гомологичной рекомбинации Homologous recombination deficiency Есть Yes Есть Yes Нет No
Далее проводилось создание модели химиорези-стентного клона, для которой культуры клеток MCF-7, MDA-MB-231 и MDA-MB-468 подвергались трем последовательным циклам обработки исследуемыми препаратами в ЛД50. Каждый цикл включал 24-часовое культивирование клеток с химиотерапевтическими агентами. По истечении этого периода препарат удаляли, меняли питательную среду и культивировали клетки до достижения 90 % конфлюэнтности и повто-
рения цикла обработки. С помощью МТТ-теста и RTCA-iCELLigence предварительно были отобраны оптимальные дозы препаратов: ЛД50 цисплатина для MCF-7 составила 10 мкг/мл, для MDA-MB-231 — 40 мкг/мл и для MDA-MB-468 — 20 мкг/мл, доцетаксела — 50, 50 и 40 мкг/мл соответственно. После воздействия препаратами наблюдалась значительная гибель клеток, что в конечном счете приводило к образованию отдельных колоний в течение нескольких дней. При
§
6,0 q
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
MCF-7
MDA-MB-231
MDA-MB-468
lO
Л
о
-ill"-It. I-
Q<
И Пп. fi
s
cc
CQ
Q
cc §
CL cc
CQ
8
55
£ m
55
§
cc
£ Q. Q.
Q §
8 §
§ I
cc °=
Рис. 1. Конститутивный уровень экспрессии генов системы гомологичной рекомбинации в исследуемых клеточных культурах Fig. 1. Initial level of expression of genes of the homologous recombination system in the studied cell cultures
чт
СЧ
о
СЧ
СЧ
>-
(J
о
-J
о и z о
ОС <
о ж
to
< >
а
<
достижении 90 % конфлюэнтности одну часть клеточной суспензии брали для анализа изменения активности генов ГР, а другую снова пересеивали в культуральные флаконы для повторения воздействия препаратами.
При анализе генетического ландшафта опухолевых клеток РМЖ обнаружены изменения, вызванные селективным действием химиопрепаратов. Установлено изменение аберраций числа копий ДНК для генов BRCA1, BRCA2, CDK12, CHEK1, PALB2 и RAD51D в MCF-7. Показано сужение спектра нарушений для BRCA1, CDK12, CHEK1 и RAD51D (восстановление нормальной копийности). К 3-му пассажу обнаружены амплификации генов BRCA2 и PALB2 (табл. 3). Следует отметить, что доцетаксел не оказывал такого действия, и частота встречаемости делеций и ампли-фикаций не изменялась за исключением гена PARP1, у которого в конечной точке наблюдалось появление делеции (табл. 4). Для MDA-MB-231 также был проведен аналогичный анализ, который тоже показал изменение хромосомных аберраций генов системы ГР в сторону увеличения копийности (см. табл. 3). В частности, продемонстрировано, что все выявленные ло-кусы с делециями, где локализованы гены BRCA2, BARD1, CHEK2, PALB2 и RAD54L, с течением времени под действием цисплатина восстанавливаются до нормальной копийности. При этом для остальных генов, например BRCA1, наблюдается увеличение копийности, так же как и для BRIP1, FANCL, RAD51B и PARP1. Для трех генов — ATM, CHEK1 и RAD51D — характерно появление делеции. Следует отметить, что возникновение амплификаций в исследуемых генах наблюдалось сразу после 1-го пассажа и сохранялось на протяжении всего действия препарата, что «выгодно» опухолевым
клеткам и позволяет им быть более устойчивыми к повреждению ДНК. Аналогичный результат показан для доцетаксела (см. табл. 4). При этом частота амплифика-ций к 3-му пассажу оказалась выше (62,5 %) по сравнению с действием цисплатина (37,5 %). Делеции генов также восстанавливаются до нормальной копийности, кроме гена CHEK2, делеция в котором сохраняется на протяжении всего действия препарата.
В заключение была проанализирована клеточная культура опухолевых клеток молочной железы MDA-MB-468, в которой полностью отсутствовали делеции в генах ГР, в 4 генах наблюдались амплификации: ATM, CHEK1, RAD54L, PARP1, остальные гены имели нормальную копийность (см. табл. 3). Таким образом, согласно рабочей гипотезе под воздействием ДНК-повреждающих агентов изменение параметров исследуемых генов будет минимальным, поскольку опухолевые клетки не имеют дефицита в репаративной активности ДНК. В данном случае под влиянием цисплатина происходит увеличение копийности только гена BRCA1. Через 24 ч и после 1-го пассажа детектируются делеции в генах PALB2 и PPP2R2A, но на 2-м и 3-м пассажах они элиминируются. Действие доцетаксела полностью не оказывает влияния на данную клеточную культуру (см. табл. 4).
Равно как и изменение CNA под действием препарата, изменяется и экспрессия исследуемых генов. Несмотря на то что данная величина вариабельна, наглядно было показано статистически значимое увеличение экспрессии генов BRCA1 (p = 0,04), BRCA2 (p = 0,02), PALB2 (p = 0,01) и RAD51D (p = 0,05) от нативного варианта к 3-му пассажу в MCF-7. Это может свидетельствовать об активации процесса ГР (рис. 2, а). Причем при воздействии доцетаксела изменения экспрессии
о
а.
в;
о ж.
и >
0
УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ / ADVANCES IN MOLECULAR ONCOLOGY 2 ' 2024
Таблица 3. Наличие хромосомных аберраций в генах системы гомологичной рекомбинации в клеточных культурах MCF- 7, MDA-MB-231 и MDA-MB-468 под действием ци-сплатина в разные промежутки воздействия препарата
Table 3. The presence of chromosomal aberrations in the genes of the homologous recombination system in cell cultures MCF- 7, MDA-MB-231 and MDA-MB-468 under the influence of cisplatin at different periods of exposure to the dtvg
Gen MCF-7, цисплатин (10 мкг/мл MDA-MB-231, цисплатш (40 мкг/мл) MDA-MB-468, цисплатин (40 мкг/мл)
MCF-7, cisplatin (10 (ig/ml) MDA-MB-231 И5МШП MDA-MB-468, cisplatin (40 |ig/ml)
Исходные CNA Через 24 ч 1-й пассаж 2-й пассаж 3-й пассаж Исходные CNA Через 24 ч 1-й пассаж 2-й пассаж 3-й пассаж Исходные CNA Через 24 ч 1-й пассаж 2-й пассаж 3-й пассаж
Original CNAs In 24 h Fassage 1 Fassage 2 Fassage 3 Original CNAs In 24 h Fassage 1 Fassage 2 Fassage 3 Original CNAs In 24 h Fassage 1 Fassage 2 Fassage 3
BRCA1 Del Del N N N N N Ampi N Ampi N N N Ampi Ampi
BRCA2 N N Ampi N Ampi Del Del N N N N N N N N
ATM Del Del Del Del Del N N Ampi Del Del Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi
BARD1 N N N N N Del Del N N N N N N N N
BRIP1 Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
CDK12 Del Del Del N N N N Ampi Del Del N N N N N
CHEK1 Del Del Del N N N N Ampi Del Del Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi
CHEK2 N N N N N Del Del Del N N N N N N N
FANCL N N N N N N N Ampi N Ampi N N N N N
PALB2 N N Ampi Ampi Ampi Del Del N N N N Del Del N N
PPP2R2A N N N N N N N N N N N Del Del N N
RAD51B Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
RAD51C Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
RAD51D Del Del Del N N N N Ampi Del Del N N N N N
RAD54L N N N N N Del Del N N N Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi
PARP1 N N N N N N N Ampi N Ampi Ampi Ampi N Ampi Ampi
Примечание. Здесь и в табл. 4:1-й пассаж — через 2 нед после воздействия (после 1-й дозы препарата); 2-й пассаж 3-й дозы препарата; CNA — аберрации числа копий ДНК.
Note. Here and in table 4: passage 1 — 2 weeks after exposure (after 1" dose of the drug); passage 2— after the 2^ dose of the dtvg; passage 3 -ofDNA.
— после 2-й дозы препарата; 3-
- after the 3rd dose of the dtvg; CNA —
и пассаж — после copy number aberrations
Таблица 4. Наличие хромосомных аберраций в генах системы гомологичной рекомбинации в клеточных культурах MCF- 7, MDA-MB-231 и MDA-MB-468 под действием доце-таксела в разные промежутки воздействия препарата
Table 4. The presence of chromosomal aberrations in the genes of the homologous recombination system in cell cultures MCF- 7, MDA-MB-231 and MDA-MB-468 under the influence of docetaxel at different periods of exposure to the dtvg
MCF-7, доцетаксел (50 мкг/мл)
Исходные CNA
Original
CNAs
1-й
пассаж
2-й пассаж
Passage I Passage
3-й пассаж
Passage 3
MDA-MB-231, доцетаксел (50 мкг/мл)
MDA-MB-231, docetaxel (50 |ig/ml)
Исходные CAN
Original
CNAs
Через 24 ч
1-й
пассаж
2-й пассаж
age I Passage 2
3-й пассаж
MDA-MB-468, доцетаксел (50 мкг/мл)
MDA-MB-468, docetaxel (50 |ig/ml)
Исходные CAN
Через 24 ч
1-й
пассаж
2-й пассаж
3-й пассаж
Original CNAs I In 24 h
BRCA1 Del Del Del Del Del N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
BRCA2 N N N N N Del Del N N N N N N N N
ATM Del Del Del Del Del N N Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi
BARD1 N N N N N Del Del N N N N N N N N
BRIP1 Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
CDK12 Del Del Del Del Del N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
CHEK1 Del Del Del Del Del N N Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi
CHEK2 N N N N N Del Del Del Del Del N N N N N
FANCT N N N N N N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
PALB2 N N N N N Del Del N N N N N N N N
PPP2R2A N N N N N N N N N N N N N N N
RAD51B Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
RAD51C Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
RAD51D Del Del Del Del Del N N Ampi Ampi Ampi N N N N N
RAD54T N N N N N Del Del N N N Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi
PARP1 N N N N Del N N Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi Ampi
УСПЕХИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ / ADVANCES IN MOLECULAR ONCOLOGY 2 ' 2024
§
— p\i
и и
ее се
CQ CQ
До воздействия / Before exposure
Через 24 ч/ In 24 h
1-й пассаж / Passage 1
2-й пассаж / Passage 2
3-й пассаж / Passage 3
Рис. 2. Уровень экспрессии генов системы гомологичной рекомбинации в клеточной культуре MCF-7 до воздействия препарата и через временные промежутки после него: а — данные для цисплатина; б — данные для доцетаксела. 1-й пассаж — через 2 нед после воздействия (после 1-й дозы препарата); 2-й пассаж — после 2-й дозы препарата; 3-й пассаж — после 3-й дозы препарата. Звездочкой помечены статистически значимые различия между группами
Fig. 2. Level of expression of genes of the homologous recombination system in the MCF-7 cell culture before exposure to the drug and at time intervals after exposure: а — data for cisplatin; б — data for docetaxel. Passage 1 — 2 weeks after exposure (after 1st dose of the drug); passage 2 — after the 2nd dose of the drug; passage 3 — after the 3d dose of the drug. Statistically significant differences between groups marked with an asterisk
а
— <4
О О
ее СС
CQ СО
чт
СЧ О СЧ
СЧ
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
4,0
........iii.HI -
£ ш
5 ц
и г fi
о
а.
в;
о ж.
и >
До воздействия / Before exposure
Через 24 ч/ In 24 h
1-й пассаж / Passage 1
2-й пассаж / Passage 2
3-й пассаж / Passage 3
Рис. 3. Уровень экспрессии генов системы гомологичной рекомбинации в клеточной культуре MDA-MB-231 до воздействия препарата и через временные промежутки после воздействия: а — данные для цисплатина; б — данные для доцетаксела. 1-й пассаж — через 2 нед после воздействия (после 1-й дозы препарата); 2-й пассаж — после 2-й дозы препарата; 3-й пассаж — после 3-й дозы препарата. Звездочкой помечены статистически значимые различия между группами
Fig. 3. Level of expression of genes of the homologous recombination system in the MDA-MB-231 cell culture before exposure to the drug and at time intervals after exposure: а — data for cisplatin; б — data for docetaxel. Passage 1 — 2 weeks after exposure (after 1st dose of the drug); passage 2 — after the 2nd dose of the drug; passage 3 — after the 3rd dose of the drug. Statistically significant differences between groups marked with an asterisk
а
б
0
чт
сч О сч
сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
6,0 5,5 5,0 4,5
I 4,0 essr
I 3,5
Щ
g 3,0 си
с
е 2,5 р 2,5
п
% 2,0 1,5 1,0 0,5 0
1ji£L
illiril1! 1,111
ьЛ
L
|l
i Jy i ju ..^.i i.
Jl
5
cc
B
2
5
cc
B
Q
cc §
IP
cc
B
s
55
£ Uj
55
Q §
Q §
Q
s
8 §
о
a. те
£
о ж.
и >
5,5 5,0
4,5 c 4,0
о
И
is 3,5 xpr
^ 3,0
р
п
с
^
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0
_be
— (M
S 5
cc CC
BB
Q
cc §
IP
ас
B
lMlIiJLlJillJli,i,jj^iJli.Miii
2 Si Щ
P
и u
£ Uj
и г fi
§
cc £
P P
CQ U
а а
S ^
cc cc
Q —и ^
in ^
§ 1 cc °=
До воздействия / Before exposure
Через 24 ч / In 24 h
1-й пассаж / Passage 1
2-й пассаж / Passage 2
3-й пассаж / Passage 3
а
б
Рис. 4. Уровень экспрессии генов системы гомологичной рекомбинации в клеточной культуре MDA-MB-468 до воздействия препарата и через временные промежутки после воздействия: а — данные для цисплатина; б — данные для доцетаксела. 1-й пассаж — через 2 нед после воздействия (после 1-й дозы препарата); 2-й пассаж — после 2-й дозы препарата; 3-й пассаж — после 3-й дозы препарата. Звездочкой помечены статистически значимые различия между группами
Fig. 4. Level of expression of genes of the homologous recombination system in the MDA-MB-468 cell culture before exposure to the drug and at time intervals after exposure: а — data for cisplatin; б — data for docetaxel. Passage 1 — 2 weeks after exposure (after 1st dose of the drug); passage 2 — after the 2nd dose of the drug; passage 3 — after the 3d dose of the drug. Statistically significant differences between groups marked with an asterisk
практически не обнаруживаются. Изначально высокий уровень экспрессии характерен для ВЛК01 (р = 0,03), ВЫР1 (р = 0,02), ВЛБ51В (р = 0,02) и ВЛБ51С (р = 0,05). При воздействии препарата наблюдается снижение экспрессии данных генов. Для остальных генов ГР ее уровень в среднем приближен к нормальному (рис. 2, б).
Анализ экспрессии в культуре MDA-MB-231 показал увеличение к 3-му пассажу уровня ВЯСЛ1 (р = 0,02), ВЯСЛ2 (р = 0,02), СНЕК2 (р = 0,05), FЛNCL (р = 0,04), РЛЬВ2 (р = 0,05), ЯЛБ51С (р = 0,02) и РЛЕР1 (р = 0,02), что соответствует появлению амплификаций в данных генах (рис. 3, а). Несмотря на то что под действием доцетаксела также происходит изменение генетического ландшафта клеточной культуры, экспрессионный портрет исследуемых генов значительно не изменяется. Так, уровень экспрессии ВЯСЛ1 не превышает 1, что ниже, чем в нормальных клетках молочной железы; это также характерно для остальных генов. Исключение составляют такие гены, как ВЛКБ1 (р = 0,02), СНЕК1 (р = 0,03) и РРР2Я2Л (р = 0,08). Для них характерны гиперэкспрессия во 2-м пассаже и незначительное снижение экспрессии к 3-му пассажу (рис. 3, б).
На последнем этапе оценена экспрессия исследуемых генов в клеточной культуре MDA-MB-468. Уровень экспрессии ВЯСЛ1 увеличивался прямо пропорционально длительности действия препарата (рис. 4, а) и к 3-му пассажу стал в 2 раза больше, чем в клетках, не подверженных воздействию (р = 0,02). Стоит обратить внимание, что под действием доцетаксела наблюдается сильная вариация в экспрессии генов. Только для СНЕК1 установлено увеличение экспрессии (р = 0,01), для многих генов показано увеличение экспрессии через 24 ч после, через 2 ч воздействия препаратом и после 2-й его дозы, затем наблюдается снижение уровня экспрессии до начальных значений (рис. 4, б).
Таким образом, на клеточных культурах было установлено снижение количества нарушений генов ГР под действием цисплатина. При этом клеточные культуры, имеющие делеции и низкую экспрессию в генах ГР, восстанавливали копийность, а в некоторых случаях проявляли развитие структурной (амплификации, ир-регуляция экспрессии) компенсаторности дефицита ГР. Важно отметить, что изменения параметров генов ГР наступают через длительное воздействие препарата, преимущественно уже через 2 нед наблюдаются первичные изменения.
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты нашей работы показали, что под селективным действием цисплатина может происходить изменение генетического ландшафта и экспрессион-ного портрета генов ГР. В недавнем исследовании изучена чувствительность 12 клеточных культур РМЖ при наличии/отсутствии у них фенотипа BRCAness [6]. В частности, показано, что BRCA-подобные клетки демонстрируют слабую положительную корреляцию с чувствительностью к доцетакселу (г = 0,377; р = 0,039).
Также обнаружена отрицательная корреляция между BRCA-подобными клетками и чувствительностью к цисплатину (r = —0,407; p = 0,013).
В настоящее время BRCA-подобные опухоли исследуют не только в качестве прогностического биомаркера, но и как новую терапевтическую стратегию. Интересные результаты были получены A. Min и соавт. (2015) и C. Mio и соавт. (2019), которые установили, что индукция фенотипа BRCAness может быть достигнута за счет эпигенетического подавления BRCA1/2 и усиления активности химиопрепаратов [7, 8]. Согласно полученным данным, низкая эффективность препаратов платины может быть связана с тем, что ГР восстанавливается под действием неоадъювантной ХТ [9]. Другие авторы показали, что совокупное воздействие ХТ является наиболее вероятным фактором вторичных генетических изменений [10]. Например, цикло-фосфамид, обычно используемый у пациентов с карциномой молочной железы, является агентом, сшивающим ДНК, и теоретически может индуцировать или определять восстановление BRCA1/2 дикого типа аналогично соединениям платины. Подтверждением этому служат результаты исследования больных с опухолью яичников: 13 из 46 рецидивирующих карцином имели вторичную мутацию генов BRCA1/2 по сравнению с 2 из 64 первичных карцином (p = 0,0003) [11]. При этом в 12 из 26 платинорезистентных рецидивов наблюдались вторичные мутации, восстанавливающие генотип BRCA1/2 по сравнению с 1 из 19 платиночувствительных рецидивов (p = 0,003). Авторы предположили, что вторичные мутации могут присутствовать в первичной карциноме из-за нестабильности генома и уже затем выбиваться с помощью ХТ. Кроме этого, вторичные мутации могут встречаться в редких клетках первичной карциномы. Но остается открытым вопрос: существуют ли вторичные мутации, восстанавливающие BRCA1/2 при первичном раке яичников без проведения ХТ [11].
Результаты ранее проведенного исследования показали, что наличие мутации BRCA2 5193C>G (Y1655X) в клеточной линии аденокарциномы яичника PEO1 определяет дефицит BRCA2 и высокую чувствительность к цисплатину [12]. Обработка PEO1 цисплатином привела к восстановлению функционирования BRCA2 вследствие появления другой вторичной мутации. Еще в одном исследовании установлено, что амплификации могут напрямую или опосредованно влиять на резистентность. Амплификация гена NBN в клетках РМЖ и яичников приводит к BRCAl-зависимой устойчивости к олапарибу [13]. Установлено, что применение ингибиторов фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) снижает экспрессию генов BARD1 и BRCA1 в клетках, устойчивых к тамоксифену, и повторно повышают их чувствительность к цисплатину как in vitro (MCF-7 и T47D), так и in vivo [14].
Таким образом, настоящее исследование показало, что под действием цисплатина может происходить
чт
сч о сч
сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о
а.
в;
£
о ж.
и >
128
экспериментальные статьи | experimental reports
тОм 11 / VOL.
чт
сч о сч
сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
реверсия не только мутаций генов ГР, но и других нарушений. При этом данный механизм был описан in vitro на линии BRCA2-мутированного рака поджелудочной железы, но считался основным фактором развития резистентности при РМЖ, раке яичников, поджелудочной и предстательной желез [15—18]. Кроме того, реверсии, ассоциированные с резистентностью к P A R P -
ингибиторам и препаратам платины, обнаружены не только в генах BRCA1/2, но и в других генах ГР, таких как RAD51C, RAD51D и PALB2 [19].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, было выявлено, что формирование резистентности к химиопрепаратам может происходить за счет не только реверсивных мутаций в генах ВКСЛ1/2, но и изменения количества копий ДНК генов ГР. Кроме того, полученные данные указывают на необходимость исследования механизмов пульсирующей функциональности генов ГР в опухоли в процессе ее развития и лечения, что и может являться основным фактором формирования резистентности опухолевых клеток.
о ж
ю
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
< >
а
<
о m
а. те
m
о ж.
U >
1. Turner N.C., Reis-Filho J.S. Basal-like breast cancer
and the BRCA1 phenotype. Oncogene 2006;25(43):5846-53. DOI: 10.1038/sj.onc.1209876
2. Jia X., Wang K., Xu L. et al. A systematic review and meta-analysis of BRCA1/2 mutation for predicting the effect of platinum-based chemotherapy in triple-negative breast cancer. The Breast 2022;66:31-9. DOI: 10.1016/j.breast.2022.08.012
3. Sokolenko A.P., Savonevich E.L., Ivantsov A.O. et al. Rapid selection of BRCAl-proficient tumor cells during neoadjuvant therapy for ovarian cancer in BRCA1 mutation carriers. Cancer Lett 2017;397(1):127-32. DOI: 10.1016/j.canlet.2017.03.036
4. Sokolenko A.P., Bizin I.V., Preobrazhenskaya E.V. et al. Molecular profiles of BRCAl-associated ovarian cancer treated by platinum-based therapy: analysis of primary, residual and relapsed tumors. Int J Cancer 2020;146(7):1879-88. DOI: 10.1002/ijc.32776
5. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 2001;29(9):45.
DOI: 10.1093/nar/29.9.e45
6. Teraoka S., Muguruma M., Takano N. et al. Association of BRCA mutations and BRCAness status with anticancer drug sensitivities in triple-negative breast cancer cell lines. J Surg Res 2020;250:200-8. DOI: 10.1016/j.jss.2019.12.040
7. Min A., Im S.-A., Kim D.K. et al. Histone deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), enhances anti-tumor effects of the poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor olaparib in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer Res 2015;17(1):1—13. DOI: 10.1186/s13058-015-0534-y
8. Mio C., Gerratana L., Bolis M. et al. BET proteins regulate homologous recombinationmediated DNA repair: BRCAness
and implications for cancer therapy. Int J Cancer 2019;144(4):755—66. DOI: 10.1002/ijc.31898
9. Lord C.J., Ashworth A. BRCAness revisited. Nat Rev Cancer 2016;16(2):110-20. DOI: 10.1038/nrc.2015.21
10. Fleming R.A. An overview of cyclophosphamide and ifosfamide pharmacology. Pharmacotherapy 1997;17(5 Pt. 2):146—54.
11. Norquist B., Wurz K.A., Pennil C.C. et al. Secondary somatic mutations restoring BRCA1/2 predict chemotherapy resistance
in hereditary ovarian carcinomas. J Clin Oncol 2011;29(22):3008-15. DOI: 10.1200/jc0.2010.34.2980
12. Sakai W., Swisher E.M., Jacquemont C. et al. Functional restoration of BRCA2 protein by secondary BRCA2 mutations in BRCA2-mutated ovarian carcinoma. Cancer Res 2009;69(16):6381-6. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-09-1178
13. Wu Z., Li S., Tang X. et al. Copy number amplification of DNA damage repair pathways potentiates therapeutic resistance in cancer. Theranostics 2020;10(9):3939-51. DOI: 10.7150/thno.39341
14. Zhu Y., Liu Y., Zhang C. et al. Tamoxifen-resistant breast cancer cells are resistant to DNA-damaging chemotherapy because
of upregulated BARD1 and BRCA1. Nat Commun 2018;9(1):1-11. DOI: 10.1038/s41467-018-03951-0
15. Afghahi A., Timms K.M., Vinayak S. et al. Tumor BRCA1 reversion mutation arising during neoadjuvant platinum-based chemotherapy in triple-negative breast cancer is associated with therapy resistance. Clin Cancer Res 2017;23(13):3365-70.
DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-16-2174
16. Weigelt B., Comino-Méndez I., De Bruijn I. et al. Diverse BRCA1 and BRCA2 reversion mutations in circulating cell-free DNA
of therapy-resistant breast or ovarian cancer. Clin Cancer Res 2017;23(21):6708-20. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-17-0544
17. Pishvaian M.J., Biankin A.V., Bailey P. et al. BRCA2 secondary mutation-mediated resistance to platinum and PARP inhibitor-based therapy in pancreatic cancer. Br J Cancer 2017;116(8):1021-6. DOI: 10.1038/bjc.2017.40
18. Goodall J., Mateo J., Yuan W. et al. Circulating cell-free DNA to guide prostate cancer treatment with PARP inhibition. Cancer Discov 2017;7(9):1006-17.
DOI: 10.1158/2159-8290.CD-17-0261
19. Feng L., Fong K.-W., Wang J. et al. RIF1 counteracts BRCA1-mediated end resection during DNA repair. J Biol Chem 2013;288(16):11135-43. DOI: 10.1074/jbc.M113.457440
Вклад авторов vj М.М. Цыганов: написание текста статьи;
А.А. Фролова: получение данный для анализа; ®
Е.А. Кравцова: обзор публикаций по теме статьи; ^
И.А. Цыщенова: анализ полученный данный; * М.К. Ибрагимова: разработка дизайна исследования. Authors' contributions
M.M. Tsyganov: article writing; ^
A.A. Frolova: obtaining data for analysis; О
E.A. Kravtsova: reviewing of publications of the article's theme; q
I.A. Tsydenova: analysis of the obtained data; (.J
M.K. Ibragimova: developing the research design. ^
ORCID авторов / ORCID of authors
М.М. Цыганов / M.M. Tsyganov: https://orcid.org/0000-0001-7419-4512 -1
А.А. Фролова / A.A. Frolova: https://orcid.org/0000-0003-3297-1680 3
Е.А. Кравцова / E.A. Kravtsova: https://orcid.org/0000-0002-9022-7764 ш
И.А. Цыденова / I.A. Tsydenova: https://orcid.org/0000-0002-2716-3075 О
М.К. Ибрагимова / M.K. Ibragimova: https://orcid.org/0000-0001-8815-2786 Ж
Z
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interest. ш
Финансирование. Исследование вытолнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-15-00169).
>
а
<
Funding. This research was funded by the Russian Science Foundation (grant No. 22-15-00169).
О
a.
в;
£
о ж.
и >
Статья поступила: 03.03.2024. Принята к публикации: 09.04.2024. Article submitted: 03.03.2024. Accepted for publication: 09.04.2024.
