CC BY
23
МОДИФИКАЦИЯ НАНОРАЗМЕРНОГО МАТЕРИАЛА «ЛИТАР» ЭЛЕКТРОЧАСТОТНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ
© Гапонов Ю.Н.*, Литвинов С.Д.Ф, Судакова Т.В.*
Национальный исследовательский Самарский государственный аэрокосмический университет им. академика С.П. Королёва, г. Самара
Самарский государственный технический университет, г. Самара
Синтезированы гидроксил- и фторгадроксилапатиг-коллагеновый композитные материалы. По данным рентгено-фазового анализа материалы характеризуются наноразмерными кристаллами соли (менее 100 нм), равномерно распределенными между волокнами коллагена. В работе приводятся результаты электрочастотного воздействовия формирования кристаллов соли. Показана возможность воздействия фторид-иона (в структуре апатита) на остеокласты, что способствует регенерации костной ткани, более эффективной, чем в случае гидроксилапатита.
Костная ткань, несмотря на ее высокую прочность и защищенность мягкими тканями, подвержена различного рода патологиям и механическим воздействиям, приводящим к потере ею формы и функции. Для восстановления последней можно использовать ауто-, аллокость или синтетические биокерамические или композитные биодеградируемые материалы. Создание имплантационных материалов предполагает наличие у них определенных характеристик, которые в нативной кости обеспечиваются специфическим расположением кристаллов гидроксилпатита между волокнами коллагена. По мнению Ю.Д. Третьякова [1] «... химическое и морфологическое соответствие биоматериала и костного минерала является одним из основных принципов, лежащих в основе конструирования новых материалов биомедицинского назначения». Однако, это правильно отчасти: рост костной ткани, в соответствии с одной из гипотез [2], начинается с формирования кристаллов фосфата кальция СаНРО4^2Н2О, которые при рН > 6,2 гидролизуются с последующим превращением в кристаллы октакальцийфосфата Са8Н2(РО4)6^5Н2О, а последние - в более мелкие кристаллы гидроксофос-фата кальция Са5(РО4)3(ОН) (гидроксилапатит) [3]. Кроме того, в организме биоматериал не превращается непосредственно в костную ткань, а постепенно лизируется клетками организма. Освобождающееся пространство заполняется сначала соединительной тканью, которая затем трансформируется в костную.
* Доцент кафедры ТМиАМ СГАУ (НИУ) им. академика С.П. Королёва, кандидат технических наук, доцент.
* Профессор кафедра ТМиАМ СГ АУ (НИУ) им. академика С.П. Королёва, доктор фармацевтических наук, профессор.
* Доцент кафедры Общей и неорганической химии, кандидат химических наук.
Регенерация костной ткани, инициируемая имплантатом, представляет собой двуединый процесс строительства и разрушения костного вещества специфическими клетками: остеобластами и остеокластами [4, 5]. Главное условие эффективности восстановления костной ткани - быстрая биотрансформация (биодеградация) материала.
В настоящее время для имплантационных материалов небиокерамического характера, как правило, обязательна комбинация ионов Са2+, РО43-, О^ (они входят в состав минерала кости) и органической полимерной основы (белок коллаген или полисахариды - альгинат, гиалуронат). Ускорение регенераторного процесса в первые дни после операции можно обеспечить подавлением активности остеокластов - клеток, разрушающих костную ткань. Это может быть достигнуто введением в имплантат фторид-ионов [6], т.е. использованием в качестве минерального компонента фторгидроксилапатита. Содержание фторид-иона в материале не должно превышать количеств, рекомендованных нормами ВОЗ (WHO) [7]. ^обходимо отметить, что согласно данным [3] растворимость фторапатита меньше, чем у гидроксилапатита.
Разработанный ранее автором [8] материал на основе гидроксилапатита и зарегистрированный под названием «ЛитАр», имеет преимущество по сравнению с другими широко используемыми для восстановления костной ткани биоматериалами, особенно керамическими. В настоящей работе представлены результаты разработки технологии получения апатит - коллагенового имплантационного материала, содержащего фторид-ион. Авторы полагают, что замена части гидроксильных групп на фторид-ион улучшит свойства имплантационного материала.
Материалы и методы
Для синтеза использовали растворы следующих веществ: дигидрофосфата натрия NaH2PO4^2H2O, хлорида кальция CaCl2, фторида аммония NH4F, гидроксида аммония NH4OH (25 %), Са(ОЩ2. Все реактивы квалификации «хч».
Синтез фторгидроксилапатита на волокнах коллагена проводили направленной диффузией. Отличительной чертой выбранного способа синтеза является то, что исходные растворы в начальный момент синтеза не смешиваются друг с другом, а разделены коллагеновой губкой. Ранее [9] было установлено, что при синтезе направленной диффузией апатит образуется, если соотношение Са2+: РО43- в исходных растворах равно 1,67, как в стехиометрическом гидроксилапатите Са10(РО4)6(ОH)2). Поэтому в данной работе поддерживали такое соотношение в исходных растворах. Концентрацию иона фтора варьировали следующим образом: 0,01, 0,02, 0,037, 0,04,
0,06, 0,08, 0,1 моль/л. В раствор хлорида кальция для создания рH = 12 добавляли небольшое количество Са(ОЩ2. В раствор дигидрофосфата натрия для подавления гидролиза добавляли 25 %-ый раствор аммиака до рH = 9. Синтез проводили при комнатной температуре в течение 10-16 часов. Син-
тезированные образцы промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод и сушили на воздухе при комнатной температуре.
Для проведения количественного химического анализа навески исследуемых веществ, взвешенные на аналитических весах, растворяли в хлороводородной кислоте разведения 1:2. Содержание ионов кальция определяли комплексонометрическим титрованием с эриохромом черным [10]. Содержание фосфат-аниона определяли на фотоколориметре КФК-2, измеряя оптическую плотность желтого фосфоромолибдатованадиевого комплекса [11]. Содержание иона фтора определяли фторид-селективным электродом типа «ЭЛИТ-221», используя анализатор жидкости «Эксперт-001».
Рентгеновский фазовый анализ (РФА) осуществляли на установке ДРОН-2 и ДРОН-7: использовали фильтрованное излучение Co-Каи Cu-Ka.
Инфракрасные спектры (ИКС) твердых образцов записывали на спектрометре «SPECORD-M80» в диапазоне частот от 4000 до 400 см-1: прессовали исследуемое вещество в таблетке бромида калия, так как в этом случае получаются оптически прозрачные таблетки с малым рассеянием света.
Плотность распределения солевого компонента в материале определяли на компьютерном томографе Tomoscan CX/S фирмы Phillips. Исследование микроструктуры синтезированного материала проводили на электронном микроскопе Jem - 2000 FX - II и микроскопе «Biolar» 03-839.
Синтезированный материал исследовали в ацетатном буферном растворе рН = 5 при температуре 37 оС, моделирующем воспалительную среду в операционной ране после замещения дефекта материалом (in vitro). Исследуемые образцы термостатировали в течение 11 суток в суховоздушном термостате тип SU32 (Польша). Через 0,5, 2, 5, 10 часов и далее через каждые сутки отбирали пробы жидкой фазы, в которых анализировали содержание ионов Са2+, РО43-, F- по указанным выше методикам.
Для оценки безопасности применения синтезированного материала (исключение некроза и присоединения вторичной инфекции) исследовали растворимость его минерального компонента in vivo - в мягких тканях лабораторных животных (крысы). Для этого под эфирным наркозом рассекали мягкие ткани животного и помещали в разрез образцы стерильного материала, далее края операционной раны ушивали наглухо. Через определенные промежутки времени проводили повторные операции для извлечения из биологической ткани образовавшихся продуктов. Далее образцы высушивали, взвешивали и определяли в них содержание фтора, кальция и фосфата по выше указанным методикам.
После проведения успешных биологических испытаний на лабораторных животных (собаках), описанных в работах [12-14] композиционный материал на основе фторгидроксилапатита ограниченно (по согласованию с пациентами) был применен в клинике для замещения дефектов челюстей.
Результаты и их обсуждение
РФА показал, что независимо от содержания иона фтора в реакционной среде основная фаза во все синтезированных образцах представлена апатитом. В целом наблюдалась плохая окристаллизованность апатита. Образцы с меньшим содержанием фторид-иона были окристаллизованы хуже, чем образцы с большим содержанием. С увеличением содержания фторид-иона в реакционной смеси (начиная с 0,037 моль/л) наряду с апатитом образовывался флюорит. Это хорошо согласуется с результатами исследования влияния концентрации иона F- в реакционной смеси на образование конечного продукта [15]. Согласно этим данным оптимальное содержание F-, при котором еще не образуется фторид кальция в качестве побочного продукта, составляет 0,1^0,2 моль/л.
Химический анализ показал, что молярное отношение ионов кальция к ионам фосфата, равное 1,67 и соответствующее стехиометрическому составу апатита, выполняется только для образца, синтезированного при минимальной концентрации фторид-иона в реакционной смеси (0,01 моль/л). Содержание фторида в этом апатите: 0,09 атомных молей на элементарную ячейку. В образце, синтезированном при концентрации F- 0,02 моль/л, соотношение Са/Р = 1,9, что может быть обусловлено присутствием рентгеноаморфного фторида кальция, а также замещением [PO4]3- ^ [ТО^2-. Присутствие карбонат ионов в структуре синтезированных апатитов подтверждено данными ИК-спектроскопии (полосы поглощения 880, 1465, 1542, 864, 1430, 1455 см-1). По-видимому, это результат взаимодействия продуктов синтеза с углекислым газом воздушной среды.
Приведенная выше схема синтеза не гарантирует регулярного распределения солевого компонента на волокнах полимера, как в костной ткани, но позволяет надеяться на относительно равномерное образование нанокристаллов соли во всем объеме синтезируемого материала. Во многом это определяется качеством самой полимерной основы, т.е. коллагена. По результатам компьютерной томографии график распределения оптической плотности в плоскости сканирования представляет собой горизонтальную линию с некоторыми флуктуациями, что свидетельствует об относительно равномерном распределении солевого компонента в материале. Установлено, что оптическая плотность материала находится в пределах от 20 до 80 НU (Хаунсфилд Юнион). Причем 90 % интервала плотности приходится на 20-60 НU.
Микроскопическое исследование синтезированного материала показало, что волокна коллагена покрыты со всех сторон частицами апатита. По данным электронной микроскопии находящиеся между волокнами биополимера сфероподобные частицы имеют средний размер порядка 8 мкм. При увеличении в 10000 раз обнаружено, что эти частицы представляют собой конгломераты более мелких зерен размером менее 1 мкм. Методом мягкой лазерной абляции установлено, что кристаллы в материале имеют две фрак-
ции 4 и 44 нм (последние соизмеримы с величиной кристаллов гидроксила-патита в нативной костной ткани (35-37 нм), имеющих нанометрические размеры [3]), что исключает отторжение синтезированного материала. Отторжение может возникнуть не только благодаря большим размерам частиц, но и как иммунная реакция на органический компонент имплантационного материала. Нами использовался коллаген без ателло-пептидных белков (они гид-ролизованы), то этот фактор также исключается. Коллаген вместе с альгинатом являются одним из немногих биополимеров, которые не дают иммунной реакции.
Исследование растворимости минеральной составляющей полученного материала in vitro показало достаточно быстрое увеличение содержания ионов Са2+, РО43-, F- в жидкой фазе в первый час термостатирования, что может быть обусловлено растворением в слабо кислой среде наиболее мелких нанок-ристаллических частиц фторгидроксилапатита. В первые 14 часов концентрация всех ионов в буферном растворе увеличивалась с близкой скоростью. Концентрация F- увеличивалась до относительно постоянного уровня примерно в течение 6 суток. Кривые изменения концентрации ионов кальция и фосфата в жидкой фазе имели сходный и достаточно сложный характер. Через 5-6 суток эксперимента происходило уменьшение концентрации этих ионов в жидкой фазе. Аналогичное явление наблюдали при растворении в соляной кислоте кости, где кристаллы гидроксилапатита нанометричны [3]. На ИК спектрах образцов, промытых дистиллированной водой после окончания эксперимента, обнаружены полосы поглощения 1120, 1170, 1250, 1255, 1295 см-1, характерные для ионов НРО42- и Н2РО4- [16], которые раньше отсутствовали.
Результаты исследования in vivo растворимости фторгидроксилапатитно-го материала в мягких тканях лабораторных животных (крыс) показали, что наиболее интенсивно изменялось содержание ионов фтора и фосфата, а наиболее медленно - ионов кальция. Таки образом, изучение растворимости образцов материалов in vivo и in vitro выявило пролонгированное выделение фторид-иона: его количество, выделяемое из материала в течение суток, не превышало допустимых норм [7], что исключало заболевание флуорозом.
Клинические испытания показали, что восстановление челюстей пациентов наблюдалось уже на 4 месяц после замещения дефектов (рис. 1). Обычно в таких случаях используется донорская кость или аутокость (собственная кость пациента) и восстановление происходит только через год, в некоторых случаях не происходит совсем.
Преимущества разработанного гидроксилфторапатит-коллагенового материала можно проиллюстрировать сравнением эффективности его клинического применения с керамическим материалом CERASORB, который представляет собой фосфат кальция Са3(РО4)2, сплавленный при температуре 900 оС [17]. Неоспоримым преимуществом биокерамических материалов являются высокие прочностные характеристики, тогда как скорость биоде-
градации их весьма мала. Ранее разработанные материалы «ЛитАр» [8] и CERASORB [17] применяли для восстановления костной ткани в дефекте фронтального отдела челюсти человека. Компьютерная томография дефекта показала, что до операции область дефекта была сильно затемнена (мягкотканый компонент кисты). Через 4 месяца после заполнения дефекта материалом CERASORB формирования новой кости не наблюдалось и даже через 15 месяцев большая часть материала осталась без изменения. В случае применения апатит-коллагенового материала «ЛитАр» уже через 5 месяцев была восстановлена наружная кортикальная пластинка и через 1 год полностью восстановился фронтальный отдел - обнаружить область дефекта было невозможно.
Рис. 1. Челюсть пациента Х.: до (А) и после (Б) применения фторированного гидроксилапатита
По данным работы [18] регенерация обеспечивается проникновением в клетку наноразмерных кристаллов гидроксил апатита (или фторгидрокси-лапатита). Это обстоятельство косвенно указывает на то, что и размеры кристаллов соли материала (композита) могут оказывать существенное влияние на восстановление в дефектном участке нативной ткани в зависимости от размеров кристаллов.
Для возможного изменения размеров кристаллов и характера кристаллизации в ходе процесса формирования «Литар» на диффузионное образование (роста) наноразмерных частиц соли производилось электрочастотное воздействие постоянным током разной частиты (50-2000 кГр) [19, 20].
В качестве базового метода исследования кристаллической структуры частиц, образующихся в материале (композите), выбран рентгеноструктурный анализ. Запись дифрактограмм осуществляли на рентгеновском дифрактометре ДРОН-7, в Си-Кя-излучении и диапазоне углов сканирования от 20 до 50 град. 20 (рис. 2). Дифракционный максимум, соответствующий плоскости отражения 002, записывали в угловом интервале 25-26,9 град. 20 для образцов гидроксилапатита, синтезированного методом осаждения (эталон), материала «ЛитАр», синтезированного без наложения электрического переменного поля материала «ЛитАр», синтезированного при наложении поля с частотами 50, 200 и 2000 кГц.
По полученным результатам произвели качественный анализ дифрактограмм в диапазоне углов 20-50 град. 20 и количественную оценку полуширины на половине высоты (ПШПВ) дифракционного максимума в интервале углов 25-26,9 град. 20 (рис. 3).
Рис. 2. Дифрактограммы порошков: а - гидроксилапатит (эталон), б - материал «ЛитАр» без воздействия поля, в - материал «ЛитАр» с наложением поля 50 кГц
Дифракционные максимумы гидроксилапатита материала «ЛитАр» размыты вследствие микроискажений и дисперсности областей когерентного рассеивания. Это привело к их слиянию, что особенно проявилось в интервале углов сканирования 30-35 град (рис. 2, табл. 1). Кроме того, часть отражений структуры апатита на дифрактограмме материала не проявилась и имеются два отражения, характерные для брушита (наиболее сильные линии).
Таблица 1
Результаты РФА образцов
Эталонный гидроксилапатит Материал «ЛитАр», синтезированный без наложения поля Материал «ЛитАр», синтезированный при наложении поля частотой 50 кГц
d, А I, имп/с d, А I, имп/с Отнесение линий d, А I, имп/с Отнесение линий
4,0783 49 4,2374 52 Брушит1 4,2326 144 Брушит
3,8975 51 3,4394 50 Апатит2 4,1482 55 Брушит
3,4322 160 3,0442 53 Брушит 3,8984 49 Апатит
3,1786 45 2,8029 60 Апатит 3,7922 120 Брушит
3,0889 54 2,7037 46 Апатит 3,4285 73 Апатит
2,8146 200 2,6294 75 Апатит 3,0458 208 Брушит
2,7819 149 2,0697 25 Апатит 2,9256 78 Брушит
2,7188 140 1,9291 46 Апатит 2,8416 73 Апатит, брушит
2,6295 65 1,8771 24 Апатит 2,7936 80 Апатит
2,5278 24 1,8449 26 Апатит 2,7832 86 Апатит
2,2678 54 2,7321 75 Апатит
2,1614 22 2,6680 49 Брушит
2,0622 20 2,6218 80 Апатит, брушит
2,0010 20 2,4310 40 Брушит
1,9464 60 2,2673 40 Апатит
1,8927 31 2,1737 44 Брушит
1,8398 68 2,1493 30 Апатит, брушит
2,0545 22 Апатит
2,0222 29 Брушит
2,0014 40 Брушит
1,9487 26 Апатит
1,8990 40 Апатит, брушит
1,8762 40 Апатит, брушит
Примечание: 1 брушит - СаНРО4 ^2Н2О, 2 апатит - Са5(РО4)3ОН.
На дифрактограмме композита, синтезированного при наложении поля частотой 50 кГц присутствует больше отражений: и линии структуры апатита и линии структуры брушита. Дифракционные максимумы брушита узкие и интенсивные, т.е. его структура сформировалась лучше, чем структура гидроксилапатита.
Результаты количественной оценки полуширины (ПШПВ) дифракционных максимумов на половине высоты пика, полученных в угловом интервале 25-26,9 град. 20, свидетельствуют о влиянии электрочастотного воздействия на кристаллическую структуру исследуемого порошка гидроксилапати-та (табл. 2). При этом наибольшее влияние на состояние кристаллической структуры гидроксилапатита оказывает частотное воздействие величиной 200 кГ ц. При этой частоте величина ПШПВ существенно больше вследствие большей степени дисперсности областей когерентного рассеивания и микроискажений. Учитывая малый угловой диапазон фиксируемого дифракционного максимума, его размытие в большей степени определяется дисперсностью областей когерентного рассеивания. Для этой частоты отмечается также существенное смещение дифракционного максимума в сторону больших углов сканирования и уменьшение межплоскостного расстоя-
ния, соответствующего данному пику. Данное отражение соответствует индексам 002 и связано с размером кристалла апатита по оси с. Следовательно, можно предположить, что воздействие электрического поля частотой 50 кГц на процесс синтеза гидроксилапатита в матрице полимера повлияло не только на качество структуры кристаллов, но и на их размеры.
Таблица 2
Результаты количественной оценки полуширины дифракционного максимума на половине высоты
ПШПВ (рад) при частоте электрического воздействия (кГц):
Материал 0 50 200 2000
Гидроксилапатит - эталон 0,0029 - - -
Гидроксилапатит материала «ЛитАр» 0,0069 0,0057 0,0101 0,0068
Рис. 3. Дифрак ционные максиму мы в интервале углов 25-26,9 град. 20: а - гидрокси лапатит (эталон), б - порошок матери ала «ЛитАр» без воздействия поля, в - порошок матери ала «ЛитАр» (поле 50 кГц), г - порошок материала «ЛитАр» (поле 200 кГц), д - порошок материала «ЛитАр» (поле 2000 кГ ц)
* * *
Полученные результаты показали обоснованность разработанной методики синтеза имплантационных материалов для замещения дефектов костной ткани. Высокая пористость полученных материалов, нанометричные размеры кристаллов апатита и их относительно равномерное распределение между волокнами коллагена обусловливают преимущества апатит-коллаге-нового материала по сравнению с другими, особенно биокерамическими материалами. Перечисленные свойства синтезированного композита, а также введение в его состав фторид-иона позволили повысить скорость биодеградации материала «ЛшЛр» в организме, тогда как медленная биотрансформация биокерамических материалов, как и регенерация костной ткани в этих случаях, происходит достаточно долго, что повышает риск присоединения инфекции [21]. Модификация кристаллического компонента материала «ЛитAр» электрочастотным воздействием требует дальнейшего изучения.
Список литературы:
1. Третьяков Ю.Д. Развитие неорганической химии как фундаментальной основы создания новых поколений функциональных материалов II Успехи химии. - 2004. - Т. 73, № 9. - С. 899-915.
2. Strates B., Neuman W. F. On the mechanisms of calcification // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1958. - V 97, N 3. - P. 688-91.
3. Ньюмен У. и Ньюмен М. Минеральный обмен кости. - М.: Изд. ин. лит., 1961. - 270 с.
4. Eung-Je Lee, Su-Hee, Hae-Won Kim, Young-Min Kong, Hyoun-Ee Kim. Fluoridated apatite coatings on titanium obtanium obtained by electron-beam deposition // Biomaterials. - 2005. - Vol. 26. - C. 3843-3851.
5. Вердиев A.E, Ибрагимов Ф.И. Состояние опорно-двигательного аппарата при флюорозе II Ортопедия, травматология и протезирование. - 2000. -№ 4. - С. 126-130.
6. Франке Ю., Рунге Г. Остеопороз. - М.: Медицина. 1995. - 300 с.
7. Фториды и гигиена полости рта. Доклад Комитета экспертов ВОЗ по гигиене полости рта и исследованию фторидов II Стоматология. - 1995. -№ 5. - С. 30-41.
8. Litvinov S.D. Biological and clinical study kinetics of biodegrading apatite-collagen implant for substituting bone tissue defects // European Journal of DRUG METABOLISM and pharmacokinetics. - 1998. - Vol. 28, № 2. - P. 346-349.
9. Ершов ЮА., Литвинов С.Д., Царев Е.Р., Бойко В.И., Ершов ЕА. Способ формирования костной ткани. Пат. 2053733, Россия. Опубл. 10.02.96.
10. Шарло Г. Методы аналитической химии: количественный анализ неорганических соединений. - М.: Химия, 1969. - 1018 с.
11. Физико-химические методы анализа. Практ. руководство I Под ред.
В.Б. Aлесковского. - Л.: Химия. 1988. - 297 c.
12. Литвинов С.Д., Краснов А.Ф., Ершов Ю.А. Особенности регенерации костной ткани после замещения её дефектов синтетическим имплантатом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. - № 4. -
С. 435-438.
13. Litvinov S.D. Biological and clinical study kinetics of biodegrading apatite-collagen implant for substituting bone tissue defects // European Journal of DRUG METABOLISM and pharmacokinetics. - 1998. - Vol. 28, № 2. - P. 346-349.
14. Litvinov S.D., Seryogin A.S., Bulanov S.I., Demidov VYa., Berejnov VV The computed tomography control of collagen-apatite implant biotransformation in the low jaw // Calcified Tissue International. - 2000. - Vol. 65, Suppl. 1. - P. 126.
15. Судакова Т.В. Гидроксосоли биогенных элементов: синтез, свойства и применение: дисс. ... канд. хим. наук. - Самара, 2004. - 143 с.
16. Атлас ИК спектров фосфатов: Ортофосфаты / Под ред. В.В. Печков-ского. - М.: Наука, 1981. - 242 с.
17. www.curasan-online.de/de/ueber_uns/ Produkte/ cerasorb.php.
18. Velard F., Laurent-Maquin D., Bouthors S., Jallot E., Nedelee J.M., Bela-aouaj A., Laquerriere P. Zinc Doped Hydroxyapatite as Immunomodulatory Biomaterial // Journal of Artificial Organs. - 2009. - Vol. 32, № 7. - P. 457.
19. Зарембо В.И., Колесников А.А. Фоновое резонансно-структурное управление гетерофазными процессами // Теоретические основы химической технологии. - 2000. - Т. 40, № 5. - С. 520-532.
20. Зарембо В.И., Киселёва О.Л., Колесников А.А., Бурнос Н.А., Суворов К.А. Структурирование неорганических материалов под действием слабых электромагнитных полей радиочастотного диапазона // Неорганические материалы. - 2004. - Т. 40, № 1. - С. 96-102.
21. Park J.B., Lakes R.S. Biomaterials. An Introduction. - New York and London, 1992. - 394 p.
