CC BY
116
Модификация методики определения антикомплементарной ...
133
Е. В. Хлыбова, Е. С. Кормщикова, А. В. Дробкова
4
антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулина человека
Модификация методики определения
w
ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови»
Низкая антикомплементарная активность (АКА) - наиболее значимая характеристика внутривенной толерантности инфузионных форм иммуноглобулина человека. Принятый в России и внесенный в ряд частных фармакопейных статей предприятий метод оценки АКА, как и метод, предусмотренный Европейской фармакопеей, предполагают использование рабочей среды, содержащей барбитал натрия. Данное вещество постановлением Правительства Российской Федерации от 4 февраля 2013 г. № 78 «О внесении изменений в некоторые акты Правительства Российской Федерации» отнесено к средствам, обращение которых на территории РФ ограничено. В связи с этим возникла необходимость поиска новой рабочей среды для определения АКА.
Наиболее доступными веществами, поддерживающими изотоничность и обеспечивающими активность белков системы комплемента, являются соли натрия, кальция и магния. Поэтому в качестве возможных рабочих сред для определения АКА были рассмотрены: 0,15 М раствор NaCl, рН 7,0 (1); солевой раствор, содержащий СаСЬ 0,02 г/л, MgCh^^O 0,10 г/л и NaCl 8,5 г/л, рН 7,2 (2); солевой раствор с добавлением желатина (3); солевой раствор с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) (4). Главными требованиями к рабочей среде явились: доступность реактивов для приготовления; устойчивая и воспроизводимая работа компонентов, участвующих в реакции; сопоставимость результатов анализа с данными общепринятого метода, предусматривающего использование желатин-барбиталового буферного раствора (ЖББР), содержащего СaCl2 0,02 г/л, MgCh^^O 0,10 г/л, NaCl 8,5 г/л, веронала 0,575 г/л, мединала 0,375 г/л, желатина 1 г/л, рН 7,3 (5).
134
Вопросы экспериментальной, производственной и клинической ...
Схема определения АКА включала титрование гемолитической сыворотки, определение точки 50% гемолиза (титрование комплемента), постановку реакции связывания комплемента, учет результата реакции и расчет показателя АКА, выраженного в количестве гемолитических единиц комплемента, связанных 1 мг белка. Полученная величина АКА для внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ) не должна превышать 1 СН5о/мг. В работе использовали комплемент сухой (НПО «Микроген»), сыворотку диагностическую гемолитическую жидкую для реакции связывания комплемента (НПО «Микроген»), свежие эритроциты барана. Исследовали АКА 2 образцов ВВИГ - «Октагам» («Октафар-ма», Австрия), «Габриглобин-IgG, раствор для инфузий» (ЗАО «Иммуно-Гем», Россия) - и «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутримышечного введения» (ФГБУН КНИИ-ГиПК ФМБА России).
Рабочее разведение гемолитической сыворотки независимо от рабочей среды оказалось равным 1:800 ± 1 шаг титрования. Средние значения активности комплемента для растворов 1-5 составили 148,0; 214,0; 195,7; 221,1; 164,8 СН5о/мл соответственно.
Во всех постановках в присутствии внутримышечного иммуноглобулина комплемент не сохранял гемолитическую активность. Диапазоны значений АКА образцов ВВИГ представлены на рисунке 1.
Рисунок 1 - Значения АКА, полученные для растворов ВВИГ с использованием разных рабочих сред.
На рисунке синим цветом обозначен диапазон значений АКА Габриглобина, красным - Октагама.
Модификация методики определения антикомплементарной ...
135
Пунктиром показано критическое значение АКА - 1 СНбо/мг.
В рабочих средах 2 и 3 показатели АКА Габриглобина превышали критическое значение 1 СНбо/мг, чего не наблюдалось при анализе этого же образца референсным общепринятым методом. Показатели АКА ВВИГ, сопоставимые с результатом рефе-ренсного метода, получены при использовании растворов 1 и 4. Однако в среде солевого раствора с БСА наблюдалась высокая гемолитическая активность комплемента на этапе титрования: в каждом анализе она превышала 200 СНбо/мл, в то время как при использовании ЖББР активность комплемента варьировала от 115,6 до 194,4 СНбо/мл. В связи с этим в качестве рабочей среды для определения АКА был принят раствор 0,15 М натрия хлорида, рН 7,0.
Для подтверждения возможности использования модифицированной методики были проведены ее валидационные испытания. Исследуемыми образцами явились: Габриглобин серии 020613 (ОБУЗ «Челябинская ОСПК») (1), Габриглобин серии 060213 (ОБУЗ «Ивановская ОСПК») (2), Габриглобин серии 020414 (ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России) (3), раствор ИГ, подвергнутый глубокому кислотно-ферментативному гидролизу (образец с низкой АКА) (4), экспериментальная серия иммуноглобулина для внутримышечного введения (образец с высокой АКА) (5).
При валидации были установлены следующие критерии приемлемости:
• специфичность: в результате реакции с образцом 5 должна наблюдаться низкая степень гемолиза, значение АКА образца 3 не должно превышать 1;
• сходимость: коэффициент вариации (КВ) результатов каждого образца, полученных одним аналитиком, должен быть не более 5%;
• внутрилабораторная точность: КВ результатов двух аналитиков не должен превышать 10%.
Последовательность выполнения анализа и алгоритм расчетов при валидации соответствовал референсному методу. АКА образцов оценивалась шестикратно двумя аналитиками. Результаты анализа учитывали в том случае, если в диапазон титрования входили значения 50% гемолиза. Кроме показателя АКА, находили приведенную активность, выраженную в процентах, как отношение активности комплемента в присутствии препарата к активности комплемента в контроле, рассчитывали ее среднее значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации.
136
Вопросы экспериментальной, производственной и клинической ...
В образцах ВВИГ (1, 2 и 3) показатель АКА не превышал 1 СН5о/мг, что соответствует норме для данного вида препаратов. В присутствии образца 5 наблюдалось полное связывание комплемента, низкие значения гемолиза не позволили рассчитать показатель АКА и приведенную активность.
Значения АКА образца 4 во всех постановках не превышали 1 СН5о/мг, что с учетом результатов образца 5 доказывает специфичность методики. Значения КВ варьировали от 1,62 до 4,38%, что меньше заданного максимального - 5%, следовательно, методика удовлетворяет установленному критерию сходимости. При оценке внутрилабораторной точности КВ результатов двух аналитиков составил 3,05% для образца 3 и 2,19% для образца 4, что также удовлетворяет критерию приемлемости.
Таким образом, модифицированная методика определения АКА ВВИГ, предусматривающая использование в качестве рабочей среды 0,15 М раствора натрия хлорида с нейтральным значением рН, удовлетворяет установленным при валидации критериям приемлемости, применима для оценки качества внутривенных иммуноглобулинов и может быть включена в фармакопейную статью предприятия.
