CC BY
30ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2007, том 49, № 12, с. 2042-2062
УДК 541.64:678.84
МОДИФИКАЦИЯ ТВЕРДЫХ МАТЕРИАЛОВ ПОЛИМЕРНЫМИ НАНОСЛОЯМИ КАК СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
НОВЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ1
© 2007 г. В. П. Зубов*, Д. В. Капустин*, А. Н. Генералова*, Е. Ю. Ягудаева*, А. А. Вихров*, С. В. Сизова*, М. Р. Муйдинов**
*Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Институт проблем химической физики Российской академии наук 142432 Черноголовка Московской обл., пр. Ак. Семенова, 1
Обсуждаются результаты исследований по химическому нанесению полимерных покрытий нано-размерной толщины на пористые и плоские неорганические матрицы и созданию полимерных оболочек нано- и микрочастиц. Подробно методики нанесения однородных бездефектных покрытий рассмотрены на примерах политетрафторэтилена, полианилина и их производных. Модифицированные наноразмерными слоями политетрафторэтилена и полианилина матрицы являются перспективными биоматериалами для одностадийного выделения нуклеиновых кислот из сложных биологических смесей (лизатов клеток и тканей, цельной крови, растительного сырья), а также для высокоэффективной хроматографии белков и других биополимеров. Рассмотрены подходы к получению полимерных оболочек на люминесцентных нанокристаллах (CdSe)ZnS путем включения последних в микрочастицы на основе сополимеров акролеина и стирола и формирования полимерных оболочек непосредственно на наночастицах. Показана перспективность люминесцентных нанокри-сталлов, модифицированных полимерами, в качестве биоаналитических реагентов.
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время возрастающее внимание привлекают продукты и системы с наноразмерными компонентами. Наноструктурированные полимерные продукты оказались весьма перспективными в таких областях, как электроника и информатика, катализаторы и биомедицинские материалы. Широкое применение полимерных на-номатериалов требует разработки новых эффективных технологий их получения. Причина состоит в том, что наиболее распространенная в настоящее время "технологическая цепочка" производства изделий из полимеров, предусматривающая на первом этапе синтез макромолекул, а на втором переработку полимера, как правило, не способна обеспечить получение нанострукту-рированных материалов. Одним из подходов к решению этой проблемы может быть совмещение синтеза макромолекул и получение нанострукту-рированного продукта в одну стадию, иными сло-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Европейского сообщества < 500804 (NMP4-CT-2004-500804).
E-mail: [email protected] (Капустин Дмитрий Валерьевич).
вами, его прямой синтез. Примеров такого подхода к получению композиций из полимеров на макро- и микроуровнях в технологии полимеров известно немало. К ним можно отнести получение материалов и композитов из отверждающих-ся олигомеров, органического стекла полимеризацией непосредственно в формах, дисперсий полимеров (латексов) путем эмульсионной или микросуспензионной полимеризации. Однако переход к получению наноструктурированных объектов, несомненно, потребует разработки новых методических и технологических подходов.
В настоящей работе рассматриваются некоторые результаты исследований, проведенных в основном в лаборатории Полимеры для биологии Института биоорганической химии РАН по синтезу наноструктурированных систем и по изучению их свойств как биоматериалов. В качестве наноструктурированных объектов (нанокомпо-зитов) рассматриваются полимерные покрытия наноразмерной толщины на пористых и плоских матрицах и полимерные оболочки на нано- и микрочастицах.
2042
ПОЛИМЕРНЫЕ ПОКРЫТИЯ НАНОРАЗМЕРНОЙ ТОЛЩИНЫ НА ПОРИСТЫХ И ПЛОСКИХ НЕОРГАНИЧЕСКИХ МАТРИЦАХ
Постановка такой задачи определялась теми обстоятельствами, что разработки новых биомедицинских материалов, таких как хроматографи-ческие сорбенты для биосепарации и биоанализа, матриц для иммобилизации биолигандов и биокатализаторов (ферментов), биосенсоров и биолигандов и т.д., с одной стороны, предполагает взаимодействие матриц с биологическими нанораз-мерными объектами (молекулами и частицами), а с другой, - полностью соответствует современной тенденции развития биоаналитических, как правило инструментальных, методов к все большей миниатюризации и автоматизации.
Типичными "рабочими телами" для подобных систем являются пористые или плоские твердые матрицы. Полимерные матрицы позволяют обеспечить высокую химическую стабильность, заданные адсорбционные свойства, наличие необходимых функциональных (якорных) групп, биосовместимость, но в то же время они, как правило, не обладают достаточной жесткостью и не дают возможности получения структурно однородных мезопористых систем (^пор ~ 10-100 нм). Неорганические матрицы (на основе оксидов кремния, алюминия и т.д.), наоборот, позволяют получать морфологически совершенные жесткие мезопористые и непористые матрицы, но не обеспечивают достаточного химического разнообразия структуры поверхностного слоя, наличия со-
ответствующих функциональных (якорных) групп, устранения неспецифической сорбции биологических молекул и частиц, а также химической стабильности матриц, особенно при повышенных значениях рН среды. Широко применяемая поверхностная модификация неорганических матриц кремнийорганическими соединениями лишь частично устраняет эти недостатки.
Авторами был предложен подход, позволяющий сочетать в одном материале преимущества неорганических и органических полимерных материалов [1]. Суть его состоит в нанесении однородных полимерных слоев различного химического строения толщиной 2-10 нм на поверхность неорганических матриц, в результате чего получают соответствующий нанокомпозитный материал, поверхность которого, контактирующая с биологическими молекулами и частицами, будет вести себя как соответствующий полимер, а жесткость и морфология (пористость) определяются исходной неорганической матрицей. Прямой синтез таких нанокомпозитов предполагает, что реакции синтеза макромолекул будут совмещаться с образованием однородных полимерных покрытий наноразмерной толщины, в том числе на внутренней поверхности пор, прочно (химически) связанных с матрицей.
Схематически структура (морфология) такого полимерно-модифицированного пористого материала (композита) в сравнении с морфологически менее совершенным композитом того же брутто-состава показана ниже.
Для модификации пористых матриц (материалов) нанослоями полимеров использовали разные макромолекулярные реакции в поверхностных сло-
ях твердых матриц и различные по химической структуре мономеры, олигомеры и активированные полимеры. Ряд примеров представлен ниже.
Графт-полимеризация тетрафторэтилена на поверхности неорганического носителя в ре-(ТФЭ) на остаточных радикалах, образующихся зультате воздействия у-излучения или озона
Б Б \ / С=С Г С\ Б Б
Т-радиация или О3
Б Б I I —С-С— I I Б Б
Радикальная полимеризация трифторстирола,
Б Б I I
-е-е 1
Б
Б Б \ / С=С
р/ II
(Я = -N+R3X-).
Отверждение олигобутадиена дифторидом ксенона
[—и2е-ие=еи-еи2—]х
Б Б I I
-е-е-
Я
ХеБ,
[— оте-ре-ер—сот— ]х
(1)
(2)
(3)
А
/' / / / /' /
Хемосорбция поли-п-нитрофенилакрилата с последующей иммобилизацией биолиганда (липазы)
КВД-Ш-Ь
А ки-(еоН ^га)-^-^
+ цетиламин
-81
А ки-(ео)-
1 V
,/\у! С16Нзз
+ липаза (Ь)^
(ТО)^Н-
С16Н33
-Б!
Окислительная полимеризация анилина
4пКИ
\ /
[о]
N—
(4)
(ТО)-Ш-Ь
(5)
Выбор химического строения полимерного модификатора определялся с учетом его потенциальных характеристик как материала, непосредственно взаимодействующего с биологическими молекулами и частицами. Реакции, исполь-
зуемые для синтеза соответствующих композитов, включали гомо- и сополимеризацию с раскрытием двойной связи виниловых мономеров (ТЭФ, трифторстирола и т.д.), отверждение олигомеров (фторирование олигомеров бутадие-
п
на), хемосорбцию реакционноспособных макромолекул на твердых поверхностях. В последнем случае после химического "прикрепления" макромолекул полимерного модификатора к твердой поверхности остаточные активированные группы, составляющие до 90% от исходных [2], могут быть использованы для введения в хемо-сорбированные макромолекулы различных заместителей. Таким образом, из одной и той же "базовой" матрицы можно получать широкий набор материалов с различным гидрофильно-гидрофобным балансом, с разными ионогенными группами, а также содержащие связанные на полимерных спейсерах биолиганды [3].
Рассмотрим некоторые из приведенных выше реакций подробнее.
Модификация неорганических пористых
матриц наноразмерными слоями ПТФЭ
ПТФЭ является уникальным материалом по своей химической и биологической инертности и по сорбционным свойствам. Однако в силу нерастворимости в известных растворителях, неплавкости и мягкости изготовление на его основе жестких мезопористых матриц с использованием готового полимера не представляется возможным. Эту задачу следует решать, создавая равномерные бездефектные слои полимера на твердой пористой матрице путем непосредственной (прививочной) полимеризации ТФЭ в поверхностных (адсорбционных) слоях. Полимеризацию инициировали как активными центрами, возникающими на поверхности исходных материалов при облучении [4], так и с помощью вещественных инициаторов (озонидов фторолефинов [5]).
Полимеризация ТФЭ на поверхности неорганических материалов описана в литературе (например, в работе [6]), однако сведения о морфологии привитого слоя ПТФЭ и тем более о возможности получения тонкого, равномерного и однородного покрытия на поверхности пористого материала отсутствуют. Как показали предварительные эксперименты, при подаче мономера из газовой или жидкой фазы прививаемый полимер не образует сплошного слоя, а представляет собой отдельные глобулярные образования на поверхности неорганического носителя. Эффективным способом получения привитых полимеров является использование постэффекта, т.е. осу-
ществление прививки за счет стабилизировавшихся на твердой подложке активных центров. При этом для нахождения оптимальных условий синтеза с целью достижения морфологии композита (структура справа) исследовали несколько различных режимов проведения процесса. При этом в качестве подложки использовали макропористое стекло (МПС) со средним диаметром пор 50 нм и средним диаметром частиц 100150 мкм.
Режим 1. Облучение подложки при 27°С с последующим заполнением реактора ТФЭ вне зоны облучения и проведением полимеризации в изотермических условиях.
Режим 2. Облучение подложки при 27°С с последующим намораживанием ТФЭ при 196°С и проведением постполимеризации в процессе разогревания.
Режим 3. Облучение подложки при -196°С с последующим намораживанием ТФЭ вне зоны облучения и проведением постполимеризации в процессе разогревания ("раздельный радиолиз" при -196°С).
Режим 4. Совместное облучение при -196°С после медленного охлаждения подложки с предварительно сорбированным при комнатной температуре ТФЭ и проведение постполимеризации при разогревании системы вне зоны облучения ("совместный радиолиз" при -196°С).
На рис. 1 представлены типичные калориметрические кривые, полученные при использовании разных режимов постполимеризации ТФЭ на некоторых неорганических материалах. Видно, что во всех случаях в ходе прогревания замороженных облученных систем после эндотермического пика плавления мономера при -133°С наблюдается интенсивный широкий экзотермический пик, соответствующий полимеризации ТФЭ, вплоть до полной конверсии мономера. Данные ЭПР указывают на радикальную природу полимеризации. Сложный спектр смеси парамагнитных продуктов в у-облученной при -196°С системе МПС-ТФЭ (рис. 2а) еще до плавления мономера при -168...-153°С переходит в спектр радикала роста ПТФЭ ~CF2-•CF2, не меняющийся до конца процесса (рис. 26). Концентрация накопленных в результате облучения парамагнитных центров в МПС в отсутствие мономера при раз-
Время, мин Время, мин
Рис. 1. Калориметрические кривые разогревания образцов МПС + ТФЭ (а) и А1^3 + ТФЭ (б): 1 - сорбция ТФЭ в течение 20 мин при 27°С, без облучения; 2 - облучение при 27°С дозой 50 (а) или 0.5 кГр (б) с последующим намораживанием ТФЭ при -196°С (режим 2); 3 - облучение при -196°С дозой 50 (а) или 0.5 кГр (б) с последующим намораживанием ТФЭ при -196°С (режим 3); 4 - сорбция ТФЭ в течение 20 мин при 27°С, медленное охлаждение, облучение при -196°С дозой 50 (а) или 0.5 кГр (б) (режим 4); w - скорость тепловыделения.
Рис. 2. Спектры ЭПР при радиолизе системы МПС + ТФЭ: а - МПС (0.18 г) + ТФЭ (0.40 г) после облучения при -196°С; • - тот же образец после нагревания до -168°С. Регистрация спектров при -196°С.
мораживании образца практически не меняется вплоть до -23°С. В системе МПС-ТФЭ в области плавления мономера гибнет до ~75% радикалов, зато концентрация оставшихся радикалов прак-
тически не меняется во всем температурном интервале протекания постполимеризации вплоть до комнатной температуры, т.е. полимеризация происходит по механизму "живых" цепей.
20
40
20 40
£пор, нм
20
40
Структура А
Структура Б
Структура В
Рис. 3. Дифференциальные кривые распределения пор по размерам для исходного (1) и модифицированного (2) МПС (10% ПТФЭ), а также пористая структура полученного материала: а - режим 1 или 2 (без предварительной сорбции ТФЭ, структура А); • - режим 3 (без предварительной сорбции ТФЭ, структура Б); в - режим 4 (с предварительной сорбцией ТФЭ, структура В).
Таким образом, полимеризационное нанесение (прививка) заданного количества ПТФЭ на твердую матрицу не представляется достаточно сложной задачей и может быть осуществлено целым рядом способов. Однако возникает вопрос, достигается ли при этом необходимая морфология композита, т.е. образование наноразмерного однородного слоя ПТФЭ на поверхности мезопо-ристой матрицы, в том числе на внутренней поверхности пор. Ответ на поставленный вопрос можно получить методами порометрии. Оказалось, что композиты, полученные в режиме 1, 2 и 3, не обладают необходимой морфологией (рис. 3а и 36). Несмотря на уменьшение объема пор, средний диаметр пор практически не меняется, возможно появление новых сателлитных максимумов на кривых распределения пор по размерам. Эти результаты можно интерпретировать как преимущественное образование полимера на внешней поверхности пористых гранул, возникновение пробок в порах и малую степень модификации внутренней поверхности пор.
Совершенно другой морфологией при том же количестве привитого ПТФЭ обладает материал,
полученный в режиме 4 (рис. 3в). Видно, что объем и средний диаметр пор закономерно уменьшаются. Полученный материал сохраняет высокую пористость. По данным ртутной порометрии можно определить толщину полимерного покрытия, которая в зависимости от количества введенного ТФЭ составляет от 1-3 до 5-10 нм. Данные величины соответствуют рассчитанным, исходя из количества привитого полимера и полной поверхности пор матрицы. Кроме того, поверхность синтезированных сорбентов плохо смачивается как полярными, так и неполярными жидкостями, т.е. становится "антиадгезионной". Аналогичные результаты получены при проведении прививочной полимеризации фтормономеров, инициируемой с помощью предварительной обработки поверхности исходных материалов озоном [5].
Указанный режим полимеризации позволил решить задачу прямого синтеза композиционного пористого сорбента заданной морфологии. Следующей задачей является введение функциональных групп (аминных, карбоксильных и других) в поверхностный слой привитого ПТФЭ с целью улучшения его смачиваемости водой и присоединения различных биолигандов. Один из подходов
основан на отмеченном выше факте сохранения в полученном постполимеризацией ПТФЭ долго-живущих радикалов, сохраняющих реакционную способность и доступность, что дает возможность "продолжить" химическую модификацию привитого композита после завершения полимеризации ТФЭ на первой стадии.
Введение других мономеров приводит к дополнительной прививке к слою ПТФЭ, что позволяет существенно модифицировать его поверхностные свойства, например улучшить смачиваемость водой, вводить в него функциональные (якорные) группы и т.д. В качестве одного из таких мономеров был выбран аллиламин. Как известно, в результате радикальной полимеризации аллилами-на образуются низкомолекулярные олигомеры со степенью полимеризации п < 10 [7]. Поэтому степень прививки полиаллиламина при введении паров аллиламина в контакт с полученной постполимеризацией пленкой ПТФЭ относительно невелика (<20% от массы привитого ПТФЭ). Однако именно такая прививка не нарушает морфологии и других характеристик слоя ПТФЭ на матрице, но обеспечивает высокую концентрацию поверхностных аминогрупп на химически стойких спейсерах. Поверхностную концентрацию доступных аминогрупп при этом можно контролировать, не только изменяя содержание паров аллиламина в исходной смеси, но также меняя условия проведения постполимеризации. Так, при одновременном введении ТФЭ и аллиламина в реакционную систему, содержащую МПС со средним диаметром пор 50 нм и с удельной поверхностью около 80 м2/г (т.е. проводя постсополимери-зацию), удается получать композиционные материалы с поверхностной концентрацией аминогрупп около 25 мкмоль/г носителя при относительном содержании полимерной фазы в компо-
зите 21.5%. Однако при последовательном введении сомономеров в реакционную систему, содержащую тот же носитель (т.е. при проведении постблок-сополимеризации), поверхностную концентрацию доступных аминогрупп удается повысить практически на порядок - до 240 мкмоль/г носителя при незначительном увеличении содержания полимерной фазы в композите до 24.8%.
Модификация неорганических матриц
нанослоями полианилина и его производных
Уникальные физико-химические свойства полианилина (ПАНИ) определяют широкое использование материалов, содержащих ПАНИ, в различных областях науки и технологии [8]. ПАНИ отличается высокой химической стойкостью, он не растворим в большинстве известных растворителей. Этот полимер обладает высокими электропроводящими (1000 См/см) [9] и газо-разделильными свойствами [10], его можно использовать для защиты металлических поверхностей от коррозии [11], а также в качестве сенсоров различного назначения [12]. Особенности структуры макромолекулы ПАНИ позволяют надеяться на возможность эффективного применения материалов, содержащих ПАНИ, в биомедицинской области, в частности при разделении сложных смесей биополимеров [13]. Кроме того, структура макромолекулы ПАНИ обратимо меняется при изменении рН среды, что позволяет направленно регулировать сорбцион-ные свойства покрытий ПАНИ [14]. Этим определяется значительный интерес к изучению условий полимеризации анилина, обеспечивающих получение однородных наноразмерных нерастворимых покрытий на различных поверхностях.
I
Н
N
Эмеральдиновое основание
+Н+
N I
Н
Н
N I
Н
Эмеральдиновая соль I
+
Н
п
—' п
N I
Н
Эмеральдиновая соль II (полярон)
ПАНИ получают химическим [15] или электрохимическим [16] окислением анилина. Химическая полимеризация анилина в кислой среде при наличии твердой поверхности часто приводит к образованию тонких полимерных покрытий [15, 17], однако механизм образования таких покрытий в фазово-неоднородной системе не вполне ясен. Можно предположить, что эти пленки возникают в результате осаждения и последующего закрепления образующихся в процессе полимеризации анилина полимерных наночастиц на поверхности носителя. Возможность нанесения ПАНИ на пористые матрицы методом химического поверхностного осаждения была показана ранее [13, 17]. Но получение однородных, прочно связанных с поверхностью пленок ПАНИ на поверхности твердых (пористых) носителей при таком осадительном механизме формирования пленки маловероятно. Выход может быть найден при локализации синтеза макромолекул ПАНИ в поверхностных слоях носителя при одновремен-
ном прочном связывании образующегося ПАНИ с поверхностью. Поэтому на первом этапе было исследовано влияние пористых матриц с развитой поверхностью на кинетику и механизм химической полимеризации анилина.
Механизм окислительной полимеризации сложен и, несмотря на большое число публикаций на данную тему [18], остается предметом дискуссий. Однако общепризнанно, что первым этапом реакции является протонирование мономера, затем протекает окисление протонированной формы анилина с получением ион-радикала, образование димеров и олигомеров и, наконец, формирование твердого нерастворимого полимера. Характерными особенностями процесса являются наличие индукционного периода, автокаталитический характер, а также обычно наблюдаемое замедление и прекращение реакции еще до полного исчерпания мономера.
-•п
Типичные кинетические кривые полимеризации анилина, построенные по расходу мономера и по накоплению полимера, приведены на рис. 4.
Их хорошее соответствие друг другу, а также отсутствие в УФ-спектрах реакционной смеси пиков, относящихся к олигомерам анилина, свиде-
Конверсия, % О
Время, мин
Рис. 4. Прирост массы полимера (1) и убыль мономера (2) в процессе полимеризации анилина при мольном соотношении мономер : кислота : : окислитель 1 : 3 : 1. Начальная концентрация анилина 0.02 моль/л.
О
Время, мин
Рис. 5. Убыль мономера при полимеризации анилина: 1 - в отсутствие носителя, 2 - при добавлении 0.01 г ПАНИ, 3 - в присутствии 1 г МПС при соотношении мономер : кислота : : окислитель 1 : 3 : 1. Начальная концентрация анилина 0.02 моль/л.
тельствуют о том, что при мольном соотношении мономер : допант (соляная кислота) : окислитель, равном 1 : 3 : 1, концентрация всех промежуточных продуктов очень мала. Б-образный вид кинетических кривых указывает на автокаталитический характер образования макромолекул ПАНИ, что, в частности, обсуждалось ранее в работе [19]. Непосредственным доказательством автокатализа полимером служит то, что при добавлении в реакционную систему навески ПАНИ непосредственно после смешивания раствора мономера с раствором окислителя изменяется форма кинетической кривой полимеризации. Продолжительность индукционного периода сокращается, а на кривой убыли мономера появляется вторая ступень. Было показано, что продолжительность индукционного периода линейно убывает в зависимости от массы добавляемого ПАНИ [20]. Автокаталитическое действие полимера на процесс полимеризации, по-видимому, определяется тем, что электронные переносы, приводящие к образованию катион-радикалов анилина, происходят на поверхности полианилиновых частиц, следовательно, скорость полимеризации в поверхностном слое увеличивается [19], чему соответствует наличие первой ступени на кривой убыли мономера (рис. 5, кривая 2). Следующее за этим снижение скорости полимеризации связано с прекращением эффективного каталитического действия добавленных частиц ПАНИ по мере их "зарастания" вновь образовавшейся полимерной
пленкой. В дальнейшем полимеризация протекает преимущественно на частицах "свежего" ПАНИ, образующихся в объеме реакционной системы, что, вероятно, является причиной появления второй ступени на кинетической кривой (рис. 5, кривая 2). Таким образом, при модификации поверхности носителя ПАНИ важно получить первый слой полимера, причем образование последующих слоев будет катализироваться полимером предыдущего слоя. Очевидно, что природа поверхности используемого носителя может заметно влиять на характер полимеризации.
Присутствие макропористого стекла практически не изменяет вид кинетической кривой полимеризации анилина (рис. 5, кривая 3), наблюдаемой в отсутствие носителя. Иными словами, поверхность кремнезема не оказывает каталитического действия на полимеризацию анилина, по-видимому, потому, что силанольные группы МПС в кислой среде не являются достаточно сильными центрами сорбции компонентов реакционной системы. Вследствие этого анилин поли-меризуется не только на поверхности кремнезема в виде пленки, но также и в объеме реакционной смеси. Так, в случае полимеризации анилина в присутствии МПС до 40% мономера расходуется на образование взвеси частиц ПАНИ.
Необходимость протонирования анилина на первой стадии окислительной полимеризации указывает на то, что в качестве матриц должны
Удельный объем пор, см3/г 0.8
0.6 Ь Ц 1
0.4
0.2
I 1ЫН1 гг[
0.6
0.4
0.2
10-
)ц_
IШШИШ III < \Л I и4 1 ♦■ I | ¿01
10-1 10°
>ш1
100 101 10-2 Радиус пор, мкм
ШЙШМНчФ'! ф^Ч I < + » ГТ1 и I 111
10-1 100 101
Рис. 6. Ртутные порограммы: 1 - исходное МПС, модифицированное сульфированным сшитым полистиролом; 2 - тот же носитель, модифицированный ПАНИ.
2
выступать твердые нерастворимые поликислоты (кислые катионообменники). Поэтому в качестве носителей мы использовали кремнеземы, модифицированные полимерами с различным содержанием сульфогрупп на поверхности. Для получения таких носителей исходный кремнезем модифицировали ПТФЭ, на который прививали ПС с дивинилбензолом методом радиационной пост-блок-сополимеризации. Затем полученный содержащий ПС кремнезем сульфировали концентрированной серной кислотой, варьируя при этом продолжительность реакции.
При полимеризации анилина в присутствии поверхностно сульфированных носителей индукционный период практически исчезает по сравнению с полимеризацией в отсутствие носителя. Несмотря на то, что полимеризацию анилина на поверхности носителей с различной степенью сульфирования проводили в присутствии соляной кислоты, взятой в недостатке (соотношение мономер : допант : окислитель составляет 1 : 0.9 : 1), для всех изученных образцов было характерно синее окрашивание реакционной системы, что свидетельствует об образовании эмеральдиновой соли ПАНИ. При этом частицы ПАНИ в объеме реакционной системы не определяются. Максимальный выход полимера наблюдали при полимеризации анилина в присутствии носителя с максимальной концентрацией (0.109 ммоль/г) сульфогрупп на поверхности.
Морфологию полученных композитов изучали методом ртутной порометрии. Сравнение по-рограмм образцов содержащих ПАНИ сорбентов
на основе сульфированного кремнезема (МПС-ПС-ПАНИ) с порограммами исходного МПС, предварительно модифицированного сульфированным полистиролом (МПС-ПС), показало, что пористость исходного носителя сохраняется, а толщина полианилинового покрытия составляет около 3 нм. Типичные порограммы МПС-ПС и МПС-ПС-ПАНИ представлены на рис. 6. Одновременное сопоставимое уменьшение удельного объема пор и их среднего эффективного диаметра свидетельствует о том, что при проведении окислительной полимеризации анилина в присутствии частиц сульфостиролсодержащего объемно-пористого кремнезема тонкий слой ПАНИ образуется не только на внешней поверхности частиц носителя, но и на внутренней поверхности пор. Пористость исходного носителя сохраняется.
Наличие эффекта экранирования неорганической поверхности полимерной фазой подтверждается данными по устойчивости модифицированного кремнезема к гидролизу кремний-кислородных связей Si-O-Si по сравнению с немодифицированным кремнеземом в щелочных средах. Для этого исследовали изменение концентрации силикат-ионов, образующихся при растворении макропористого стекла в щелочной среде. Кинетические кривые растворения кремнезема, полученные для исходного и модифицированного образцов, представлены на рис. 7. По сравнению с немодифицированным кремнеземом содержащий ПАНИ материал на основе сульфированного кремнезема обладал повышенной стабильностью в условиях щелочного гидролиза, что
D
Время, мин
Рис. 7. Кинетические кривые растворения
МПС (1) и МПС-ПС-ПАНИ (2) в боратном буфере. рН 9.5.
особенно заметно в первые 70 мин процесса. Данное наблюдение позволяет предположить, что поверхность кремнезема, отличающаяся значительной неспецифической сорбцией биомолекул, достаточно защищена полимерным слоем. Таким образом, была показана возможность нанесения практически бездефектных слоев ПАНИ на поверхность кремнеземов с поверхностными суль-фогруппами.
Перспективной задачей является придание слою ПАНИ различной функциональности за счет введения дополнительных функциональных групп (карбоксильной, нитро-, метильной и других). Модификация функциональными группами сформированного на твердой подложке ПАНИ не представляется возможной, поэтому поверхность кремнезема модифицировали сополимерами анилина с м-аминобензойной кислотой, и-нит-роанилином или о-толуидином. Сополимеры анилина с м-аминобензойной кислотой (при мольном соотношении 1 : 1 и 3 : 1) сравнивали с гомополи-мерами анилина и м-аминобензойной кислоты, анализируя ИК-спектры соответствующих пленок и данные элементного анализа (содержание азота и водорода в образцах сополимеров отличалось от теоретического менее чем на 3%). При увеличении содержания звеньев м-аминобензойной кислоты в сополимере интенсивность пика, отвечающего поглощению карбонильной группы кислоты (при V = 1750 см-1), также возрастала. После модификации кремнезема сополимерами анилина с ж-аминобензойной кислотой устойчивое покрытие образуется только в случае преобладания в сополимере звеньев анилина. С ростом
содержания карбоксильных групп сополимеры становятся растворимыми в воде при щелочных значениях рН. Поэтому с целью получения поверхности с повышенным содержанием карбоксильных групп полимерное покрытие получали хемосорбцией активированной карбодиимидом поли-ж-аминобензойной кислоты на поверхности силаминированного кремнезема (аналогично схеме, представленной выше для процесса хемосорб-ции полинитрофенилакрилата). Полученный таким способом композит оказался устойчивым в щелочных средах.
Таким образом, показана возможность варьировать свойства поверхности слоя ПАНИ путем изменения как ее гидрофильности, так и функциональности поверхности за счет введения различных функциональных групп, что позволяет решать некоторые хроматографические задачи.
Применение композиционных полимерсодержащих сорбентов
в биосепарации макромолекул
Разнообразие полимерных наноструктур, получаемых в результате различных полимеризаци-онных процессов, определяет широту областей применения композиционных материалов, что можно наглядно продемонстрировать, в частности, на примерах разделения и очистки биополимеров (нуклеиновых кислот и белков).
Биосепарационное поведение модифицированных ПТФЭ материалов на основе МПС, син-тезирвоанных методом радиационной постполимеризации, иллюстрируется типичной хромато-граммой смеси, содержащей плазмиду pBR 322 из E. Coli, РНК и сопутствующие белки (рис. 8). Видно, что ДНК выходит из колонки в первой фракции в исключенном объеме, РНК слабо удерживается, но также выходит в изократическом режиме. Однако суммарная белковая фракция полностью десорбируется из колонки только водно-органическим элюентом. Полученная смесь белков может быть затем разделена в режиме об-ращенно-фазовой ВЭЖХ, подобно тому, как это представлено на рис. 9 для модельной смеси белков. Механизм удерживания индивидуальных белков при использовании фторполимерных сорбентов сходен с механизмом удерживания на классических С18-фазах [21]. Однако объемы элюирования намного ниже, результатом чего яв-
A
260
C3H7OH, %
50
A
214
30
40
10 20 Время, мин
30
Буфер Б, % 80
-60
Рис. 8. Очистка плазмиды pBR 322 из E. coli от РНК и сопутствующих белков на колонке, упакованной носителем Trisopor™-500, модифицированным ПТФЭ (250 х 4.6 мм) (сорбент получен методом радиационной постполимеризации в присутствии носителя). Элюент 0.01 M Трис-HCl (pH 7.5-8.2), градиент 0-50% н-пропанола в течение 18.5 мин (показан пунктиром), скорость элюирования 100 мкл/мин. 1 - плазмида, 2 -РНК, 3 - белки.
ляется "быстрое" хроматографирование при значительной экономии элюента. Следовательно, фторполимерные композиционные сорбенты эффективны при разделении как нуклеиновых кислот, так и белков. Высокая селективность фторированных полимеров является их общим свойством и определяется очень низкой поверхностной энергией соответствующих покрытий [22].
Аналогично при разделении смесей, содержащих нуклеиновые кислоты и белки, ведут себя сорбенты, модифицированные ПАНИ. Однако использование содержащих ПАНИ сорбентов благодаря рН-чувствительности покрытия ПАНИ, дает ощутимое преимущество при разделении смесей белков, поскольку не требует введения органического компонента в состав подвижной фазы. Типичный пример разделения модельной смеси белков в градиенте рН подвижной фазы представлен на рис. 10. Видно, что белки десорбиру-ются из колонки в порядке увеличения значений р1 индивидуальных компонентов. Механизм удерживания и десорбции белков на покрытиях ПАНИ представляется сложным и, по-видимому, определяется как ионными взаимодействиями заряженных групп сорбата с сорбционными цетрами ионного типа на поверхности сорбента, так и способностью покрытия ПАНИ обратимо связывать
-40
-20
10 20 Время, мин
Рис. 9. Разделение компонентов белковой смеси, содержащей в-эндорфин (1), лизоцим (2), ци-тохром С (3) и яичный альбумин (4), на колонке, упакованной носителем TrisoporТМ-500, модифицированным ПТФЭ (250 х 4.6 мм). Скорость элюирования 1.0 мл/мин. Буферный раствор A -0.1%-ная трифторуксусная кислота, буферный раствор Б - 90% ацетонитрила в буферном растворе A. Градиент 10-50% буферного раствора Б в течение 30 мин (показан пунктиром).
белковые молекулы за счет образования водородных связей [23].
Вместе с тем традиционное колоночное хро-матографическое разделение является относительно медленным процессом и требует применения высоких давлений. Поэтому более эффективная и современная методика разделения компонентов биологических смесей использует компактные спин-картриджи (колоноки), что позволяет проводить биосепарацию в автоматическом режиме в течение нескольких минут. Исключительно высокая сорбционная емкость и селективность сорбентов, содержащих ПТФЭ и ПАНИ, позволяет использовать картриджи, упакованные всего 40-60 мг сорбента, и разделять нуклеиновые кислоты и белки, не изменяя состав элюента, в одну стадию (рис. 11). Следующие примеры иллюстрируют эффективность применения таких картриджей для выделения ДНК из различных природных источников (бактериальные лизаты, лизаты растительной ткани, лизаты крови человека и животных). Лизаты, как правило, представляют собой сложные смеси, содержа-
2
1
A 1.0
280
0.5
pH
8
—\l
Лизат (ДНК, РНК, белки, пептиды и т.д.) или модельная смесь
10 20 Время, мин
Рис. 10. Разделение смеси белков на колонке (150 х 5 мм), упакованной МПС, модифицированным ПАНИ, в градиенте рН 7.0-1.0 (показано пунктиром). Скорость элюирования 0.25 мл/мин. Раствор А - деионизованная вода, раствор Б - 0.015 М водная соляная кислота. Градиент 0-55% раствора Б в течение 30 мин. 1 - лизоцим (pI 11, Rt = 10.9), 2 - миоглобин pI 7, Rt = 12.5), 3 - цитохром C (pI 5.6, Rt = 14.3).
щие ДНК, фрагменты РНК, белки, пептиды, полисахариды, ПАВ, соли и т.п. Тестировали содержащие ПТФЭ и ПАНИ сорбенты, полученные на основе макропористого стекла Trisopor™-500. На картриджи наносили по 100-200 мкл смеси, содержащей ДНК, картриджи инкубировали 3 мин при комнатной температуре и центрифугировали 1 мин при скорости 2000 об/мин на настольной центрифуге типа "Eppendorf". Затем анализировали отобранные элюаты (80-100 мкл).
На рис. 12 представлена электрофореграмма образцов ДНК в 1%-ном агарозном геле, выделенных с использованием сорбента ПТФЭ из ли-затов грамположительных и грамотрицательных культур (соответствующие дорожки на электро-фореграмме отмечены прописными буквами). Для сравнения на гель наносили содержащие ДНК элюаты, выделенные из тех же бактериальных культур с использованием коммерческих картриджей фирмы "Qiagen" (дорожки отмечены строчными буквами). Видно, что элюаты, полученные при использовании фторполимерного сорбента, представляют собой очищенную от белка ДНК с высоким выходом (до 90%). Элюа-
Центрифугирование, 2000 об/мин, 1мин
Рис. 11. Схема одностадийного выделения нуклеиновых кислот из лизатов с использованием картриджей, упакованных композиционными полимерсодержащими сорбентами.
Рис. 12. Электрофореграмма образцов ДНК в 1%-ном агарозном геле, выделенных с использованием ПТФЭ-сорбента из лизатов бактериальных клеток A/a - Escherichia coli; Б/б - Bacillus subtilis; В/в - Listeria monocytogenes; Г/г - Staphylococcus aureus. Прописные буквы - очистка с использованием содержащего ПТФЭ сорбента. Строчные буквы - очистка с использованием коммерческих картриджей, упакованных не содержащим фторполимер сорбентом.
1
4
3
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4
Рис. 13. Сравнение эффективности ПЦР при использовании образцов ДНК из лизатов клеток Е. соН, выделенных с помощью картриджей, упакованных модифицированным ПФБД сорбентом на основе макропористого стекла Тшо-рог™-500 (дорожки 3, 4) и ПТФЭ - модифицированным сорбентом на основе того же носителя (дорожки 5, 6); 1 - ДНК-маркер, 2 -отрицательный контроль.
Рис. 14. Электрофореграмма образцов ДНК в 1%-ном агарозном геле, выделенных различными методами: 1 - исходный лизат, 2 - с использованием модифицированного ПАНИ сорбента; 3 - с использованием коммерческого набора фирмы "Qiagen", 4 - после проведения фенол-хлороформной экстракции.
ты, собранные при использовании картриджей фирмы '^а§еп", также содержат ДНК, однако ее выход ниже, и в некоторых случаях на электро-фореграмме заметны примеси РНК. Следует отметить, что процесс выделения ДНК с использованием картриджей, упакованных сорбентами ПТФЭ и ПАНИ, занимает 3-5 мин (с момента приготовления лизата), в то время как многостадийный процесс выделения ДНК на картриджах фирмы '^а§еп" требует в среднем около 30 мин. Высокая степень очистки ДНК от белков подтверждается, в частности, возможностью непосредственного использования выделенной ДНК при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР), так как известно, что фермент Taq-поли-мераза, обеспечивающий амплификацию ДНК, легко ингибируется даже в присутствии незначительного количества примесей, в больших концентрациях образовавшихся в исходном лизате. На рис. 13 видны ампликоны, полученные в результате проведения ПЦР-анализа с использованием бактериальной ДНК, выделенной на картриджах, содержащих сорбент ПТФЭ (дорожки 5, 6), а также картриджей, упакованных макропористым стеклом, модифицированным отвержден-ным полифторбутадиеном (ПФБД) в результате
обработки олигобутадиена парами дифторида ксенона по методике [24] (дорожки 3, 4). Аналогичные результаты были получены при использовании содержащих ПАНИ сорбентов на основе того же неорганического носителя. Результаты электрофореза в 1%-ном агарозном геле образцов выделенной из лизата E. coli ДНК представлены на рис. 14. ДНК, выделенная при использовании сорбента, покрытого ПАНИ (дорожка 2), присутствует в элюате в количестве, незначительно отличающемся от содержания ДНК в исходном лизате (дорожка 1) и в элюате после фенол-хлороформной экстракции (дорожка 4). Однако выход ДНК после многостадийной процедуры выделения с помощью картриджа фирмы "Qiagen" заметно ниже (дорожка 3). Как в случае использования фторполимерных сорбентов, применение модифицированных ПАНИ кремнеземов позволяет подготавливать препараты ДНК, пригодные для непосредственного проведения ПЦР-анализа. Результаты ПЦР бактериальной ДНК, выделенной при использовании картриджей, упакованных содержащим ПАНИ сорбентом и сорбентом, модифицированным ПФБД, хорошо видны на рис. 15 (дорожки 2-3 и 4-5 соответственно).
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 15. Сравнение эффективности ПЦР при использовании образцов ДНК из лизатов клеток Е. соН, выделенных с помощью картриджей, упакованных модифицированным ПАНИ сорбентом на основе макропористого стекла Triso-рог™-500 (дорожки 2, 3) и модифицированным ПТФЭ сорбентом на основе того же носителя (дорожки 4, 5), 1 - ДНК-маркер.
Использование сорбентов, поверхность которых покрыта тонким слоем ПАНИ, дает также возможность реализовать преимущества наличия атома азота и системы полисопряжения в макромолекуле, что, в частности, определяет его высокую химическую стойкость и уникальные сорб-ционные свойства пленок ПАНИ. Оказалось, что покрытия ПАНИ эффективно связывают металлсодержащие соединения, такие как гем и хлорофиллы (которые являются мощными ингибиторами ПЦР). Поэтому при использовании содержащих ПАНИ сорбентов для одностадийного выделения чистой концентрированной ДНК не требуется предварительного удаления гемоглобина или его фрагментов (при использовании лизатов крови), а также хлорофиллов (при получении ДНК из лизатов растительных тканей). На рис. 16 представлены результаты электрофореза в 1%-ном агарозном геле образцов ДНК после пропускания образцов цельной крови и листьев табака №сойапа ТаЬасит L., предварительно обработанных концентрированными лизирующими
Рис. 16. Результаты электрофореза в 1%-ном агарозном геле образцов ДНК, полученных при пропускании лизатов цельной крови коровы и листьев табака Nicotiana Tabacum L. через картриджи, упакованные содержащим ПАНИ сорбентом: 1, 2 - исходный лизат крови, 3, 4 - исходный лизат листьев, 5, 6 - элюаты, содержащие ДНК из крови, 7, 8 - элюаты, содержащие растительную ДНК.
растворами, через картриджи, содержащие по 140 мг сорбента. Элюаты дополнительно анализировали спектрофотометрически. При этом было показано, что очищенные препараты ДНК практически не содержат гема или хлорофиллов (по отсутствию поглощения при характеристических длинах волн) и непосредственно пригодны для проведения ПЦР-анализа.
Таким образом, композиционные сорбенты, модифицированные фторполимерами и ПАНИ, весьма эффективны при использовании в биосепарации, прежде всего для выделения нуклеиновых кислот из различных источников. Указанные функциональные свойства рассмотренных материалов делают их перспективными для использования в автоматизированных биосепарацион-ных системах в области как геномики, так и протеомики. Формирование на поверхности твердых носителей полимерных покрытий путем хемосорбции позволяет, в частности, получать эффективные биокатализаторы, сохраняющие функциональную активность и операционную стабильность в водных и органических средах, что имеет место, например, при модификации поверхности МПС поли-и-нитрофенил-акрилатом с последующей иммобилизацией липазы из Pseudomonas fluorescens [3].
Ак, нм 4.0
Ак, нм 4.5
250
450
650
850 1050 Время, с
250
650
1050
1450 1850 Время, с
Рис. 17. Динамика сорбции различных биополимеров на поверхности стеклянных слайдов, модифицированных наноразмерными слоями ПАНИ: 1 - цитохром С, 2 - казеин, 3 - миогло-бин, 4 - ^в, 5 - поли-Х-лизин, 6 - ДНК из тимуса теленка, 7 - калиевая соль полиуридиновой кислоты. Использовали 0.01%-ные растворы биополимеров в 0.1 М фосфатно-солевом буфере (рН 7.2). Скорость подачи раствора 2 мкл/мин.
Выше были рассмотрены примеры применения пористых неорганических матриц, модифицированных наноразмерными слоями полимеров в качестве сорбентов для биосепарации и в качестве носителей для иммобилизации биокатализаторов (ферментов). Весьма распространенными биоматериалами являются и плоские матрицы, применяющиеся в качестве типичных "рабочих тел" биосенсоров, биочипов и ряда других биоаналитических и диагностических устройств. Характеристики подобных систем обычно получают с помощью физических и химических методов изучения поверхности, таких как плазмонный резонанс [25], пьезоэлектрический эффект [26], SELDI-TOF масс-спектрометрия [27] и других.
Весьма перспективным для исследования процессов сорбции и молекулярного узнавания на плоских матрицах в режиме реального времени оказался недавно разработанный спектральный корреляционный метод, основанный на сопоставлении сигналов от двух интерферометров, встроенных в оригинальную оптическую схему [28]. В качестве "рабочего тела" в данном методе используется плоская стеклянная пластинка толщиной ~0.1 мм. Сорбция каких-либо молекул на внешней поверхности пластины сопровождается изменением интерференционной картины и дает информацию об изменении толщины поверхностного адсорбционного слоя в режиме реального времени. Этот метод был использован для исследования сорбции белков на ПАНИ, для чего по-
Рис. 18. Динамика сорбции цитохрома С на поверхности стеклянных слайдов, модифицированных ПАНИ, при различных значениях рН подвижной фазы. Использовали 0.01%-ные растворы белка в фосфатно-солевом буфере при рН 8.0 (1), 7.2 (2) и 5.8 (3). Скорость подачи раствора 2 мкл/мин.
верхность стеклянной пластинки была модифицирована нанесением наноразмерного слоя этого полимера. На рис. 17 приведены результаты измерения сорбции ряда биополимеров на такой пластинке. Видно, что процесс сорбции протекает достаточно быстро и практически завершается через ~12 мин. Эффективная толщина АН адсорбционных слоев белков может достигать 4 нм. В полном соответствии с рассмотренными выше данными, полученными хроматографическими методами с использованием пористых сорбентов, модифицированных ПАНИ, ДНК и высокомолекулярный синтетический полинуклеотид (калийная соль полиуридиловой кислоты) практически не сорбируются, в то время как белки связываются с поверхностью ПАНИ. Величина сорбции зависит от природы белка, хотя прямой связи с ММ белка проследить не удалось. Для одного и того же белка (цитохром-С) показана зависимость сорбции от рН среды (рис. 18) и обратимость сорбции при различных рН (рис. 19). Таким образом, данные, полученные с помощью спектрального корреляционного метода с использованием плоских матриц, модифицированных нанослоями полимеров, с одной стороны, позволяют объяснять и предсказывать свойства сорбентов для жидкостной хроматографии биополимеров; с другой стороны, их можно рассматривать в качестве научной основы для создания биосенсоров и других биоаналитических устройств.
АН, нм
45к рН 7.2
рН 2.0
рН 7.2
рН 2.0
1050
2050
3050 Время, с
Рис. 19. Динамика рН-зависимой обратимой сорбции цитохрома С из 0.01%-ного раствора в 0.1 М фосфатно-солевом буфере (рН 7.2). Десорбцию проводили с использованием 0.01 М водной соляной кислоты.
ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ И ОБОЛОЧКИ НА НАНОЧАСТИЦАХ
Развитие методов нанотехнологии сделало возможным получение нового класса люминесцентных полупроводниковых нанокристаллов, или QDs, которые являются перспективной альтернативой органическим красителям в биологических исследованиях, основанных на измерении параметров флуоресценции [29]. Они весьма перспективны для введения меток разного цвета и одновременной идентификации различных биологических объектов [30]. Примером таких частиц являются нанокристаллы (CdSe)ZnS, представляющие собой неорганические частицы, содержащие центральное ядро из CdSe, определяющее параметры флуоресценции, и оболочку из ZnS, обеспечивающую высокий выход флуоресценции [31]. Широкий спектр диаметров нанокристаллов (2-8 нм) дает возможность получать флуоресценцию в диапазоне длины волн от зеленой (510 нм) до красной (680 нм). Нанокристаллы (CdSe)ZnS также характеризуются уникальными люминесцентными свойствами: высоким квантовым выходом, фотостабильностью, которые открывают новые возможности применения данных нанокристаллов в различных видах биоанализа (иммуноферментный анализ, микро-флуориметрия и другие). Однако отсутствие функциональных групп, недостаточная химическая и фотостабильность в воде ограничивают их применение в биоанализе [32]. Базируясь на результатах наших исследований по созданию нано-структурированных объектов, для решения этих проблем было предложено два пути: включение нанокристаллов в полимерные микрочастицы и
получение полимерной оболочки нанокристаллов.
Путь 1. Включение нанокристаллов необходимо осуществлять в полимерные микрочастицы, удовлетворяющие требованиям для их применения в биоанализе, таким как узкое распределение частиц по размерам, воспроизводимые коллоидно-химические свойства, высокая стабильность при хранении и агрегативная устойчивость в физиологических растворах, наличие на поверхности биологически активных веществ или функциональных групп, позволяющих кова-лентно связывать белковые молекулы [33]. Предварительные исследования показали, что наиболее перспективными являются частицы на основе сополимера акролеина со стиролом, содержащие на поверхности альдегидные группы, которые могут в одну стадию ковалентно взаимодействовать с первичными аминогруппами белковых молекул. При этом встраивание звеньев стирола позволяет снизить образование полуацетальных групп, образующихся при взаимодействии соседних альдегидных групп акролеина [34]. Сополи-мерные частицы получали методом безэмульга-торной радикальной сополимеризации акролеина и стирола с соотношениями мономеров 1 : 1, 5 : 1, 10 : 1 в присутствии персульфата калия [35]. Наибольшая скорость роста диаметра частиц и минимальный диаметр частиц дисперсии отмечены в случае максимального (10 : 1) содержания акролеина в исходной смеси (рис. 20). В этом же случае отмечена и более рыхлая структура частиц полимерной дисперсии, чем при соотношении мономеров 1 : 1 (рис. 21). Характеристики полученных частиц приведены в таблице. Как видно, все полимерные дисперсии характеризуются высокой коллоидной стабильностью, содержат альдегидные группы и могут быть использованы в качестве маркера в биоаналитических тестах.
Было найдено, что включение нанокристаллов в полимерные микрочастицы после синтеза является оптимальным способом инкапсулирования нанокристаллов [35]. Введение нанокристаллов в полимерные микрочастицы не влияло на их коллоидно-химические свойства, а дисперсии, полученные при соотношении мономеров 1 : 1 и 1 : 10, имели высокую интенсивность флуоресценции, которая сохранялась в течение трех месяцев (рис. 22). При соотношении мономеров 1 : 5 дис-
Диаметр, нм 500
300
100
100 200 300
Время, мин
Рис. 20. Зависимость диаметра частиц от продолжительности сополимеризации акролеина и стирола при соотношении мономеров акролеин : стирол 1 : 1 (1), 5 : 1 (2) и 10 : 1 (3).
персии характеризовались относительно невысокой интенсивностью флуоресценции, и в дальнейшем исследование их свойств не проводилось.
Разработанная методика позволяет вводить в микросферы известное количество нанокристал-лов разных цветов с заданным соотношением ин-тенсивностей флуоресценции каждого цвета. Такие спектрально кодированные объекты полезны при разработке многомерных методов анализа большого количества соединений, например, при анализе генов или в медицинской диагностике.
Полученные полимерные микрочастицы с на-нокристаллами, содержащие альдегидные группы, которые могут вступать в реакции с белками, представляют большой интерес при их использовании в качестве флуоресцентных носителей в различных видах биоаналитических тестов. Принцип работы таких тестов основан на специфическом, высокоаффинном взаимодействии между детектируемым лигандом и реагентом, содержащим антилиганд, к которому могут быть отнесены реакции антиген-антитело и многие другие [36]. Эти взаимодействия положены в основу иммунохимических методов [37], гибридиза-ционного анализа нуклеиновых кислот [38], маркирования компонентов клеточных мембран [39] и т.п. Существуют различные методы проведения анализов с участием полимерных микрочастиц,
• • • V
1 мкм (а) (б) , 1 мкм |
Рис. 21. Микрофотографии частиц, полученных сополимеризацией акролеина и стирола при соотношении акролеин : стирол 1 : 1 (а) и 10 : 1 (б).
такие как реакция латексной агглютинации в планшете, на стекле, на фильтре, в объеме, стрип-тесты, микрочипы и другие [40]. Инструментальное детектирование результатов таких методов дает возможность избежать влияния субъективного фактора на регистрацию окончания биоспецифической реакции и повысить чувствительность метода. Полимерные микрочастицы выступают в качестве носителей лигандов и служат для усиления сигнала и, следовательно, позволяют снизить величину минимальной определяемой концентрации антилиганда в анализируемом образце [41]. В частности, нами были получены конъюгаты сополимерных микросфер с включенными нанокристаллами и моноклональ-ными антителами к антигену возбудителя чумы, которые тестировали в реакции латексной агглютинации в планшете как наиболее простом и хорошо отработанном методе регистрации результата взаимодействия антител и антигена [42]. Результаты анализа при наблюдении в УФ-свете представлены на рис. 23. Найдено, что при ис-
Характеристики дисперсий микрочастиц на основе сополимера акролеина со стиролом
Мольное соотношение акролеин : стирол Диаметр, нм Содержание стирола в сополимере, % Концентрация альдегидных групп, мкмоль/г
1 : 1 420 48 19.8
5 : 1 250 14.3 25.5
10 : 1 145 8.1 32.1
, том 49 № 12 2007
/фл, отн. ед. 1.0
1
0.7
0.4
0.1
2
Рис. 22. Интенсивность флуоресценции частиц, полученных при сополимеризации акролеина и стирола при соотношении мономеров 1 : 1 (а), 5 : 1 (б) и 10 : 1 (в) сразу после введения нанокри-сталлов (1) и через 3 месяца (2).
пользовании сополимерных частиц с нанокри-сталлами, полученных при соотношении мономеров 1 : 1 и концентрации добавленных антител 4.8 мг/мл, минимально детектируемая концентрация составляет 15 нг/мл, что хорошо коррелирует с результатами иммуноферментного анализа (1 нг/мл) при более простой процедуре проведения реакции латексной агглютинации.
Путь 2. Для формирования полимерной оболочки на наночастицах могут быть использованы два подхода. В первом случае получают двуслойную композицию на поверхности наночастицы, где первый слой образован молекулами низкомолекулярного соединения, связанного с поверхностью дисульфидной связью, а второй представляет собой длинноцепные полимерные молекулы, на которые в дальнейшем могут быть иммобилизованы лиганды для молекулярного узнавания
[43]. Наши исследования показали, что наиболее перспективными для создания первого слоя являются соединения с тиольными группами. В частности, использование цистеина и смеси меркапто-уксусной кислоты с меркаптоэтанолом уже позволяет получить достаточно устойчивые дисперсии нанокристаллов (QDs) в воде [44]. Однако потеря коллоидной устойчивости во времени ставит задачу получения второго стабилизирующего слоя. Для этих целей были выбраны полимеры, такие как хитозан, поли-Х-лизин, полиаллиламин, содержащие функциональные группы (аминогруппы), которые после активации карбодиимидом образуют прочную связь с карбоксильными группами меркаптосоединений первого слоя. Полученные двуслойные наночастицы характеризуются высокой коллоидной стабильностью и фотостабильностью в водных растворах в диапазоне рН 6.0-11.0 и интенсивностью флуоресценции 85-95%, сохраняя свои свойства, как минимум, в течение трех месяцев.
Во втором случае оболочка формируется за счет гидрофобного взаимодействия триоктил-фосфиноксида, который стабилизирует нанокри-сталлы в процессе их получения, с амфифильны-ми полимерами [45]. Использование таких соединений, как сополимеры меркаптоундецила с тетраэтиленгликолем и малеинового ангидрида с октадеценом (с последующим добавлением сшивающего агента, такого как гексаметиленди-амин), позволяет создать прочную гидрофильную оболочку вокруг нанокристаллов [44]. Водные дисперсии полученных полимерсодержащих на-нокристалов коллоидно-устойчивы и обладают достаточно высокой интенсивностью флуоресценции (80-90%).
1
2
1
С, мг/мл
0.12 0.06 0.03 0.015 0.0075
Титр 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560
1
2
Рис. 23. Изображение в УФ-свете реакции латексной агглютинации частиц сополимера акролеина со стиролом (1 : 1) с включенными нанокристаллами, сенсибилизированных моноклональными антителами к антигену возбудителя чумы (0.8 мг/г полимера): 1 - при добавлении антигена (начальная концентрация антигена с = 1 мг/мл), 2 - при добавлении нормальной кроличьей сыворотки в качестве отрицательного контроля (начальный титр сыворотки 1 : 20).
Формирование полимерной оболочки на нано-частицах даст возможность использовать их для визуализации образования комплекса лиганд-ан-тилиганд, а малый размер таких наночастиц (5-10 нм) даст возможность применять их в анализах как in vitro, так и in vivo для маркирования клеток, кодирования ДНК, направленной доставки наночастиц в клетки и т.п. [46]. В частности, они были использованы для разработки нового диагности-кума на раковые заболевания с применением конъюгатов полимермодифицированных наночастиц с белком барстаром [47].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ivanov A.E., Saburov V.V., Zubov VP. // Adv. Polym. Sci. 1992. V. 104. P. 287.
2. Иванов A.E., Белов СВ., Зубов В.П. // Высокомо-лек. соед. А. 1994. Т. 36. № 2. С. 334.
3. Капустин Д.В., Вихров A.A., Горохова ИВ, Генералова A.H, Калягина О.В., Мурзабекова Т.Г., Зубов В.П. // Изв. РАН. 2005. Т. 54. № 2. С. 443.
4. Saburov V.V., Muydinov M.R., Zubov V.P., Kapus-tin D.V. // Proc. Third Int. Symp. on Bioorganic Chemistry. Dagomys, Russia, 1995. P. 107.
5. Муйдинов М.Р. Дис. ... д-ра хим. наук. М.: Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 2006.
6. Давранов A.A., Кирюхин Д.П., Муйдинов М.Р, Баркалов И.М. // Химия высоких энергий. 1989. Т. 23. № 4. С. 323.
7. Володина В.И., Тарасов AM, Спасский С.С. // Успехи химии. 1970. Т. 39. № 2. С. 276.
8. Libert J, Bredas JL. // Synth. Met. 1995. V. 69. № 1-3. P. 121.
9. Monkman A.P, Reynolds JR., Tanner D.V., Ruiz J.P, Wang J, Pomeranz M. // J. Polym. Sci., Polym. Phys.
1994. V. 32. № 6. P. 2395.
10. Anderson M.R., Matters B.R, Reis H, Kaner R.B. // Science. 1991. V. 252. № 5011. P. 1412.
11. Lu W.-K, Elsenbaumer R.L, Wessling B. // Synth. Met.
1995. V. 71. № 1-3. P. 2163.
12. Karyakin A.A., MaltsevI.A., LukachovaL.V. // J. Electri-nal. Chem. 1996. V. 402. № 1-2. P. 217.
13. Капустин Д.В., Ягудаева Е.Ю., Завада Л.Л., Жи-гис Л.С., Зубов В.П, Ярошевская Е.М, Плоб-нер Л., Лайзер Р.-М, Брем Г. // Биоорган. химия. 2003. Т. 29. № 3. С. 310.
14. Ponzio E.A., Echevarria R, Morales M.G., Barbero C. // Polymer. Int. 2001. V. 50. P. 1183.
15. WuS, ZengF, Shen J. // Polym. Int. 1998. V. 47. P. 335.
16. Zhu C, Wang C, Yang L, Bai C, Wang F. // Appl. Phys. A. 1999. V. 68. P. 435.
17. Nicolau YF, Ermolieff A. // Synth. Met. 1995. V. 71. P. 2073.
18. Орлов A.B., Киселева СТ., Юрченко О.Ю., Карпа-чева Т.П. // Высокомолек. соед. A. 2000. Т. 42. № 12. С. 2089.
19. DuicL, MandicZ, KovacK. // Electrochim. Acta. 1995. V. 40. P. 1684.
20. Ягудаева Е Ю. Дис. ... канд. хим. наук. М.: Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 2003.
21. Сабуров B.B. Дис. ... канд. хим. наук. М.: Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 1989.
22. Pittman A G. // Fluoropolymers / Ed. by Wall L.A. New York; London; Sydney; Toronto: Wiley-Inetrscience, 1972. P. 446.
23. Ponzio EA, EchevarriaR, Morales G.M., Barbero C. // Polym. Int. 2001. V. 50. P. 1180.
24. Капустин Д.В., Сабуров B.B., Завада Л.Л., Ев-стратов A.B., Барсамян Т.Б., Зубов B.n. // Биоорган. химия. 1997. Т. 42. № 11. С. 868.
25. Liedberg B, Nylander C, Lundstrom I. // Biosens. Bio-electron. 1995. № 10. P. 1.
26. Yang Y.H, Buckley MJ, Dudoit S, Speed T. // J. Com-put. Graphical Stat. 2002. V. 11. P. 108.
27. Issaq H J., Veenstra T D, Conrads T P, Felschaw D. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 292. № 3. P. 587.
28. Nikitin P I, Gorshkov B.G., Nikitin E.P. // Sens. Actuators. B. 2005. № 111-112. P. 500.
29. Gerion D, Pinaud F., Williams S C., Parak WJ, Za-chet D, Weiss S, Alivisators A.P. // J. Phys. Chem. 2001. V. 105. № 37. P. 8861.
30. Bruchez M, Moronne M, Gin P., Weiss S, Alivisatos A.P. // Anal. Chim. Acta. 1996. V. 332. № 2-3. P. 269.
31. Alivisatos A.P. // J. Phys. Chem. 1996. V. 100. № 132. P. 13226.
32. Murray C.B., Norris D J, Bawendi M.C. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. № 19. P. 8706.
33. Bang L.B. Uniform Latex Particles. Indianapolis: Sera-din Inc., 1984.
34. Slomkowski S. // Progr. Polym. Sci. 1998. V. 23. P. 815.
35. Generalova A.N., Sizova S.V., Zubov VP. // Abstrs 1 NACBO Int. Nanobiotechnology Conference. Urbino, Italy, 2006. P. 35.
36. Microspheres: Medical and Biological Applications / Ed. by Rembaum A., Tokes Z. Boca Raton: CRC Press, 1988.
37. Иммунология / Под ред. Пола У. М.: Мир, 1987. Т. 1.
38. Шабарова З.А., Богданов A.A. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М.: Просвещение, 1987.
39. Abell L.L, Levy B .B , Brodie B S. // J. Biol. Chem. 1952. V. 195. № 1. P. 357.
40. Bangs L.B. Latex Course. Indianapolis: Bangs Laboratories Inc., 1996. № 4.
41. Medcalf E.A., Newman D.J., Gilboa A., Gorman E.G., Price CP. // J. Immunol. Methods. 1990. V. 129. № 1. P. 89.
42. Lukin Yu.V., Pavlova I S, Generalova A.N., Zubov V.P., Zhorov O.V., Martsev S.P. // J. Molecular Recognition. 1998. V. 11. № 1-6. P. 185.
43. Bruchez M, Alivisatos A.P. // Science. 1998. V. 281. № 5385. P. 2013.
44. Sizova S.V., Generalova AN, Zubov VP. // Abstrs 1 NACBO Int. Nanobiotechnology Conference. Urbino, Italy, 2006. P. 67.
45. HongR, Fischer N.O, Emrick T, Rotello V.M. // Chem. Mater. 2005. V. 17. № 18. P. 4617.
46. Alivisatos A.P. // Nature Biotechnol. 2004. V. 22. № 1. P. 47.
47. Deyev S.M, Waibel R, Lebedenko EN, Schbiger A., Pluckthum A. // Nature Biotechnol. 2003. V. 21. № 12. P. 1486.
Modification of Solids with Polymer Nanolayers as a Process for Manufacture of Novel Biomaterials
V. P. Zubova, D. V. Kapustina, A. N. Generalova3, E. Yu. Yagudaevaa, A. A. Vikhrova, S. V. Sizovaa, and M. R. Muidinovb
a Shemyakin Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997 Russia b Institute of Problems of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, pr. Akademika Semenova 1, Chernogolovka, Moscow oblast, 142432 Russia e-mail: [email protected]
Abstract—The results of study on the chemical deposition of polymeric coatings of a nanoscale thickness on porous and flat inorganic matrices and encapsulation of nano- and microparticles in polymer shells are discussed. Procedures for the deposition of homogeneous defect-free coatings are detailed using polytetrafluoro-ethylene, polyaniline, and their derivatives as an example. The matrices modified with nanosized polytetraflu-oroethylene and polyaniline layers are promising biomaterials for one-step isolation of nucleic acids from complex biological mixtures (cell and tissue lysates, whole blood, plant feedstock), as well as for high-performance chromatography of proteins and other biopolymers. Approaches to the fabrication of polymer shells on luminescent nanocrystals of (CdSe)ZnS via the inclusion of the nanocrystals in micrometer-sized particles based on acrolein-styrene copolymers and the formation of polymer shells directly on nanoparticles are discussed. It was shown that polymer-functionalized luminescent nanocrystals hold promise as bioanalytical reagents.
