CC BY
42
ORIGINAL ARTICLE
МЕТОДЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.456547.962.4].072
Бунятян Н.Д.1'2, Кривых М.А.2, Корнилова О.Г.2, Олефир Ю.В.2, Борисевич И.В.2
РАЗРАБОТКА НАЦИОНАЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ КАЧЕСТВА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ИНФУЗИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА В РАМКАХ ГАРМОНИЗАЦИИ С МЕЖДУНАРОДНЫМИ ТРЕБОВАНИЯМИ
1ФГБОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, 119991, г Москва;
2ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, 127051, г Москва
Обоснована необходимость разработки национальных стандартов качества определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения, обусловленная отсутствием стандартизованной фармакопейной методики ее определения и отечественного стандартного образца. Проведена гармонизация методики определения антикомплементарной активности, используемой при производстве и контроле качества отечественных препаратов иммуноглобулинов человека, с международными требованиями, по результатам которой разработана общая фармакопейная статья «Определение антикомплементарной активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения» (ОФС.1.8.2.0007.15). Проведены исследования по аттестации отечественного стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности, по результатам которых аттестованные значения (со степенью достоверности 95%) антикомплементарной активности отрицательного контроля находятся в интервале от 37,9 до 45,1%; положительного контроля — в интервале от 73,6 до 82,8%; стандартный образец дополнительно охарактеризован по содержанию белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом, полученные значения находятся в интервале от 100,2 до 103,8 мг/мл, на основании материалов по изучению стабильности обоснован срок годности 1,5 года. Использование разработанного национального стандартного образца в гармонизированной методике определения антикомплементарной активности позволяет обеспечить выпуск отечественных инфузион-ных препаратов иммуноглобулинов человека надлежащего качества.
Внедрение разработанной стандартизованной методики определения антикомплементарной активности в Государственную фармакопею Российской Федерации XIII издания послужило важным шагом к достижению высокого качества отечественных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения и гармонизации с международными стандартами, а также ключевым условием повышения их конкурентоспособности и выхода на зарубежные фармацевтические рынки.
Ключевые слова: антикомплементарная активность; иммуноглобулин человека, стандартный образец; аттестация.
Для цитирования: Бунятян Н.Д., Кривых М.А., Корнилова О.Г., Олефир Ю.В., Борисевич И.В. Разработка национальных стандартов качества для определения антикомплементарной активности инфузионных препаратов иммуноглобулина человека в рамках гармонизации с международными требованиями. Иммунология. 2016; 37(6): 337-343. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-337-343
Bunyatyan N.D.1-2, CurvesM.A.2, Kornilov O.G.2, Olefir Yu.V.2, Borisevich I.V.2
THE DEVELOPMENT OF NATIONAL QUALITY STANDARDS TO DETERMINE ANTICOMPLEMENTARY ACTIVITY OF INFUSION OF DRUGS IMMUNOGLOBULIN RIGHTS IN THE CONTEXT OF HARMONIZATION WITH INTERNATIONAL REQUIREMENTS
'«I.M. Sechenov First Moscow state medical University» Ministry of health of Russia, 119991, Moscow;
2«Scientific center of expertise of medical application products» Ministry of health of Russia, 127051, Moscow
The necessity of developing national quality standards determine the anticomplementary activity of human immunoglobulin preparations for intravenous administration due to the lack of a standardized method for determining the pharmacopeia and the national standard sample. Spend the harmonization of methods for determining the anticomplementary activity, used in the manufacture and quality control of drugs of domestic human immunoglobulin's with international requirements, the results of which developed a general chapter «Determination of anticomplementary activity of human immunoglobulin preparations for intravenous administration» (GC.1.8.2.0007.15). Investigations by the national certification standard sample of human immunoglobulin to determine the anticomplementary activity, the results of which certified values (with the degree of reliability of 95%) anticomplementary activity of the negative control are in the range of 37.9 to 45.1%; positive control — in the range of 73.6 to 82.8%; Standard sample was further characterized by protein content by the colorimetric method with biuret reagent obtained values are in the range of 100.2 to 103.8 mg/ml, based on materials to
Д ля корреспонденции: Кривых Максим Андреевич, эксперт I категории лаборатории иммуноглобулинов и препаратов крови Испытательного центра экспертизы качества МИБП ФГБУ НЦЭСМП, E-mail: Krivykh@expmed.ru
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
study the shelf life stability grounded 1.5 years. Using the developed national standard sample in a harmonized method of determining the anticomplementary activity allows for the release of domestic human immunoglobulin infusion drugs of good quality.
Implementation of the developed standardized methodology for determining the anticomplementary activity in the State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIII edition served as an important step towards the achievement of high-quality domestic products of human immunoglobulin for intravenous administration and harmonization with international standards, as well as the key to improving their competitiveness and access to foreign pharmaceutical markets.
Keywords: anticomplementary activity; human immunoglobulin; reference standard; validation.
For citation: Bunyatyan N.D., Curves M.A., Kornilov O.G., Olefir Yu. V., Borisevich I. V. The development of national quality standards to determine anticomplementary activity of infusion of drugs immunoglobulin rights in the context of harmonization with international requirements. Immunologiya. 2016; 37(6): 337-343. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-337-343
For correspondence: Krivykh Maxim Andreevich, expert of Testing center for Evaluation of medical immunobiological products quality, «Scientific Center for expert evaluation of medicinal products», E-mail: Krivykh@expmed.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. The study had no sponsorship.
Received 06.06.16 Accepted 16.08.16
Лекарственные препараты (ЛП) иммуноглобулинов человека для внутривенного введения (ИГВВ) — неотъемлемая часть фармакотерапии иммунодефицитных состояний, аутоиммунных и онкологических заболеваний. Они широко используются для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций [1]. За последние 20 лет спрос на ЛП ИГВВ значительно возрос в связи с расширением показаний к их применению, а также увеличением потребности в указанных препаратах в развивающихся странах [2]. В то же время проведение иммуноглобулинотерапии зачастую сопровождается рядом нежелательных реакций, таких как спонтанная активация системы комплемента с образованием анафилатоксинов, активация калликреин-кининовой, плаз-миновой систем и системы свертывания крови, изменение реологических свойств крови, инициация внутрисосудистого гемолиза и др. [3, 4].
Спонтанная активация системы комплемента с соответствующими клиническими проявлениями (одышка, дрожь, в редких случаях реакции анафилактического и анафилак-тоидного типа), по мнению ряда исследователей, вероятно, обусловлена присутствием в ЛП агрегированных и/или поврежденных при фракционировании молекул иммуноглобулина, на Fc-участке которых происходит спонтанная активация комплемента, что приводит в свою очередь к активации макрофагов и высвобождению вазоактивных субстанций [1, 3, 5]. Показателем качества ЛП ИГВВ, характеризующим указанные нежелательные реакции, служит антикомплементарная активность (АКА).
АКА, не превышающая 50%, что соответствует не более 1 СН50/мг белка, позволяет предотвратить возникновение возможных нежелательных реакций при внутривенных ин-фузиях ЛП иммуноглобулинов и обеспечить их терапевтическую эффективность.
Согласно рекомендациям экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), все серии ЛП ИГВВ подлежат обязательному испытанию на антикомплементарную активность [6], поскольку ее уровень in vitro имеет значение для прогноза возможных нежелательных реакций ЛП in vivo.
Методика определения АКА сопряжена с рядом критических параметров, связанных с использованием биологических реагентов, таких как комплемент морских свинок, эритроциты барана и гемолитическая сыворотка [3], вариабельность которых обусловливает необходимость использования стандартного образца (СО), гарантирующего достоверность получаемых результатов в различных диапазонах значений АКА.
В производстве большинства зарубежных ЛП ИГВВ для стандартизации методик контроля готового ЛП применяют международные СО. В настоящее время в мировой практи-
ке для определении АКА используют СО иммуноглобулина человека (Human immunoglobulin (ACA and molecular size), BRP batch 1) с аттестованными значениями АКА отрицательного контроля в диапазоне от 10 до 40% и положительного контроля в диапазоне от 60 до 100% [7]. ВОЗ настоятельно рекомендует использование национальных (отечественных) СО [8].
Российские производители ЛП ИГВВ до настоящего времени использовали методики определения АКА, описанные в методических рекомендациях [1] 1988 г. и методических указаниях [2] 2001 г., которые не предусматривают применение СО. Методика [1], введенная в действие в 1988 г., не позволяет оценить соответствие ЛП иммуноглобулинов человека современным международным требованиям, поскольку предусматривает определение АКА как «сохранение активности 2 гемолитических единиц в присутствии 10 мг белка иммуноглобулина». Методика [2] стала первым шагом на пути к гармонизации российских стандартов качества на ЛП ИГВВ с международными. В то же время в отличие от методики зарубежных фармакопей данная методика предполагает использование барбитала и его натриевой соли в составе буферного раствора, сухого (коммерческого) комплемента морских свинок, рассчитана на больший объем реакционной смеси (общий объем после добавления сенсибилизированных эритроцитов составляет 7,5 вместо 1,5 мл, используемых в методике зарубежных фармакопей [9, 10]), а также не предусматривает расчет АКА в процентах. Получение достоверных значений АКА достигается проведением исследований в стандартизованных условиях. Использование производителями указанных методик определения АКА значительно снижает конкурентные преимущества российских ЛП ИГВВ относительно их зарубежных аналогов по критерию оценки «эффективность/безопасность».
Общемировой тенденцией стала гармонизация нормативов и форм контроля в сфере обеспечения эффективности, безопасности и качества фармацевтической продукции. Государственное регулирование фармацевтического рынка направлено на обеспечение обращения только тех ЛП, которые соответствуют национальным и международным стандартам качества, эффективности и безопасности [11].
Одно из приоритетных направлений по развитию государственной системы контроля качества, эффективности и безопасности — создание системы государственной стандартизации в области контроля качества лекарственных средств, включая систему аттестации государственных СО и периодического издания российской государственной фармакопеи. Результаты стандартизации лекарственных средств находят свое отражение в специальных нормативных документах — фармакопейных статьях [11].
ORIGINAL ARTICLE
Цель настоящих исследований — гармонизация российских стандартов качества определения АКА с международными требованиями и разработка национального СО иммуноглобулина человека для определения АКА.
Материал и методы
Коммерческие серии ЛП иммуноглобулина человека в различных формах выпуска с содержанием белка более 45 мг/мл, произведенные российскими фармацевтическими предприятиями. Образцы ЛП иммуноглобулинов человека, подвергшиеся термической обработке на водяной бане (температура воды 56 ± 1 °c), длительность которой зависит от формы выпуска [12, 13]. СО иммуноглобулина человека (антикомплементарная активность и молекулярные параметры) BRP, серия 1 (Human immunoglobulin (AcA and molecular size)) BRP batch 1 (Кат. № Y0001504), утвержденный Европейским директоратом по качеству лекарственных средств и здравоохранения, Франция (European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM) в 2011 г.
Определение антикомплементарных свойств иммуноглобулинов. Изучение антикомплементарных свойств препаратов иммуноглобулина человека проводили в реакции связывания комплемента [9], метод определения основан на способности иммуноглобулинов человека связывать комплемент, препятствуя лизису сенсибилизированных эритроцитов барана.
В настоящем исследовании использовали коммерческие наборы реагентов «Сыворотка диагностическая гемолитическая жидкая» (НПО «Микроген», Россия); «Антисыворотка кролика к эритроцитам барана Амбоцептор 6000» (Siemens, Германия); «Сыворотка диагностическая гемолитическая кроличья жидкая для РСК» (ЗАО «ЭКОлаб», Россия); кровь баранью дефибринированную с цитратом натрия (ЗАО «ЭКОлаб», Россия), пулированный (in house) комплемент морских свинок собственного изготовления [9].
результаты
Проведенный научный анализ современного состояния проблемы стандартизации ЛП иммуноглобулинов человека по АКА выявил отсутствие указаний об использовании СО в отечественном фармацевтическом анализе качества. При использовании методики [2] для определения АКА отрицательного и положительного контролей СО иммуноглобулина человека BRP получены значения, не соответствующие аттестованным, что показало целесообразность оптимизации данной методики с учетом требований Европейской фармакопеи.
Методика определения АКА предусматривает приготовление гемолитической системы, состоящей из гемолитической сыворотки в соответствующем разведении и 5% суспензии эритроцитов барана в соотношении 1:1. Исследования нескольких серий гемолитической сыворотки различного производства позволили определить их одинаковую активность. Одна минимальная гемолитическая единица в 1 мл (МГЕ/мл) содержалась в разведении 1:500, соответственно при определении АКА необходимо использовать 2 МГЕ/мл, содержащиеся в разведении 1/250 (рис. 1).
Для получения 5% суспензии эритроцитов барана возможно использование крови бараньей дефибринированной или дефибринированной с цитратом натрия. Из-за нестабильности крови бараньей дефибринированной ее применение ограничено 14 днями, после чего начинается спонтанный гемолиз, поэтому в настоящем исследовании предпочтение отдано использованию крови бараньей дефибринированной с цитратом натрия.
Различные серии комплемента морских свинок оказывают значительное влияние на конечный результат определения АКА, и подходящие серии комплемента должны быть определены в процедуре скрининга [3]. Проведенные исследования по изучению влияния комплемента морских свинок
70 п 60
CD
§ 50 I 40
I зо
Ï 20 О
10
ММ'
1 МГЕ/мл
\
I
I
50 100 250 500 1000 2000 3000 4000
Разведение 1
70 п 60
ее
I 50
I 40 л
X
а>
£ 20 О
30
10
I ♦ I
1 МГЕ/мл
50 100 250 500 1000 2000 3000 4000
Разведение 1
3
. 1 МГЕ/мл
I I \
f I
I
%
7060"
со
§ 50-
0
| 40-
1 зо-
2 20" о
ю-
o-l-1-1-1-1-1-1-1-1
50 100 250 500 1000 2000 3000 4000
Разведение 1
Рис. 1. Результаты определения активности (МГЕ/мл) гемолитических сывороток производства.
1 — Siemens, Германия; 2 — ЗАО «ЭКОлаб», Россия; 3 — НПО «Микро-ген», Россия.
различных производителей (два коммерческих комплемента и пулированный комплемент (in house) собственного изготовления) позволили установить, что только при использовании пулированного комплемента (in house) значения АКА СО иммуноглобулина человека BRP серии 1 соответствуют аттестованным (табл. 1). В настоящем исследовании обосновали возможность применения в стандартизованной методике желатин-солевого раствора (ЖСР), поскольку применение барбитала и его натриевой соли в составе буферного раствора ограничено необходимостью соответствующего лицензирования. Возможность использования ЖСР подтверждена соответствием значений АКА отрицательного и положительного контролей СО иммуноглобулина человека BRP аттестованным (рис. 2).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
22,3 17,5 12,7
23.2
18.3
13.4
Область аттестованных значений положительного контроля
m
75|6
Область аттестованных значений отрицательного контроля
о.
N
CL
N
CL Ш LQ
S
О-Ш LU
S
Рис. 2. Антикомплементарная активность положительного (АКА «+») и отрицательного (АКА «-») контроля стандартного образца иммуноглобулина человека BRP при использовании желатин-солевого раствора (ЖСР) и желатин-барбиталового буферного раствора (ЖББР).
Таким образом, проведенные исследования позволили обосновать оптимальные условия определения АКА ЛП ИГВВ, предусматривающие использование эритроцитов из крови бараньей дефибринированной с цитратом натрия, гемолитической сыворотки в соответствующем разведении, пулированного комплемента морских свинок (in house) и ЖСР как альтернативу ЖББР [14]. Оптимизированная методика послужила основой для разработки общей фармакопейной статьи «Определение антикомплементарной активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения», вошедшей в состав Государственной фармакопеи Российской Федерации XIII издания.
Таблица 1
Антикомплементарная активность стандартного образца иммуноглобулина человека BRP при использовании комплемента морских свинок различных производителей
Наименование реагента/Произ- Серия реагента (количество исследований) Антикомплементарная активность СО иммуноглобулина человека BRP, процент,? ± S Соответствие аттестованным значениям антикомплементарной активности СО иммуноглобулина человека БЯР
водитель отрица- положи- отрица- положи-
тельный тельный тельный тельный
контроль контроль контроль* контроль**
Комплемент 785 (n = 6) 8,5 ± 2,2 14,6 ± 3,7 Нет Нет
сухой/НПО «Микроген», Россия 806 (n = 5) 13,4 ± 1,7 Определить невозможно Да Нет
811 (n = 9) 11,6 ± 2,5 36,4 ± 5,9 Нет Нет
814 (n = 8) 11,5 ± 3,1 32,2 ± 5,3 Нет Нет
COMPLEMENT/ 42178 (n = 7) 14,2 ± 2,8 36,3 ± 5,2 Да Нет
Siemens 42794 (n = 10) 13,6 ± 2,6 40,1 ± 4,6 Да Нет
Пулированный 24.10.13 (n = 8) 18,8 ± 3,4 79,5 ± 2,4 Да Да
комплемент/ш hou.se 21.01.14 (n = 12) 18,5 ± 2,9 84,0 ± 4,1 Да Да
15.06.15 (n = 7) 20,9 ± 2,4 76,6 ± 2,5 Да Да
Примечание. * — аттестованные значения составляют от 10 до 40%; ** — аттестован-
ные значения составляют от 60 до 100%.
С целью разработки отечественного СО иммуноглобулина человека для определения АКА изучена возможность использования ЛП ИГВВ российского производства в качестве кандидата в СО. Нами отобраны по три серии различных лекарственных форм ИГВВ, результаты исследования (табл. 2) свидетельствуют о возможности использования изученных ЛП ИГВВ в качестве отрицательного контроля и их непригодности в качестве положительного контроля в составе одноком-понентного СО для определения АКА.
По мнению ряда исследователей [3, 5, 15], одним из факторов, обусловливающих спонтанную активацию комплемента, служит присутствие в ЛП агрегированных и поврежденных при фракционировании молекул иммуноглобулина. Нормативными требованиями к ЛП ИГВМ регламентировано повышенное содержание агрегированных молекул иммуноглобулина (до 10%). С целью изучения возможности использования в качестве кандидатов в положительный/отрицательный контроли СО были исследованы образцы 17 серий ЛП ИГВМ (табл. 3), полученные результаты свидетельствует о непригодности изученных ЛП в качестве кандидата в положительный контроль и в то же время возможности их использования в качестве отрицательного контроля СО.
Проведенный ретроспективный анализ результатов молекулярно-массового распределения молекул иммуноглобулина, полученных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-спектрофотометрическим детектированием в 330 сериях ЛП ИГВМ, позволил сделать вывод о том, что содержание полимеров и агрегатов во всех изученных сериях не превысило 1,32% и соответствует требованиям, предъявляемым к содержанию полимеров и агрегатов в инфузионных ЛП иммуноглобулинов человека — не более 3%, что, возможно, объясняет полученные значения АКА.
Проведенный анализ научной литературы позволил сделать вывод о том, что прогревание иммуноглобулинов человека приводит к увеличению их АКА [3]. С целью разработки положительного контроля СО выбор температуры термической обработки образцов ЛП ИГВВ/ИГВМ основывался на том, что температура более 50 °С обусловливает конформационные изменения молекул иммуноглобулина [16].
Для выбора оптимального времени прогревания на водяной бане при температуре 56 ± 1 °С образцов ЛП ИГВВ/ИГВМ для получения значений АКА, удовлетворяющих требованиям к положительному контролю СО, ампулы с раствором иммуноглобулина по 1 и 1,5 мл прогревали в течение 3, 5 и 7 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 15 мин; ампулы по 3 и 3,4 мл прогревали в течение 5, 7 и 10 мин с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 15 мин; флаконы по 25 мл прогревали в течение 10, 15 и 20 мин, затем охлаждали 20 мин.
Результаты исследований позволяют сделать вывод, что оптимальная продолжительность термической обработки образцов ЛП ИГВВ/ИГВМ в ампулах с раствором иммуноглобулина по 1 и 1,5 мл составляет 5 мин; в ампулах по 3 и 3,4 мл — 7 мин; во флаконах по 25 мл — 15 мин (табл. 4).
Таким образом, проведенные исследования позволили обосновать двухкомпо-нентный состав СО и выбрать кандидатов в отрицательный и положительный кон-
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 2
Антикомплементарная активность лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения
Иммуноглобулин человека нормальный в лекарственной форме № образца/ Количество исследований Антикомплементарная активность, процент, X ± Sx
Отрицательный контроль Положительный контроль
Лиофилизат для 1/6 15,7 ± 3,3
приготовления рас- 2/5 19,4 ± 3,8 Определить
твора для внутри- 3/7 22,3 ± 5,8 невозможно
венного введения
Раствор для внутри- 1/4 12,0 ± 2,2
венного введения 2/4 13,0 ± 1,8 То же
3/4 22,2 ± 6,4
Раствор для 1/3 20,1 ± 3,8
инфузий 2/5 22,4 ± 1,7 " "
3/4 24,2 ± 5,2
троли. Отрицательный контроль — образец иммуноглобулина человека для внутривенного/внутримышечного введения, положительный контроль — образец ИГВВ/ИГВМ, подвергшийся термической обработке на водяной бане при температуре 56 ± 1 °С в течение определенного времени.
Аттестация стандартного образца. Установление значений аттестуемой характеристики СО для определения АКА проводили в одной лаборатории с использованием СО иммуноглобулина человека BRP серии 1 и методики измерений, метрологические характеристики которой были определены в рамках внутрилабораторной валидации. Исследования провели три аналитика, получили 27 независимых результатов в условиях промежуточной прецизионности (табл. 5).
Средние значения АКА для отрицательного контроля СО составили 41,5%; для положительного контроля СО — 78,2%. Стандартное отклонение значений отрицательного контроля составило 1,8%, положительного контроля — 2,3%.
Коэффициент вариации результатов определения АКА, характеризующий стандартную неопределенность от способа
Таблица 3
Антикомплементарная активность лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутримышечного введения
Группировочное наименование № серии образца Значения антикомплементарной активности, процент, X ± Sx, n = 3
Иммуноглобулин человека 1 43,2 ± 1,4
противостафилококковый 2 37,4 ± 5,1
Иммуноглобулин человека 1 40,5 ± 1,1
противостолбнячный 2 34,7 ± 0,8
Иммуноглобулин человека 1 43,0 ± 1,3
нормальный 2 42,5 ± 1,6
3 41,0 ± 1,9
4 40,5 ± 2,1
5 39,9 ± 2,4
6 40,9 ± 1,8
Иммуноглобулин человека 1 32,6 ± 4,8
против гепатита В 2 35,2 ± 3,3
Иммуноглобулин человека 1 29,5 ± 2,3
противоаллергический 2 33,4 ± 1,5
Иммуноглобулин против 1 41,0 ± 1,5
клещевого энцефалита 2 42,4 ± 1,9
3 40,7 ± 1,8
установления аттестованного значения, составил 4,34 и 2,94% для отрицательного и положительного контроля соответственно. Расширенная неопределенность аттестованного значения АКА (степень достоверности 95%) составила 3,6 и 4,6% для отрицательного и положительного контроля соответственно. В качестве дополнительной характеристики изучено содержание белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом составившее 102 ± 1,8 мг/мл (степень достоверности 95%).
Обсуждение
Развитие системы контроля качества над реактивами и реагентами, являющимися критическими параметрами и источником вариабельности определения АКА, разработка стандартизованной методики определения АКА должны быть главными требованиями для испытания выпускаемых серий ЛП ИГВВ.
Качество используемого комплемента морских свинок имеет четко выраженное влияние на результат определения АКА и не может быть стандартизировано в настоящее время [3]. Это вызвано биологической изменчивостью от серии к серии, которая не может быть определена известными критериями качества. Полученные нами результаты подтверждают выводы Buchacher A. и соавт. о том, что каждая коммерческая серия комплемента должна быть проверена на пригодность, несоответствующие серии комплемента необходимо исключать путем скрининга перед использованием в рутинных исследованиях.
Таким образом, проведенные исследования позволили обосновать оптимальные условия определения АКА ЛП ИГВВ, предусматривающие использование эритроцитов из крови бараньей дефибринированной с цитратом натрия, гемолитической сыворотки в соответствующем разведении, пулированного комплемента морских свинок (in house) и желатин-солевого раствора как альтернативу желатин-барбиталовому буферному раствору. Оптимизированная методика послужила основой для разработки общей фармакопейной статьи «Определение антикомплементарной активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения», вошедшей в состав Государственной фармакопеи РФ XIII издания.
Проведенные исследования позволили обосновать выбор кандидата в СО и способ получения его положительного контроля. Получена серия СО для определения АКА, представляющая собой два компонента: отрицательный контроль — образец иммуноглобулина человека для внутримышечного введения, положительный контроль — образец иммуногло-
Таблица 4
Антикомплементарная активность образцов иммуноглобулина человека до и после термической обработки
Образец, подвергшийся Антикомплементарная активность,
термической обработке процент, X ± Sx, n = 7
до тер- после термической обра-
мическои ботки (продолжительность
обработки обработки)
Иммуноглобулин 40,5 ± 2,1
человека(раствор для внутримышечного введения), ампулы по 1 и 1,5 мл
Иммуноглобулин челове- 41,2 ± 1,7 ка (раствор для внутримышечного введения), ампулы по 3 и 3,4 мл
Иммуноглобулин чело- 21,3 ± 4,9 века (раствор для внутривенного введения), флаконы по 25 мл
56,3 ± 2,4 (3 мин) 75,8 ± 2 (5 мин) Определить невозможно (7 мин)
57,6 ± 2,8 (5 мин) 83,2 ± 2,5 (7 мин) Определить невозможно (10 мин) 56,2 ± 3,9 (10 мин) 75,1 ± 1,8 (15 мин) Определить невозможно (20 мин)
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 5
результаты определения антикомплементарной активности стандартного образца
Аналитик Дата проведения исследования Антикомплементарная активность стандартного образца иммуноглобулина человека BRP, % Антикомплементарная активность стандартного образца, %
отрицательный контроль положительный контроль отрицательный контроль положительны й контроль
X X ± Sx X X ± Sx
39,4 76,5
17.06.14 23,1 84,1 42,9 42,3 ± 2,6 74,1 76,1 ± 1,9
44,5 77,8
42,9 73,4
Аналитик 1 18.06.14 13,8 80,4 42,9 43,4 ± 0,9 42,6 ± 1,6 74,0 75,6 ± 3,3 76,0±2,1
44,5 79,4
41,0 77,4
19.06.14 20,1 84,0 41,8 42,0 ± 1,1 74,4 76,3 ± 1,7
43,2 77,2
40,6 79,4
17.06.14 15,5 86,2 38,7 40,6 ± 1,9 81,4 80,4 ± 1,0
42,4 80,4
38,6 81,0
Аналитик 2 18.06.14 20,7 86,7 38,6 39,3 ± 1,2 40,9 ± 2,1 80,4 80,1 ± 1,1 80,0±0,9
40,7 78,8
42,9 78,9
19.06.14 16,5 84,6 41,5 42,9 ± 1,4 80,5 79,7 ± 0,8
44,3 79,6
41,4 80,1
17.06.14 18,9 77,5 42,5 40,9 ± 2,0 78,4 79,7 ± 1,1
38,7 80,5
42,3 79,9
Аналитик 3 18.06.14 23,3 88,4 40,7 41,3 ± 0,9 41,1 ± 1,3 76,7 78,7 ± 1,7 78,5±1,7
40,9 79,5
42,8 78,7
19.06.14 14,4 77,4 39,7 41,3 ± 1,6 75,9 77,2 ± 1,4
41,3 76,9
булина человека для внутримышечного введения, подвергшийся термической обработке на водяной бане (температура воды 56 ± 1°С) в течение 5 мин.
Проведена аттестация СО для определения АКА (со степенью достоверности 95%) получены значения АКА отрицательного контроля в интервале от 37,9 до 45,1%; положительного контроля в интервале от 73,6 до 82,8%; по содержанию белка в интервале от 100,2 до 103,8 мг/мл. Исследования по изучению стабильности позволили установить срок годности для СО для определения АКА — 1,5 года.
Заключение
Таким образом, внедрение разработанной стандартизованной методики общей фармакопейной статьи «Определение антикомплементарной активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения» в состав Государственной фармакопеи Российской Федерации XIII издания послужило важным шагом к достижению высокого качества отечественных инфузионных препаратов иммуноглобулинов человека и гармонизации с международными стандартами, а также стало ключевым условием повышения конкурентоспособности ЛП и выхода на зарубежные фармацевтические рынки.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Корнилова О.Г., Кривых М.А., Кудашева Э.Ю., Бунятян Н.Д., Лебединская Е.В., Нечаев А.В. и др. Гармонизация требований к специфической безопасности препаратов иммуноглобулинов человека с мировыми стандартами качества. Фармация. 2015; (2): 43—6.
2. Plasma Economics: Concept of Plasma Market Driver. Available at: http://marketingresearchbureau.com/plasma-industry/plasma-eco-nomics-concept-of-plasma-market-driver/ (accessed 21.07.2016).
3. Buchacher A., Schluga P., Mullner J., Schreiner M., Kannicht C., Weinberger J. Anticomplementary activity of IVIG concentrates — important assay parameters and impact of IgG polymers. Vox Sang. 2010; 98: 209—18.
4. Корнилова О.Г. Современные аспекты изучения специфической безопасности препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016; 8(4): 526—30.
5. Miekka S.I., Gozze I. Anticomplementary activity of human Immu-noglobulin G: I. Mechanism of the artifactual increase in anticomple-mentary activity of IgG during assay. Vox Sang. 1975; 29: 101—23.
6. World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization: Forty-third Report. WHO Technical Report Series 840. Geneva, 1992; Available at: http://whqlibdoc.who.int/trs/WHO_ TRS_840.pdf (accessed 21.07.2016).
7. Sandberg E., Costanzo A., Daas A., Buchheit K.-H. Calibration of the human immunoglobulin BRPs for ACA and molecular size (batch 1) and for Fc function and molecular size (batchs 1&2). In: Pharmeu-ropaBio & SN. 2012; 1—15.
8. World Health Organization Expert Committee on biological standardization. Recommendations for the preparation, characterization and es-
tablishment of international and other biological reference standards. In: WHO Technical Report Series 932, annex 2. Geneva, 2004; 73—131.
9. European Pharmacopoeia 8.1, 01/2010:20617 corrected 7.6 «Test for anticomplementary activity of immunoglobulin». Available at: http:// online6.edqm.eu/ep801/# (accessed 21.07.2016).
10. Indian Pharmacopoeia. Human Normal Immunoglobulin for Intravenous Use. 2010; Vol. III: 2579—86.
11. Стратегии лекарственного обеспечения населения Российской Федерации на период до 2025 года и плана ее реализации. Available at: http://www.garant.ru/products/ ipo/prime/ doc/70217532/#ixzz4J0gMzzy0 (accessed 21.07.2016).
12. Кривых М.А., Корнилова О.Г., Кудашева Э.Ю. Способ получения положительного контроля стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека, и стандартный образец иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека. Патент РФ № 2577703; 2015.
13. Кривых М.А., Корнилова О.Г., Бунятян Н.Д., Кудашева Э.Ю., Ру-нова О.Б., Малкова В.И. и др. Разработка стандартного образца для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека.Хим.-фарм. журн. 2015; 49(6): 40—2.
14. Кривых М.А., Корнилова О.Г., Бунятян Н.Д., Кудашева Э.Ю. Оптимизация условий определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения. Хим.-фарм. журн. 2015; 49(7): 39—42.
15. Ramasamy I., Tran E., Farrugia A. Measurement of anticomplemen-tary activity in therapeutic intravenous immunoglobulin preparations. Biologicals: J. Int. Assoc. Biol. Standard. 1997; 25(1): 87—92.
16. Северин Е.С. (ред.) Биохимия: Учебник. 2-е изд. М.: ГЭОТАР-МЕД; 2004.
references
1. Kornilova O.G., Krivykh M.A., Kudasheva E.Yu., Bunyatyan N.D., Lebedinskaya E.V., Nechaev A.V. et al. Harmonization of requirements for the specific safety of human immunoglobulin preparations with the world quality standards. Farmatsiya. 2015; (2): 43—6. (in Russian)
2. Plasma Economics: Concept of Plasma Market Driver. Available at: http://marketingresearchbureau.com/plasma-industry/plasma-eco-nomics-concept-of-plasma-market-driver/ (accessed 21.07.2016).
3. Buchacher A, Schluga P., Mullner J., Schreiner M., Kannicht C., Weinberger J. Anticomplementary activity of IVIG concentrates — important assay parameters and impact of IgG polymers. Vox Sang. 2010; 98: 209—18.
4. Kornilova O.G. Modern aspects of studying specific security prepara-
ORIGINAL ARTICLE
tions of human immunoglobulins. Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnykh i fundamental'nykh issledovaniy. 2016; 8(4): 526—30. (in Russian)
5. Miekka S.I., Gozze I. Anticomplementary activity of human Immunoglobulin G: I. Mechanism of the artifactual increase in anticomplementary activity of IgG during assay. Vox Sang. 1975; 29: 101—23.
6. World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization: Forty-third Report. WHO Technical Report Series 840. Geneva, 1992; Available at: http://whqlibdoc.who.int/trs/WHO_ TRS_840.pdf (accessed 21.07.2016).
7. Sandberg E., Costanzo A., Daas A., Buchheit K.-H. Calibration of the human immunoglobulin BRPs for ACA and molecular size (batch 1) and for Fc function and molecular size (batchs 1&2). In: Pharmeu-ropaBio & SN. 2012; 1—15.
8. World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards. In: WHO Technical Report Series 932, annex 2. Geneva, 2004. 73—131.
9. European Pharmacopoeia 8.1, 01/2010:20617 corrected 7.6 «Test for anticomplementary activity of immunoglobulin». Available at: http:// online6.edqm.eu/ep801/# (accessed 21.07.2016).
10. Indian Pharmacopoeia. Human Normal Immunoglobulin for Intravenous Use. 2010; Vol. III: 2579—86.
11. Strategy of drug provision of the population of the Russian Federation for the period up to 2025 and its implementation plan. Available at: http://www.garant.ru/products/ ipo/prime/ doc/70217532/#ixzz4J0gMzzy0 (accessed 21.07.2016).
12. Krivykh M.A., Kornilova O.G., Kudasheva E.Yu. Methodfor Produc-ingPpositive Control Standard Sample of Human Immunoglobulin to Determine Anticomplementary Activity of Preparations of Human Immunoglobulin, and Standard Sample of Human Immunoglobulin to Determine Anticomplementary Activity of Preparations of Human Immunoglobulin. PatentRFN 2577703; 2015. (in Russian)
13. Krivykh M.A., Kornilova O.G., Bunyatyan N.D., Kudasheva E.Yu., Runova O.B., Malkova V.I. et al. Development of a reference standard for the determination of anticomplementary activity of human immunoglobulin. Khim.-farm. zhurn. 2015; 49(6): 40—2. (in Russian)
14. Krivykh M.A., Kornilova O.G., Bunyatyan N.D., Kudasheva E.Yu. Optimization of the conditions for determining anticomplementary activity of human immunoglobulin preparations for intravenous injection. Khim.-farm. zhurn. 2015; 49(7): 39—42. (in Russian)
15. Ramasamy I., Tran E., Farrugia A. Measurement of anticomplementary activity in therapeutic intravenous immunoglobulin preparations. Biologicals: J. Int. Assoc.Biol. Standard. 1997; 25(1): 87—92.
16. Severin E.S. (ed.) Biochemistry: A Textbook. [Biokhimiya: Ucheb-nik.]. 2nd ed., Moscow: GEOTAR-MED; 2004.
Поступила 06.06.16 Принята в печать 16.08.16
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.31:547.913.5].07
Смирнов В.В.1-2, Петухов А.Е.1-2, Андреев С.М.1, Шабанова Д.Д.1, Егоренков Е.А.1, Шершакова Н.Н.1, Хаитов М.Р.1
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУЛЛЕРЕНА С60 В ВОДНЫХ СРЕДАХ
1ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г Москва, Россия; 2ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», 199911, г Москва
Разработан метод количественного определения перспективного вещества, обладающего иммунологической активностью, — фуллерена C60 в водных средах, пригодный для анализа его содержания в фармацевтических субстанциях, лекарственных средствах, а также в биологических образцах при фармакокинетических исследованиях. Извлечение фуллерена из исследуемых образцов осуществляется жидкостной или твердофазной экстракцией с последующим анализом методом ВЭЖХ с использованием УФ-, МС- и МС/МС-детекторов.
Ключевые слова: фуллерен C60; ВЭЖХ; УФ-, МС-, МС/МС-детекторы.
Для цитирования: Смирнов В.В., Петухов А.Е., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Егоренков Е.А., Шершакова Н.Н., Хаитов М.Р. Количественное определение фуллерена С в водных средах. Иммунология. 2016; 37(6): 343-347. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-343-347
Для корреспонденции: Смирнов Валерий Валерьевич, E-mail: vall@mail.mipt.ru
