CC BY
102
УДК 577.352
Модификаторы дипольного потенциала липидных бислоев
С. С. Ефимова*, О. С. Остроумова
Институт цитологии РАН, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 29.04.2015
РЕФЕРАТ Работа посвящена оценке величин изменения дипольного потенциала (фй) мембран при адсорбции потенциальных модификаторов на липидных бислоях различного состава. С целью выявления диполь-модифицирующих свойств проверены флавоноиды, миорелаксанты, тиреоидные гормоны, ксантеновые и стирилпиридиновые красители. Количественное описание модифицирующего действия флавоноидов, миорелаксантов, тиреоидных гормонов и ксантеновых красителей представлено в виде отношения максимального изменения дипольного потенциала бислоя при насыщении к абсолютному значению фй не-модифицированной мембраны. Определены коэффициенты наклона линейных зависимостей увеличения дипольного потенциала фосфолипидных бислоев от концентрации стирилпиридиновых красителей в мембраноомывающих растворах. Охарактеризованы зависимости величины изменения фй от химической структуры модификаторов, а также от заряда и спонтанной кривизны липидных монослоев. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА дипольные модификаторы, дипольный потенциал мембраны, ксантеновые и стирил-пиридиновые красители, миорелаксанты, плоские липидные бислои, спонтанная кривизна, тиреоидные гормоны, флавоноиды.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДФФХ - 1,2-дифитаноил-эте-глицеро-3-фосфохолин; ДОФХ - 1,2-диолеил-эте-глицеро-3-фосфохолин; ДОФС - 1,2-диолеил-эте-глицеро-3-фосфосерин; ДОФЭ - 1,2-диолеил-эте-глицеро-3-фосфоэтаноламин.
ВВЕДЕНИЕ
Одна из актуальных задач современной молекулярной фармакологии - поиск веществ, способных влиять на величину дипольного потенциала мембраны (фй), а следовательно, регулировать процессы транспорта через плазматическую мембрану как в норме, так и при патологии. Этот скачок потенциала на границе раздела фаз бислой-раствор возникает в результате определенной взаимной ориентации диполей мембранных липидов и адсорбированной на поверхности бислоя воды [1-4]. Дипольный потенциал мембраны зависит от ее липидного состава. Существенную роль играют степень ненасыщенности, длина и число углеводородных цепей в молекуле фосфолипидов [5-7]. Чаще всего дипольными модификаторами являются амфифильные вещества, молекулы которых имеют значительный дипольный момент и характеризуются специфической ориентацией на границе раздела фаз. Опубликованы сведения об успешном использовании дипольных модификаторов в качестве инструментов для изучения молекулярных механизмов формирования и функционирования ионных каналов, образованных различными токсинами и антимикробными агентами
[8-25]. Установлено, что дипольмодифицирующие свойства проявляют некоторые флавоноиды, стероиды, тиреоидные гормоны, ксантеновые и стирилпи-ридиновые красители [1-3, 26-30].
Флавоноиды являются наиболее распространенными фенольными соединениями растительного происхождения. Это производные бензо-гамма-пи-рона, в основе структуры которых лежит скелет из двух бензольных колец (А и В), соединенных между собой трехуглеродным фрагментом (С2-С3-С4). Классификация флавоноидов основана на степени окисленности пирана (2-фенилхромана, или кольца С). Выделяют следующие группы: халконы, фла-воны, флавонолы, флаваноны, флаванонолы, изо-флавоноиды и др. До недавнего времени считалось, что на величину дипольного потенциала мембран способны влиять только халконы, флоретин и его гликозид флорицин [1, 3, 31].
Миорелаксанты используют для снижения тонуса скелетной мускулатуры, в том числе для полного обездвиживания. Аммониевые стероиды (векуроний, панкуроний и рокуроний) относятся к недеполяризи-рующим релаксантам. В основе структуры миорелак-сантов находится стероидное ядро. Опубликованы
сведения о влиянии на фй некоторых стероидов. Так, показано [32], что введение в мембранообразую-щий раствор димиристоилфосфохолина холестерина, 6-кетохолестанола или копрастанола приводит к увеличению дипольного потенциала мембраны. Экстракция из липидного бислоя 5a-андростан-3ß-ола приводит к увеличению мембранной проводимости, индуцированной К+-нонактином [20]. Этот результат указывает на то, что 5а-андростан-3ß-ол увеличивает дипольный потенциал бислоя. Установлено [33], что стероидный гормон прегнено-лон уменьшает величину дипольного потенциала ли-посом, сформированных из смеси дипальмитоилфос-фатидилхолина и холестерина.
Тиреоидные гормоны, тироксин и трииодтиронин, играют ключевую роль в регуляции метаболизма. Они представляют собой иодированные производные тирозина и отличаются друг от друга числом атомов йода и их локализацией. Показано также, что йодсо-держащие гормоны щитовидной железы, как и фла-воноид флоретин, уменьшают дипольный потенциал холестеринсодержащих липидных бислоев [27].
Ксантеновые красители представлены двумя группами: флуоресцеины и родамины. Первую группу образуют сам флуоресцеин и его галогенопро-изводные (эритрозин, эозин, бенгальский розовый и флоксин В). Ксантеновые красители группы родамина представляют вторую группу, они являются производными флуоресцеина, в которых обе гидрок-сильные группы заменены алкилированными аминогруппами. Показано, что адсорбция бенгальского розового на поверхности дифитаноилфосфатидил-холиновой мембраны приводит, как и действие фло-ретина, к уменьшению ее дипольного потенциала [29].
Стирилпиридиновые красители серии ANEPPS и RH относятся к потенциал-чувствительным флуо-рохромам на основе стирилгемицианинов. Они различаются длиной углеводородных хвостов и(или) поли-енового фрагмента. Эти флуоресцентные красители имеют высокий дипольный момент, образованный делокализованным положительным зарядом в пиридиновом комплексе и отрицательным зарядом суль-фогруппы на другом конце молекулы. RH-красители увеличивают фй фосфохолиновых мембран, и эта способность падает в ряду RH 421, RH 237 и RH 160 [28].
Цель представленной работы состояла в установлении и количественном определении влияния некоторых флавоноидов, миорелаксантов, тиреоидных гормонов и флуоресцентных красителей на диполь-ный потенциал липидных бислоев различного состава. Особое внимание уделено взаимосвязи между химической структурой модификаторов и выраженностью дипольмодифицирующих свойств соедине-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
В работе использовали следующие реактивы: KCl, HEPES, пентан, этанол, хлороформ, диметилсуль-фоксид (ДМСО), гексадекан и сквален (Sigma, США); флоретин, флорицин, рутин, генистин, ге-нистеин, кверцетин, мирицетин, биоханин А, (±) гидрат катехина, (±) гидрат таксифолина, даидзеин, 2',4',6'-моногидрат тригидроксиацетофенона (ТГАФ), 2'-гидрокси-4',6'-диметооксиацетофенон (ДГАФ), RH 421, di-8-ANEPPS, L-тироксин, 3,3',5'-трииодо-Ь-тиронин, бенгальский розовый, флоксин В, эритрозин, эозин Y, флуоресцеин, родамин 6G, родамин 101, бромиды панкурония, векурония и рокурония (Sigma, США); RH 160 и RH 237 (Molecular Probes, США); 1,2-дифитаноил-эте-глицеро-3-фосфохолин (ДФФХ), 1,2-диолеил-эте-глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ), 1,2-диолеил-эте-глицеро-3-фосфосерин (ДОФС), 1,2-диолеил-эте-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ) (Avanti Polar Lipids, США). Химические структуры использованных модификаторов представлены в табл. 1.
Измерение изменения величины дипольного потенциала липидных бислоев
Бислойные липидные мембраны формировали по методу Монтала и Мюллера [34] путем сведения конденсированных липидных монослоев на отверстии в тефлоной пленке, разделяющей экспериментальную камеру на два (цис- и транс-) отделения. Объем каждого отделения составлял 1.5 мл, толщина тефлоновой пленки - 10 мкм, диаметр отверстия -около 50 мкм. Перед началом процесса формирования мембраны отверстие в тефлоновой пленке обрабатывали гексадеканом. Монослои формировали на границе вода-воздух из раствора 1 или 2 мг/мл липида в пентане. Для образования монослоев использовали ДФФХ, ДОФХ, ДОФС и ДОФЭ, а также эквимолярную смесь ДОФС и ДОФЭ (ДОФС/ДОФЭ). Эксперименты проводили при одинаковом ионном составе водных растворов электролита в обоих отделениях камеры (0.1 M KCl), кислотность растворов (рН 7.4) поддерживали буферной смесью 5 мМ HEPES-KOH.
Ионофоры, нонактин или валиномицин из спиртового (7 мкг/мл) или метанолового (0.8 мг/мл) раствора соответственно добавляли к водной фазе обоих отделений камеры до конечной концентрации 10-7-10-5 М. Известно, что флоретин в фосфолипидных мембранах менее эффективен в отношении трансмембранного тока, индуцированного К+-валиномицином, чем К+-нонактином [1]. Аналогичные результаты получены в ходе предварительных экспериментов с други-
ми флавоноидами, а также миорелаксантами, ксан-теновыми красителями и тиреоидными гормонами. По этой причине изменения дипольного потенциала мембраны при введении указанных модификаторов измеряли с использованием нонактина. Установлено, что стирилпиридиновые красители в ДФФХ-бислоях менее эффективны в отношении трансмембранного тока, индуцированного К+-нонактином, чем K+-валиномицином, поэтому в экспериментах по измерению увеличения дипольного потенциала мембраны, вызванного адсорбцией этих красителей, применяли валиномицин.
Модификаторы вводили в оба отделения камеры из миллимолярных растворов в этаноле, ДМСО или воде до конечной концентрации в околомембранных растворах в диапазоне от 2.5 до 150 мкМ для флавоноидов, от 1 мкМ до 1 мМ для миорелак-сантов, от 0.25 до 10 мкМ для ксантеновых красителей, от 1 до 50 мкМ для тиреоидных гормонов щитовидной железы и от 1 до 10 мкМ для стирилпи-ридиновых красителей.
Конечная концентрация растворителя (этанол, метанол или ДМСО) в камере не превышала 0.1%. Указанные растворители в такой концентрации не нарушали целостности и стабильности липидных бислоев. В отсутствие ионофоров дипольные модификаторы в максимальных концентрациях также не влияли на проводимость модельных мембран.
Измерения и оцифровку трансмембранных токов проводили в режиме фиксации потенциала с помощью Axopatch 200B и Digidata 1440A (Axon Instruments, США). Для подачи трансмембранного потенциала (V) и отведения сигнала с мембраны использовали хлорсеребряные электроды (Ag/AgCl), соединенные с растворами камеры через мостики с 1.5% агарозой в растворе 2 М KCl. Измерения проводили при комнатной температуре.
Данные обрабатывали с использованием 8-по-лярного фильтра Бесселя (Model 9002, Frequency Devices) и частоты фильтрации 1 кГц. Записи трансмембранных токов обрабатывали с использованием программного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments, США). Статистический анализ данных проводили при помощи программы Origin 8.0 (OriginLab, США).
Проводимость мембраны (G) определяли как отношение равновесного тока, протекающего через бислойную липидную мембрану (I), к трансмембранному потенциалу (V), равному 50 мВ. Изменение дипольного потенциала (Афй) при введении модификаторов определяли с использованием статистики Больцмана:
где G0m и Gm - значения равновесной К+-проводи-мости бислоя, обусловленной ионофором, до и после введения модификатора; е - заряд электрона; к - постоянная Больцмана (1.38 х 10-23 Дж/К), Т - термодинамическая температура (Т = 294 К) [1].
Средние величины изменения дипольного потенциала мембран определяли как средние арифметические значения Аф в каждой из экспериментальных систем при измерении от трех до пяти бислоев (среднее ± SD).
Адсорбцию флавоноидов, миорелаксантов, тире-оидных гормонов и ксантеновых красителей на поверхности липидных бислоев описывали с использованием изотермы Ленгмюра:
Дф (С) =
Дф (~)С
(2)
С+К
где Афл (С) - изменение дипольного потенциала мембран при концентрации (С) модификатора в омывающем растворе, Афл - максимальное изменение дипольного потенциала мембран при С К - константа десорбции модификатора, характеризующая его сродство к липидной фазе [3, 26]. Величину Афл (го) определяли по графику зависимости Афл (С) как среднюю величину, соответствующую насыщению: неизменности дипольного потенциала мембран при дальнейшем увеличении концентрации модификатора. Величину К находили как тангенс угла наклона прямой, аппроксимирующей зависимость
АФЛ И
Афа (С) V •
Погрешность Афл определяли как максимальную экспериментальную погрешность при измерении Афл(С), а погрешность определения параметра К рассчитывали как погрешность частного
Афd к>,
Афл (C)'
В пределах измеряемых концентраций стирилпи-ридиновых красителей (до 10 мкМ) эффекта насыщения не наблюдается. Дальнейшее увеличение концентрации красителя приводит к разрушению липидного бислоя. По указанным причинам для описания адсорбции на бислое стирилпиридиновых красителей применяли выражение, являющееся результатом линеаризации уравнения (2) при малых концентрациях дипольного модификатора (С << К):
Афл (C) =ßC,
(3)
Аф, = — ln( <-) ,
e KGoJ,
(1) где ß =
И
K
(
коэффициент наклона прямой зависимости увеличения дипольного потенциала бислоев от концентрации красителя в омывающем растворе [28].
Для сравнения эффективности дипольмодифици-рующего действия различных модификаторов использовали относительную величину изменения ди-польного потенциала (у), которую рассчитывали как:
Дф (то) у = ГА ) .100%,
ф.
' а. пт
(4)
где фй пт - величина дипольного потенциала немо-дифицированной мембраны, определяемая по литературным данным. В отсутствие дипольных модификаторов дипольный потенциал ДФФХ-, ДОФХ-, ДОФС- и ДОФЭ-мембран считали равным 250 ± 40 [5, 35, 36], 225 ± 20 [5], 240 ± 20 мВ [37, 38] и 220 ± 5 мВ [5, 35, 36] соответственно. Для ДОФС/ДОФЭ-бислоев фл пш рассчитывали как среднее величин ф пт ДОФС-и ДОФЭ-мембран. Погрешность определения у рассчитывали как погрешность частного
Аф. (<»)
Фа
< а _ пт
В случае стирилпиридиновых красителей величину у определяли как отношение изменения дипольного потенциала бислоя при 5 мкМ концентрации модификатора к фа пт. Считали, что агенты, обладающие «слабыми» дипольмодифицирующими свойствами, характеризуются величиной у в диапазоне от 0 до 10%, «средними» - от 10 до 30%, «сильными» -от 30 до 60%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Флавоноиды
Известно, что адсорбция флоретина на мембране в первом приближении может быть описана изотермой адсорбции Ленгмюра (1) с характеристическими параметрами: максимальное изменение дипольного потенциала при насыщении (Афл(™)) и константа десорбции флавоноида (К) [3, 39]. В табл. 1 представлены величины у (4), характеризующие относительные изменения дипольного потенциала мембраны при введении различных модификаторов. Как видно из табл. 1, все флавоноиды уменьшают дипольный потенциал мембраны. По выраженности дипольмо-дифицирующих свойств проверяемые агенты можно условно разделить на три группы. К первой группе относятся модификаторы «малой» эффективности с величиной у в диапазоне от 0 до 10%. Это изофлаво-ны даидзеин и генистин, флаванол катехин, флава-нонол таксифолин и синтетический флорглюцинол ТГАФ. Во вторую группу входят соединения, обладающие более выраженными дипольмодифицирую-
щими свойствами, так называемой «средней» эффективности (у от 10 до 30%): флавонол рутин, изофлавон генистеин и флорглюцинол ДГАФ. К третьей группе относятся самые «сильные» среди флавоноидов ди-польные модификаторы, у которых величина у варьирует от 30 до 60%. Это халконы флоретин и фло-рицин, флавонолы кверцетин и мирицетин, а также изофлавон биоханин А.
Сравнивая химические структуры флавоноидов, приведенные в табл. 1, можно сделать заключение, что дипольмодифицирующие свойства модификатора связаны с наличием двойной связи в С-кольце молекулы флавоноида. В С-кольцах таксифолина или катехина отсутствует двойная связь, представленная у кверцетина, это приводит к тому, что фла-ванол и флаванонол, имеющие изогнутую форму, практически не влияют на величину фЛ, в то время как адсорбция плоского флавонола на мембране вызывает значительное падение ее дипольного потенциала. Анализируя табл. 1, также можно заметить, что, как правило, величина у тем больше, чем меньше число гидроксильных групп в молекуле флавоноида. Так, уменьшение фЛ при адсорбции флорицина, гликозида флоретина, меньше, чем в случае более гидрофобного агликона флоретина. Аналогичная ситуация наблюдается и для ряда флавонолов (кверцетин/мирицетин и рутин), изофлавонов (биоханин А, генистеин и гени-стин) и флорглюцинолов (ДГАФ и ТГАФ). В отличие от биоханина А, изофлавон даидзеин, несмотря на малое число гидроксильных групп, практически не влияет на величину дипольного потенциала ДФФХ-мембран. Поскольку константа десорбции даидзеина выше, чем биоханина А, можно предположить меньшее сродство первого к липидной фазе по сравнению со вторым. Еще одной возможной причиной наблюдаемых различий может быть разная ориентация да-идзеина и биоханина А в мембране, обусловленная тем, что в молекуле даидзеина две гидроксильные группы расположены на противоположных концах молекулы, а в биоханине А - на одном. Следует также отметить, что константы десорбции гликозидов (фло-рицина, рутина и генистина) превышают этот параметр для соответствующих им агликонов (флоретина, кверцетина и генистеина). По всей вероятности, этот факт, как и меньшие изменения фЛ в присутствии гли-козидов по сравнению с агликонами, обусловлен большей гидрофильностью гликозидов, а следовательно, их меньшим сродством к липидной фазе. Среди проверенных флавоноидов наибольшими константами десорбции обладают флорглюцинолы, ТГАФ и ДГАФ. Последнее наблюдение хорошо согласуется с результатами [40], которые показали, что коэффициент распределения ТГАФ между лецитином и водой в 8 раз меньше, чем у флоретина.
В табл. 2 представлены характеристические параметры изотермы адсорбции на липидных бисло-ях различного состава самого «сильного» из фла-воноидов модификатора - флоретина. Как видно из табл. 2, способность флоретина уменьшать ф зависит от вида мембранообразующего липида. ДОФЭ в результате ненасыщенности и ДФФХ благодаря разветвленности углеводородных цепей имеют тенденцию к образованию неламеллярных структур, поэтому в образованных ими бислоях возникает эластическое напряжение вследствие деформации монослоев, характеризующихся отрицательной спонтанной кривизной. Это напряжение может быть обнаружено при исследовании профиля латерального давления в бислое [41, 42]. ДОФХ формирует ламеллярные структуры, и включающие его монослои спонтанной кривизны практически не имеют. Максимальное уменьшение дипольного потенциала при адсорбции флоретина практически одинаково для ДОФХ-, ДОФЭ- и ДФФХ-мембран (табл. 1 и 2). Эти результаты указывают на то, что плоскость адсорбции модификатора в мембране не совпадает с областью скачка латерального давления в ДОФЭ-и ДФФХ-бислоях. При этом флоретин приблизительно в 1.5 раза менее эффективен в отношении бислоев, включающих отрицательно заряженный фосфолипид ДОФС (ДОФС или ДОФС/ДОФЭ) по сравнению с мембранами, сформированными из незаряженных фосфолипидов (ДФФХ, ДОФХ или ДОФЭ). Аналогичный результат получен [43] при изучении адсорбции флоретина на нейтральных и отрицательно заряженных монослоях из ди-миристоилфосфатидилхолина и димиристоил-фосфатидилглицерина соответственно. Учитывая, что за уменьшение дипольного потенциала ответственна незаряженная форма флоретина [1], наблюдаемые различия не могут определяться снижением сорбции заряженной формы модификатора на ДОФС-содержащих мембранах. Об этом свидетельствует и близость значений констант десорбции флоретина для незаряженных ДФФХ, ДОФХ и ДОФЭ и заряженных ДОФС-мембран (табл. 1 и 2). Это позволяет утверждать, что коэффициент распределения модификатора практически не зависит от фосфолипидного состава мембраны. Подобный эффект может быть следствием положительной спонтанной кривизны монослоев из ДОФС, возникающей из-за «расталкивания» одноименно заряженных липидных голов. В результате, сорбирующиеся в этой области молекулы флоретина могут приобретать ориентацию, отличную от незаряженных мембран, и/или иметь большее число возможных конформаций.
Миорелаксанты
Как видно из табл. 1, добавка бромидов панкуро-ния, векурония и рокурония в растворы, омывающие ДФФХ-мембраны, практически не влияет на их ди-польный потенциал (величина у составляет не более 2%). Можно заключить, что все исследуемые миоре-лаксанты обладают слабыми дипольмодифицирую-щими свойствами. Учитывая, что имеющий только одну гидроксильную группу насыщенный стероид 5a-андростан-3ß-ол увеличивает дипольный потенциал липидных бислоев [20], можно предположить, что отсутствие влияния стероидных миорелаксантов на q>d связано с модификациями, увеличивающими ги-дрофильность стероидной молекулы (присоединение ацетатных групп и азотсодержащих гетероциклов). Высокая гидрофильность и наличие функциональных групп на разных концах молекул панкурония, векурония и рокурония позволяют думать, что сорбированные на поверхности мембраны миорелаксан-ты практически не погружаются в бислой. О малой глубине погружения косвенно свидетельствует и отсутствие влияния бромида панкурония на дипольный потенциал ДОФХ-мембран (величина у равна 3 ± 1), которые, в отличие от ДФФХ-бислоев, не испытывают скачка латерального давления в углеводородной области. При этом малые величины констант десорбции миорелаксантов (табл. 1) указывают на высокий коэффициент распределения этих соединений между бислоем и водным раствором.
Поверхностный заряд мембраны существенным образом сказывается на адсорбции стероидных мио-релаксантов. Бромиды панкурония и векурония увеличивают дипольный потенциал отрицательно заряженных ДОФС/ДОФЭ-мембран (величина у равна 17 ± 3%), при этом более гидрофобный бромид рокурония на величину q>d ДОФС/ДОФЭ-бислоев практически не влияет (величина у около 1%). Зависимость эффектов от заряда мембранообразующих липидов позволяет предположить, что за изменение диполь-ного потенциала при введении панкурония и векуро-ния ответственны положительно заряженные формы модификаторов. Однако в ДОФС/ДОФЭ-бислоях константа десорбции этих миорелаксантов на два порядка больше, а следовательно, сродство меньше, чем в ДФФХ-мембранах, что свидетельствует об обратном. По всей вероятности, как и в случае флоретина, наблюдаемые различия обусловлены не электростатическим взаимодействием между модификаторами и ДОФС-содержащей мембраной, а положительной спонтанной кривизной монослоя. На этом основании можно думать, что в ДОФС/ ДОФЭ-бислоях панкуроний и векуроний локализуются вблизи расталкивающихся отрицательно заряженных сериновых голов.
Таблица 1. Относительные изменения величины дипольного потенциала ДФФХ мембран в присутствии различных модификаторов (у) и их константы десорбции (К)
Класс
Дипольный модификатор
Химическая структура
y, %
K, мкМ
Флавоноиды
Флоретин
Флорицин
Кверцетин
Мирицетин
Рутин
Биоханин A
Даидзеин
Генистеин
Генистин
Катехин
Таксифолин
ТГАФ
ДГАФ
tyVI
он о
А4,
-59 ± 12
-37 ± 7
-42 ± 9
-44 ± 12
-17 ± 5
-37 ± 10
± 4
-28 ± 8
-2 ± 2
-1 ± 1
-3 ± 1
-6 ± 3
-20 ± 5
2.0 ± 0.5*
5.1 ± 0.2*
3.3 ± 0.5*
3.3 ± 0.2*
10.8 ± 0.5
2.1 ± 0.3*
8.8 ± 0.2
1.3 ± 0.2*
9.6 ± 0.5
0.7 ± 0.2
5.8 ± 0.6
26.4 ± 5.6*
10.2 ± 0.4
Миорелаксанты
Панкуроний
Векуроний
Рокуроний
2 ± 2
1 ± 1
2 ± 2
0.1 ± 0.1
0.1 ± 0.1
0.1 ± 0.1
Тиреоидные гормоны Тироксин хоЬл^. -24 ± 7 3.5 ± 0.1@
Трииодтиронин хоЬ^ -23 ± 7 5.3 ± 0.2@
Флуоресцеин -2 ± 1 0.4 ± 0.1@
Эозин Y -2 ± 1 0.4 ± 0.1@
Эритрозин -26 ± 7 0.8 ± 0.1@
Ксантеновые красители Бенгальский розовый -48 ± 11 0.2 ± 0.1@
Флоксин В -33 ± 7 0.2 ± 0.1@
Родамин 101 -9 ± 4 0.3 ± 0.1
Родамин 6G -4 ± 1 0.4 ± 0.1
ИН 160 сГ^^осс 15 ± 6 -
Стирилпиридиновые ИН 237 19 ± 4 -
красители ИН 421 47 ± 9 -
di-8-ANEPPS 1 ± 1 -
@ Результаты взяты из [44]. * Результаты взяты из [46].
Тиреоидные гормоны
Сравнение величин у тиреоидных гормонов показывает, что тироксин и трииодтиронин - это диполь-ные модификаторы «средней» эффективности, сходным образом увеличивающие дипольный потенциал ДФФХ-мембран. Аналогичные результаты были получены ранее [27]. Этот факт позволяет предположить, что присутствие в молекуле тироксина допол-
нительного (по сравнению с трииодтиронином) атома йода слабо влияет на дипольный момент модификатора и его ориентацию в бислое.
На рисунке А показаны зависимости величин уменьшения дипольного потенциала ДФФХ-, ДОФХ-, ДОФС-, ДОФЭ- и ДОФС/ДОФЭ-бислоев от концентрации тироксина в омывающих растворах. В табл. 2 представлены величины у, характеризую-
л
0 -25-50-75-100-125-
Аф , мВ
С, мкМ
Аф мВ
125 100 75 50 25 0
С, мкМ
Зависимость величины изменения дипольного потенциала мембран (Дф^) от концентрации тироксина (А) и RH 421 (Б) в омывающем растворе. Мембраны сформированы из ДффХ*@ (■), ДОФХ (•), ДОФС (♦), ДОФЭ (Д) и ДОФС/ДОФЭ (50/50 мол. %) (о) и омываются 0.1 М раствором KCI при рН 7.4. V = 50 мВ. @ Результаты взяты из [44]. 'Результаты взяты из [46]
Б
3
6
9
Таблица 2. Относительные изменения величины дипольного потенциала фосфолипидных бислоев в присутствии различных модификаторов (y) и их константы десорбции (К)
Дипольный модификатор Параметр ДОФХ ДОФЭ ДОФС ДОФС/ДОФЭ (50/50 мол. %)
Флоретин y, % -62 ± 9 -58 ± 5 -38 ± 6 -41 ± 8
K, мкМ 0.7 ± 0.2* 2.2 ± 0.4* 2.7 ± 0.8* 2.8 ± 0.2
Тироксин y, % -18 ± 5 -25 ± 4 -16 ± 5 -22 ± 6
K, мкМ 3.8 ± 0.3 5.9 ± 0.5 2.8 ± 0.3 3.4 ± 0.2
RH 421 y, % 27 ± 5 25 ± 2 5 ± 2 25 ± 9
* Результаты взяты из [46].
щие относительные изменения дипольного потенциала мембраны при адсорбции тироксина на липидных бислоях различного состава. Из рисунка А и табл. 2 видно, что эффективность тироксина мало зависит от заряда мембранообразующих липидов. Сходные результаты получены при сравнении ДФФХ- и ди-фитаноилфосфосериновых бислоев [44]. Отсутствие зависимости эффектов модификатора (как величин у, так и значений К) от поверхностного заряда мембраны указывает на то, что уменьшение ди-польного потенциала мембран обусловлено сорбцией незаряженной формы йодсодержащих гормонов щитовидной железы. В пользу этого свидетельствуют и данные [27]. Близость значений y для ДФФХ-, ДОФХ-, ДОФЭ- и ДОФС-мембран дает основание утверждать, что спонтанная кривизна монослоев не сказывается на сорбции тироксина. Можно предположить, что плоскость адсорбции модификатора
располагается между областями, соответствующими скачку латерального давления в ДОФЭ- и ДФФХ-мембранах и локализации заряженных остатков се-рина в ДОФС-бислоях.
Ксантеновые красители
Из табл. 1 видно, что рассмотренные в работе ксан-теновые красители уменьшают дипольный потенциал ДФФХ-мембран. Оценка эффективности диполь-модифицирующего действия красителей позволяет отнести бенгальский розовый и флоксин В к наиболее эффективным модификаторам; эритрозин - к соединениям со «средней» эффективностью; а флуоресце-ин, эозин Y, родамин 6G и родамин 101 - с «малой» эффективностью.
Сравнивая представленные в табл. 1 структуры, можно заключить, что основными факторами, определяющими величину уменьшения дипольного
потенциала мембран при введении этих модификаторов, являются тип и локализация галогеновых заместителей в молекуле красителя. Можно думать, что выраженное уменьшение величины дипольного потенциала мембран при введении эритрозина обусловлено наличием в его молекуле атомов йода. Отсутствие последних во флуоресцеине или замена йода на бром в эозине У приводит к потере дипольмо-дифицирующих свойств этих соединений. Сходным образом замена йода на бром во флоксине В снижает эффективность модификатора по сравнению с эффективностью бенгальского розового. В этом случае выраженность дипольмодифицирующих свойств флоксина В следует отнести к присутствию в его структуре хлора. Присутствие как атомов йода, так и атомов хлора в молекуле бенгальского розового делает его самым эффективным дипольным модификатором среди изученных ксантеновых красителей. Замена гидроксильной группы в молекуле флу-оресцеина на аминогруппу в молекулах родаминов не влияет на способность модификаторов изменять величину дипольного потенциала бислоев.
Ранее мы показали, что за уменьшение дипольного потенциала мембраны ответственна анионная форма ксантенового красителя [44].
Сравнивая величины K можно отметить, что ксан-теновые красители характеризуются на порядок большим сродством к фосфолипидным мембранам, чем флавоноиды и тиреоидные гормоны (табл. 1).
Стирилпиридиновые красители
Согласно [28] величина увеличения дипольного потенциала ДФФХ-мембран прямо пропорциональна концентрации стирилпиридиновых красителей в омывающих растворах в диапазоне от 0 до 15 мкМ. В табл. 1 представлены величины y, характеризующие относительные изменения дипольного потенциала мембраны при введении 5 мкМ красителя. Эти результаты позволяют построить ряд эффективности стирилпиридиновых красителей: di-8-ANEPPS не обладает дипольмодифицирующим действием, RH 160 и RH 237 характеризуются «средней», а RH 421 - наибольшей эффективностью в отношении ди-польного потенциала ДФФХ-мембран. Полученные результаты согласуются с данными для красителей серии RH [28].
Способность увеличивать фй зависит от ориентации и глубины погружения красителя в мембрану. Согласно [45] глубина погружения в ДФФХ-бислой возрастает в ряду RH 160 < RH 421 < RH 237. Минимальное среди тестируемых красителей погружение RH 160 в мембрану, по всей вероятности, обусловлено его наименьшей гидрофобностью. Наибольшая эффективность RH 421 в отношении
ДФФХ-мембран при промежуточной плоскости его адсорбции может быть связана с наиболее близкой ориентацией к нормали этого красителя в мембране [45]. ИН 421 и di-8-ANEPPS должны характеризоваться близким по величине дипольным моментом, поскольку имеют пиридиновые комплексы одинаковой длины. По этой причине отсутствие влияния di-8-ANEPPS на величину дипольного потенциала ДФФХ-мембран можно связать не со структурными различиями в пиридиновом комплексе, а с большей длиной углеводородных «хвостов» по сравнению с ИН 421, которые определяют погружение и ориентацию красителя в бислое.
На рисунке Б представлены зависимости величин увеличения дипольного потенциала ДФФХ-, ДОФХ-, ДОФЭ-, ДОФС- и ДОФС/ДОФЭ-бислоев от концентрации ИН 421 в омывающих растворах. В табл. 2 показаны величины 7, характеризующие относительное увеличение дипольного потенциала мембраны при введении 5 мкМ ИН 421 в околомембранные растворы. Зависимость дипольмодифицирующе-го действия ИН 421 от вида мембранообразующего липида (ДФФХ, ДОФХ и ДОФС) может указывать на влияние профиля латерального давления на ориентацию красителя в бислое. Кроме того, ИН 421 мало эффективен в отношении отрицательно заряженных мембран из ДОФС. Это может быть результатом расталкивания одноименно заряженных сульфонат-ных групп модификатора и сериновых фрагментов. По всей вероятности, это способствует увеличению положительной спонтанной кривизны монослоя при адсорбции ИН 421 и изменению ориентации ди-польного момента красителя по сравнению с ДФФХ-, ДОФХ-, ДОФЭ- и ДОФС/ДОФЭ-мембранами. К подобному заключению пришли и при изучении кана-лообразующей активности антимикробных пептидов в присутствии ИН 421 [15].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Количественно охарактеризовано дипольмодифи-цирующее действие некоторых флавоноидов, стероидных миорелаксантов, тиреоидных гормонов, ксантеновых и стирилпиридиновых красителей в отношении фосфолипидных бислоев различного состава. Выявлены структурные особенности модификаторов, ответственные за их способность изменять величину дипольного потенциала мембран. Как правило, более гидрофобные соединения обладают более выраженными дипольмодифицирую-щими свойствами. В случае флавоноидов значение также имеют конформация молекулы и локализация гидроксильных групп, а для ксантеновых красителей - тип и локализация галогеновых заместителей. Варьирование фосфолипидного состава мембран по-
зволило предсказать плоскость адсорбции наиболее эффективных соединений в каждой группе модификаторов. Изменение профиля латерального давления в бислое влияет на адсорбцию флоретина, бромидов панкурония и векурония, а также ИН 421. •
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (№ 14-14-00565), РФФИ (№ 15-34-20356), программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», СП-69.2015.4 и НШ-1721.2014.4.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Andersen O.S., Finkelstein A., Katz I., Cass A. // J. Gen. Physiol. 1976. V. 67. P. 749-771.
2. Franklin J.C., Cafiso D.S. // Biophys. J. 1993. V. 65. P. 289-299.
3. Cseh R., Hetzer M., Wolf K., Kraus J., Bringmann G., Benz R. // Eur. Biophys. J. 2000. V. 29. P. 172-183.
4. Wang L. // Annu. Rev. Biochim. 2012. V. 81. P. 615-635.
5. Pickar A.D., Benz R. // J. Membr. Biol. 1978. V. 44. P. 353-376.
6. Clarke R.J. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1327. P. 269-278.
7. Starke-Peterkovic T., Clarke R.J. // Eur. Biophys. J. 2009. V. 39. P. 103-110.
8. Sun X., Garlid K.D. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 1914719154.
9. Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Antonenko Y.N. // Biophys. J.
2002. V. 82. P. 865-873.
10. Hwang T.C., Koeppe R.E., Andersen O.S. // Biochemistry.
2003. V. 42. P. 13646-13658.
11. Luchian T., Mereuta L. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 8452-8457.
12. Ostroumova O.S., Kaulin Y.A., Gurnev A.P., Schagina L.V. // Langmuir. 2007. V. 23. P. 6889-6892.
13. Asandei A., Mereuta L., Luchian T. // Biophys. Chem. 2008. V. 135. P. 32-40.
14. Mereuta L., Luchian T., Park Y., Hahm K.S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. V. 373. P. 467-472.
15. Apetrei A., Mereuta L., Luchian T. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1790. P. 809-816.
16. Ostroumova O.S., Malev V.V., Ilin M.G., Schagina L.V. // Langmuir. 2010. V. 26. P. 15092-15097.
17. Lundbaek J.A., Koeppe R.E., Andersen O.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. P. 15427-15430.
18. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Schagina L.V. // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1808. P. 2051-2058.
19. Mereuta L., Asandei A., Luchian T. // PLoS One. 2011. V. 6. P. e25276.
20. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Schagina L.V. // PLoS One. 2012a. V. 7. P. e30261.
21. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Chulkov E.G., Schagina L.V. // PLoS One. 2012b. V. 7. P. e45135.
22. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Mikhailova E.V., Schagina L.V. // Eur. Biophys. J. 2014. V. 43. P. 207-215.
23. Efimova S.S., Schagina L.V., Ostroumova O.S. // Langmuir. 2014. V. 30. P. 7884-7892.
24. Chulkov E.G., Schagina L.V., Ostroumova O.S. // Biochim. Biophys. Acta. 2015. V. 1848. P. 192-199.
25. Ефимова С.С., Захаров В.В., Остроумова О.С. // Цитология. 2015. Т. 57. С. 144-152.
26. Reyes J., Greco F., Motais R., Latorre R. // J. Membr. Biol. 1983. V. 72. P. 93-103.
27. Цыбульская М.В., Антоненко Ю.Н., Тропша А.Е., Ягужин-ский Л.С. // Биофизика. 1984. Т. 29. С. 801-805.
28. Malkov D.Y., Sokolov V.S. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1278. P. 197-204.
29. Kotova E.A., Rokitskaya T.I., Antonenko Yu.N. // Membr. Cell Biol. 2000. V. 13. P. 411-420.
30. Isse B.A., Yunes Quartino P., Fidelio G.D., Farias R.N. // Chem. Phys. Lipids. 2013. V. 175-176. P. 131-137.
31. Tarahovsky Y.S., Muzafarov E.N., Kim Y.A. // Mol. Cell Biochem. 2008. V. 314. P. 65-71.
32. Starke-Peterkovic T., Turner N., Vitha M.F., Waller M.P., Hibbs D.E., Clarke R.J. // Biophys. J. 2006. V. 90. P. 4060-4070.
33. Alakoskela J.M., Söderlund T., Holopainen J.M., Kinnunen P.K. // Mol. Pharmacol. 2004. V. 66. P. 161-168.
34. Montal M., Muller P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 65. P. 3561-3566.
35. Cseh R., Benz R. // Biophys. J. 1998. V. 74. P. 1399-1408.
36. Peterson U., Mannock D.A., Lewis R.N., Pohl P., McElhaney R.N., Pohl E.E. // Chem. Phys. Lipids. 2002. V. 117. P. 19-27.
37. Flewelling R.F., Hubbell W.L. // Biophys. J. 1986a. V. 49. P. 531-540.
38. Flewelling R.F., Hubbell W.L. // Biophys. J. 1986b. V. 49. P. 541-552.
39. de Levie R., Rangarajan S.K., Seelig P.F., Andersen O.S. // Biophys. J. 1979. V. 25. P. 295-300.
40. Awiszus R., Stark G. // Eur. Biophys. J. 1998. V. 15. P. 299-310.
41. Cantor R.S. // Biophys. J. 1999. V. 76. P. 2625-2639.
42. Bezrukov S.M. // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2000. V. 5. P. 237-243.
43. Lairion F., Disalvo E.A. // Langmuir. 2004. V. 20. P. 9151-9155.
44. Efimova S.S., Schagina L.V., Ostroumova O.S. // J. Membr. Biol. 2014b. V. 247. P. 739-745.
45. Passechnik V.I., Sokolov V.S. // Bioelectrochemistry. 2002. V. 55. P. 47-51.
46. Efimova S.S., Ostroumova O.S. // Langmuir. 2012. V. 28. P. 9908-9914.
