CC BY
38
УДК 577.352
Дипольные модификаторы -регуляторы латеральной гетерогенности липидных мембран
С. С. Ефимова, О. С. Остроумова*
Институт цитологии РАН, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий просп., 4 *E-mail: osostroumova@mail.ru Поступила в редакцию 19.10.2017 Принята к печати 02.03.2017
РЕФЕРАТ C использованием флуоресцентной конфокальной микроскопии гигантских одноламеллярных липосом, изготовленных из тройных смесей, содержащих холестерин (Хол), фосфолипиды с низкой (ДОФХ, ПОФХ или ДПОФХ) и липиды с высокой (сфингомиелин (СМ) или тетрамиристоилкардиолипин (ТМКЛ)) температурой плавления ацильных цепей, изучены паттерны фазового разделения везикул в мембранах до и после введения в суспензию биологически активных низкомолекулярных соединений амфифильной природы, называемых дипольными модификаторами. Показано, что независимо от вида тугоплавкого липида в ряду ПОФХ, ДОФХ и ДПОФХ содержание липосом, демонстрирующих фазовое разделение, уменьшается. При замене в составе везикул тугоплавкой компоненты, СМ на ТМКЛ, наблюдается усиление фазовой сегрегации липидов. Учитывая, что первый случай соответствует уменьшению толщины мембранных областей, обогащенных легкоплавкими фосфолипидами и находящихся в неупорядоченной жидкой фазе, а второй - снижению толщины упорядоченных липидных доменов, включающих различные тугоплавкие липиды, полученные результаты позволяют связывать сценарий доменной организации везикул с величиной несоответствия между толщиной углеводородного остова мембраны в упорядоченном и неупорядоченном состоянии. Дипольные модификаторы, флавоноиды и стирилпиридиновые красители, ослабляют фазовую сегрегацию мембран, включающих СМ, Хол, ПОФХ или ДОФХ. Остальные протестированные трехкомпонентные липидные системы к действию модификаторов практически не чувствительны. Выдвинуто предположение о связи наблюдаемых эффектов со способностью дипольных модификаторов влиять на величину несоответствия между толщиной мембраны в различном агрегатном состоянии за счет разжижения неупорядоченных и (или) упорядоченных липидных доменов при погружении в мембрану, глубина которого зависит от гидрофобности молекул модификаторов, формы липидов, образующих домены, и плотности их упаковки. Наибольший эффект среди проверенных модификаторов вызывает флоретин, RH 421 и RH 237.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА латеральная неоднородность мембран, липидные бислои, липидные домены, дипольные модификаторы, стирилпиридиновые красители, фазовое разделение, флавоноиды, халконы. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДОФХ - 1,2-диолеил-зте-глицеро-З-фосфохолин; ПОФХ - 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-З-фосфохолин; ДПОФХ - 1,2-дипальмитолеоил-эте-глицеро-3-фосфохолин; СМ - сфингомиелин из мозга свиней; ТМКЛ - 1,1',2,2'-тетрамиристоилкардиолипин; Хол - холестерин.
ВВЕДЕНИЕ
Липидный бислой мембраны может иметь доменную структуру в результате сосуществования не-смешиваемых липидных фаз, находящихся в различных агрегатных состояниях. Однокомпонентные липидные бислои при температуре ниже температуры плавления липида (Т ) пребывают в твердокри-сталлическом состоянии. В зависимости от наклона липидных молекул и способа упаковки углеводородных хвостов в твердом бислое выделяют несколько типов фаз: кристаллическую, гель-фазу и промежуточную риппл-фазу, характерную для некоторых
липидов, в частности, насыщенных фосфохолинов [1]. При температуре выше температуры основного фазового перехода липиды в бислое находятся в жидкоподобном состоянии. Фазовое поведение смеси липидов с различной температурой плавления существенно усложняется и в определенном температурном диапазоне (между температурами плавления индивидуальных липидов) в бислое может наблюдаться фазовое разделение: сосуществование твердой (so) и жидкой фаз (1Л), обогащенных липи-дом с высокой и низкой температурой плавления соответственно. Добавление к таким смесям некото-
рых стеринов, в частности холестерина, усиливает их фазовую сегрегацию: возникает промежуточная жидкая упорядоченная фаза (I ). Установлено, что коэффициент латеральной диффузии липи-дов в 1о-фазе в 2-3 раза меньше по сравнению с I-областями [2]. Считается, что биологическим мембранам также свойственна латеральная сегрегация компонентов. Хотя гель-домены не относятся к уникальным свойствам модельных мембран (они обнаружены и в плазматических мембранах живых клеток [3]), принято думать, что фазовое разделение в биологических мембранах представлено в основном двумя жидкими фазами (I + 1о) [4]. Поскольку в этом случае латеральной сегрегации подвержены не только мембранные липиды, но и белки, значительное распространение приобрела модель, согласно которой в биологических мембранах возникают белок-липидные нанодомены (рафты). Эти области обогащены тугоплавкими липидами и стеринами и находятся в I -состоянии. Интерес к рафтам вызван их предполагаемым участием в таких жизненно важных процессах, как сортировка и доставка белков, клеточная сигнализация, иммунный ответ и др. [5-16]. Однако даже само существование рафтов в клеточных мембранах до сих пор остается дискуссионным. Считается, что сложности с обнаружением рафтов в клеточных мембранах связаны с тем, что их размер может варьировать от единиц до сотен нанометров, и они чрезвычайно динамичны. В ли-пидных же бислоях упорядоченные домены могут достигать значительно больших размеров, что делает возможным их визуализацию методами флуоресцентной микроскопии. Для этого используют гигантские одноламеллярные липосомы [17]. Фазовое разделение в липосомах можно наблюдать, если ввести в мембрану флуоресцентно меченные липиды. Большинство подобных меток предпочитают неупорядоченную жидкокристаллическую фазу, поэтому упорядоченные домены остаются неокрашенными.
Низкомолекулярные соединения амфифильной природы, называемые дипольными модификаторами, в частности некоторые флавоноиды, способны влиять на баланс между фазами. Согласно работе [18], введение в суспензию липосом из бинарных смесей (ДОФХ : СМ (80 : 20 мол. %), ДОФХ : ДМФХ (50 : 50 мол. %) или ДОФХ : ДПФХ (50 : 50 мол. %)) флаво-ноидов, флоретина или биоханина А сопровождается уменьшением относительного числа липидных везикул, имеющих гель-домены. Сходное действие в отношении трехкомпонентных бислоев из ПОФХ, Хол и СМ оказывают флоретин, его гликозид флорицин, кверцетин и мирицетин, а также стирилпиридино-вые красители серии RH [19]. Способность указанных дипольных модификаторов влиять на доменную
структуру ПОФХ-мембран, включающих различные стерины и сфинголипиды, была проанализирована в [18], в то время как зависимость наблюдаемых эффектов от вида фосфолипида, образующего неупорядоченную жидкую фазу, не изучена. Цель данной работы состояла в изучении влияния легкоплавкой компоненты на сценарий фазового разделения в ли-посомах, содержащих Хол и СМ, до и после введения флавоноидов или стирилпиридиновых красителей. Использование различных фосфолипидов, ПОФХ, ДОФХ и ДПОФХ, позволило последовательно изменять толщину обогащенных ими неупорядоченных липидных областей мембраны, находящихся в жидком состоянии. Для варьирования толщины упорядоченных липидных доменов помимо везикул, включающих СМ, были протестированы липидные смеси, содержащие ТМКЛ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
В работе использовали следующие реактивы: сор-битол, флоретин, флорицин, кверцетин, мири-цетин и RH 421 (Sigma, США); RH 237 (Molecular Probes, США); 1-пальмитоил-2-олеоил-зп-глицеро-3-фосфохолин (ПОФХ), 1,2-диолеоил-зте-глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ), 1,2-дипальми-толеоил^п-глицеро-3-фосфохолин (ДПОФХ), 1,1',2,2'-тетрамиристоилкардиолипин (ТМКЛ), сфингомиелин из мозга свиней (СМ), холестерин (Хол) и 1,2-дипальмитоил^п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-^(лиззамин родамин) (ЛР-ДПФЭ) (Avanti Polar Lipids, США). В таблице представлены некоторые характеристики липидов.
Конфокальная микроскопия гигантских моноламеллярных липосом
Гигантские моноламеллярные липосомы изготавливали методом электроформации c помощью Nanion vesicle prep pro (Германия) на покрытых смесью оксидов индия и титана стеклах (90% оксида индия и 10% оксида титана, размер 29 х 68 х 0.9 мм) с поверхностным удельным сопротивлением 2030 Ом/см2 (стандартный протокол, напряжение 3 В, частота 10 Гц, 1 ч, 25°C). Латеральное фазовое разделение визуализировали путем введения флуоресцентного зонда ЛР-ДПФЭ в исходный липидный раствор тройных смесей из 40 мол. % фосфолипида с низкой температурой плавления (ДОФХ, ПОФХ или ДПОФХ), 40 мол. % липида с высокой температурой плавления (СМ или ТМКЛ) и 20 мол. % Хол в хлороформе (2 мМ). Концентрация ЛР-ДПФЭ в образце составляла 1 мол. %. Суспензию липосом разделяли на аликвоты. В качестве контроля использова-
Основные характеристики изучаемых липидов
Липид Химическая с труктура С n:m T , оС m7
ДПОФХ 16 : 1 -36
ДОФХ 18 : 1 -17
ПОФХ 16:0-18:1 -2
СМ 16:1-18:0 45
ТМКЛ 14 : 0 47
Примечание. Сп : т - число атомов углерода (п) и число двойных связей (т) в ацильных цепях; Тт - температура главного фазового перехода.
ли аликвоту без модификатора. Экспериментальные образцы содержали 400 мкМ флавоноида (флорети-на, флорицина, кверцетина или мирицетина) или 10 мкМ стирилпиридинового красителя (RH 421 или RH 237). Липосомы наблюдали через иммерсионный объектив 100.0 х /1.4 HCX PL в Leica TCS SP5 конфокальной лазерной системы Apo (Leica Microsystems, Германия). Наблюдение препаратов проводили при температуре 25°C. Свечение ЛР-ДПФЭ возбуждали светом с длиной волны 543 нм (гелий-неоновый лазер). Известно, что ЛР-ДПФЭ в бислое с фазовым разделением встраивается преимущественно в жидкую неупорядоченную фазу (ld) [20]. В то время как жидкая упорядоченная (l ) и твердая упорядоченная (гель, so) фазы остаются неокрашенными [21]. Упорядоченные домены дискриминировали по их морфологии: неокрашенные домены круглой формы считали пребывающими в l -состоянии, а неокрашенные области нерегулярной конфигурации относили к so-фазе. Образец характеризовали частотой встречаемости (р., %) гомогенных и гетерогенных везикул:
N
p =_l -100%, iN
(1)
где . - тип фазового разделения липосом (гомогенные 1й-везикулы или липосомы, включающие 1о или so-домены); N. - число везикул в образце с определенным фазовым сценарием (от 0 до 50), N - общее число липосом в образце (50 в каждой системе). Значения р. для каждой из систем получали путем усреднения величин, определенных в четырех независимых экспериментах. Результаты для каждой из тестируемых липидных систем представляли в виде круговой диаграммы. Погрешности определения доли липосом с определенным типом фазового разделения приведены на диаграммах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1А (верхняя панель) представлены круговые диаграммы, показывающие возможные паттерны фазовой сегрегации мембран липосом, сформированных с участием сфингомиелина (СМ; 40 мол. %), холестерина (Хол; 20 мол. %) и различных легкоплавких фосфолипидов (ПОФХ, ДОФХ или ДПОФХ; 40 мол. %). (Соответствующие температуры плавления фосфолипидов указаны в таблице.) Примеры микрофотографий липидных везикул с тем или иным
А
ПОФХ ДОФХ ДПОФХ
СМ * ; ° 25 ±10% 18 ±6 % 82 ± 8 % 18 ±8 %
ТМКЛ 85 ± 9 % 15 ± 6 % 87 ± 8 % в 13 ± 5 % 82 ± 7 % о* 18 ± 7 %
Рис. 1. Круговые диаграммы, показывающие вероятные сценарии фазового разделения в мембранах липосом из смесей сфингомиелина (СМ, 40 мол. %) или тетрамиристоилкардиолипина (ТМКЛ, 40 мол. %) с холестерином (20 мол. %) и различными фосфолипидами (ПОФХ, ДОФХ или ДПОФХ) (40 мол. %) (Л), и микрофотографии липосом различного состава, показывающих тот или иной тип фазового разделения в бислое (!в, /о, sо) (Б). Здесь и на рис. 3 и 4 на каждой диаграмме сектор, отвечающий процентному соотношению везикул с твердыми упорядоченными доменами ^о), окрашен в темно-серый цвет, с жидкими упорядоченными областями (/о) — в светло-серый цвет, сектор белого цвета характеризует относительное число гомогенно окрашенных флуоресцентным маркером липосом, пребывающих в жидком неупорядоченном состоянии (/^) без видимого фазового разделения. * — Данные взяты из [19]
видом фазового разделения мембран 1о, sо) представлены на рис. 1Б (верхняя панель). Сценарий фазового разделения в смеси СМ : Хол : ПОФХ изучен нами ранее [19]. Установлено, что 45 ± 13% СМ : Хол : ПОФХ-липосом содержат твердокристал-лические домены нерегулярной формы ^о). Жидкие упорядоченные домены круглой формы (1о) включают 30 ± 11% ПОФХ : СМ : Хол-везикул. Оставшаяся часть - это гомогенно окрашенные флуоресцентным маркером липосомы не показывающие микроскопического фазового разделения. Из рис. 1А (верхняя панель) можно заметить, что замена в мембра-нообразующей смеси ПОФХ на ДОФХ приводит
к падению доли везикул, включающих so-домены (19 ± 4%), и росту числа липосом, содержащих 1о-области (63 ± 10%). В случае ДПОФХ 82 ± 8% везикул гомогенно окрашены, отсутствует видимое фазовое разделение, а оставшаяся часть включает твердые домены. Таким образом, в ряду ПОФХ, ДОФХ, ДПОФХ видимая фазовая сегрегация уменьшается. В указанном ряду толщина углеводородного остова неупорядоченных областей включающих различные легкоплавкие фосфолипиды, снижается, а разница между толщиной гидрофобного региона мембраны в упорядоченном и неупорядоченном состоянии (Дб,) растет (рис. 2, левая часть) [22, 23].
СМ/ Хол/ ПОФХ
Ad
d,
d,
lo/so
Ad'
d',
Ad"
d
lo/so
d'
lo/so
СМ/ Хол/ ДОФХ(ДПОФХ)
ТМКЛ/ Хол/ ПОФХ
ld
Рис. 2. Схематическое изображение величины несоответствия (Дd) между толщиной углеводородного остова мембраны в упорядоченном ^1о/о) и неупорядоченном состоянии ^ и) в зависимости от липидного состава бислоя. Пунктирная линия отмечает центр бислоя, сплошная - границу между полярной и неполярной областями мембраны
В результате формирование границ между упорядоченными и неупорядоченными доменами, предполагающее экспонирование части гидрофобного региона водному раствору, становится чрезвычайно невыгодным, и число липосом, характеризующихся выраженной фазовой сегрегацией, падает. Сходный вывод можно сделать, анализируя результаты, представленные на нижней панели рис. 1, которая показывает результаты исследования фазового разделения в мембранах, включающих тетрамиристо-илкардиолипин (ТМКЛ; 40 мол. %), Хол (20 мол. %) и различные легкоплавкие фосфолипиды (40 мол. %). Можно заметить, что все ТМКЛ-содержащие липо-сомы независимо от вида легкоплавкого липида характеризуются фазовым разделением (отсутствуют гомогенно окрашенные маркером липосомы, включающие ТМКЛ). Различия между представленными липидными системами заключаются в процентном соотношении везикул, включающих I - и Э -домены. Как отмечено выше, среди протестированных фос-фолипидов ^-фазу с наименьшей толщиной образует ДПОФХ, что соответствует наибольшей величине Д^ а следовательно, наибольшей энергии формирования упорядоченных доменов. Поэтому липосомы, включающие этот фосфолипид, характеризуются
менее выраженной фазовой сегрегацией (82 ± 7% имеют 1о-домены) по сравнению с везикулами, содержащими ПОФХ и ДОФХ, которые формируют ^-фазы с большей толщиной и меньшим значением Д^ в результате чего наблюдается фазовое разделение большинства липосом (85 ± 9% и 87 ± 8% соответственно) по типу 1Л/яо.
Сравнение сценариев фазового поведения систем, включающих различные тугоплавкие липиды, также указывает на ключевую роль величины Дd в регуляции латеральной гетерогенности трехкомпонент-ных мембран. На рис. 1Б (нижняя панель) приведены микрофотографии ТМКЛ-содержащих липосом, включающих различные легкоплавкие фосфолипи-ды. На рис. 1А видно, что замена в мембранообра-зующей смеси СМ на ТМКЛ приводит к усилению фазовой сегрегации мембран. В случае ПОФХ- (левый столбец) и ДОФХ-содержащих бислоев (центральный столбец) увеличивается доля липосом с э -доменами, а в случае мембран, включающих ДПОФХ, статистически значимо растет число везикул с 1о-областями (правый столбец). Это обусловлено уменьшением толщины упорядоченной фазы при замене СМ на ТМКЛ, снижением разницы Дd (рис. 2, правая часть) и соответствующим падением
Л
Липидный состав везикул (40/20/40 мол. %) Дипольный модификатор
Флоретин Флорицин Кверцетин Мирицетин RH 421 RH 237
СМ/ Хол/ ПОФХ* 72 ± 11 % 28 ±12% 64 ± 12 % Ск.. 30 ± 10 % 67 ± 7 % 28 ± 8 % 4 5 ± 3 % 68 ±13% 26 ±14% 6 ± 3 % 64 ± 13 % 36 ± 12 % 61 ± 9 % 39 ± 9 %
СМ/ Хол/ ДОФХ 69 ± 12 % © 31 ±8% 45 ± 10 % 45 ±10% 30 ±14% и 25 ± 5 % 49 ±11 % 28 ± 5 % 23 ± 13 % 44 ± 8 % ^--------' 9 ± 3 % 47 ± 12 % 45 ± 13 % 47 ±10%" 8±4%
СМ/ Хол/ ДПОФХ 93 ± 6 % — 7±4% 96 ± 6 % ---4±4% 86 ± 10 % О» — 14 ± 6 % 89 ± 8 % о» — 11 ±5% 95 ± 5 % ( ^ - 5 ± 4 % 96 ± 4 % © 4 ± 4 %
Б
Рис. 3. Круговые диаграммы, показывающие вероятные сценарии фазового разделения в мембранах липосом из смеси сфингомиелина (СМ, 40 мол. %) с холестерином (Хол, 20 мол. %) и различными фосфолипидами (ПОФХ, ДОФХ или ДПОФХ) (40 мол. %) в присутствии дипольных модификаторов (400 мкМ флавоноидов, фло-ретина, флорицина, кверцетина и мирицетина или 10 мкМ стирилпиридиновых красителей, RH 421 и RH 237) (А), и микрофотографии СМ/Хол/ДОФХ-липосом с тем или иным типом фазового разделения в бислое (/, 1о, sо) в присутствии флоретина и RH 421 (Б). * - Данные взяты из [19]
энергии образования границ упорядоченных доменов. Таким образом, представленные на рис. 1 результаты позволяют связывать сценарий латеральной гетерогенности трехкомпонентных мембран с величиной несоответствия толщины мембраны в упорядоченном и неупорядоченном состоянии: чем меньше Дd, тем сильнее фазовое разделение в бислое.
Учитывая данные о влиянии дипольных модификаторов мембран не только на дипольный потенциал, но и на упаковку мембранообразующих липидов [24-27], мы предположили, что эти агенты способны изменять сценарий фазовой сегрегации. Ранее нами было изучено действие дипольных модификаторов: флоретина, флорицина, кверцетина, мирицетина, RH 421 и RH 237, на сценарий фазового разделения в СМ/Хол/ПОФХ-везикулах [19]. Результаты представлены на рис. ЗА (верхняя панель). Видно, что все использованные модификаторы вызывают ослабление фазовой сегрегации мембран, выражающееся в уменьшении доли липосом с гель-доменами. При этом при введении флоретина, квер-цетина или мирицетина уменьшение числа везикул
с э -доменами сопровождается соответствующим ростом процентного содержания гомогенно окрашенных липосом на 40-45%, а в присутствии флорицина, RH 421 и RH 237 - как увеличением доли везикул с 1о-доменами приблизительно на 30-35%, так и незначительным ростом содержания гомогенных ли-посом (на 5-10%). Наблюдаемый рост относительного числа гомогенно окрашенных ДОФХ-содержащих липосом в присутствии флоретина, флорицина, RH 421 и RH 237 (на 10-30%) и полное исчезновение везикул с эо-доменами в случае флоретина можно интерпретировать как ослабление фазовой сегрегации мембран после введения дипольных модификаторов, так же как и в случае ПОФХ (рис. ЗА, средняя панель). Примеры микрофотографий липидных везикул, включающих ДОФХ, Хол и СМ и показывающих тот или иной сценарий фазовой сегрегации бислоя (1^ I , э ) в присутствии флоретина и RH 421, представлены на рис. ЗБ. Статистически значимых различий в изменении сценария фазовой сегрегации ДОФХ-содержащих мембран в присутствии кверцетина и мирицетина не выявлено.
Л
Липидный состав везикул (40/20/40 мол. %) Дипольный модификатор
Флоретин RH 421 RH 237
ТМКЛ/Хол/ ПОФХ ^о 80 ± 11 % ° 5о т 20 ± 9 % 86 ± 12 % ± 9 % 87 ± 7 % 13 ± 5 %
ТМКЛ/Хол/ДОФХ 82 ±10% т 18 ± 8 % 90 ± 12 % С 10 ± 9 % 91 ± 9 % Г 9 ± 5 %
ТМКЛ/Хол/ДПОФХ 92 ± 5 % е* - 8 ± 4 % 95 ± 7 % © 5 ± 4 % 95 ± 5 % 5 ± 3 %
Рис. 4. Круговые диаграммы вероятных сценариев фазового разделения в мембранах липосом из смеси тетра-миристоилкардиолипина (ТМКЛ, 40 мол. %) с холестерином (Хол, 20 мол. %) и различными фосфолипидами (ПОФХ, ДОФХ или ДПОФХ) (40 мол. %) в присутствии дипольных модификаторов (400 мкМ флоретина или 10 мкМ стирилпиридиновых красителей, RH 421 и RH 237) (Л) и микрофотографии ТМКЛ/Хол/ДОФХ-везикул, показывающих фазовое разделение по типу ///о или /d/sо и модифицированных флоретином или RH 421 (Б)
Трансформация сценария фазового разделения СМ-содержащих мембран в присутствии модификаторов может быть обусловлена увеличением величины Дй под действием тестируемых агентов. Наиболее вероятным вариантом развития событий является увеличение площади, занимаемой полярными головками мембранообразующих липидов, вызванное погружением модифицирующих агентов в липидный бислой и диполь-дипольным взаимодействием их молекул. Это приведет к относительному росту под-
вижности углеводородных цепей и вызовет падение температуры плавления липидов, показанное методами дифференциальной сканирующей микрокалориметрии [18, 25, 28]. Подобному «более текучему» состоянию липидов в мембране соответствует меньшая толщина бислоя. В таком случае выраженность эффекта модификатора будет зависеть от формы и гидрофобности его молекул, определяющих глубину погружения агента в бислой. По этой причине наиболее сильное воздействие на латеральную гете-
рогенность мембран оказывает относительно гидрофобный флоретин, в то время как эффекты его более гидрофильных аналогов, гликозида флорицина и вы-сокогидроксилированных флавонолов, кверцетина и мирицетина, менее выражены. Длины молекул стирилпиридиновых красителей, RH 421 и RH 237, достаточно для почти полного пронизывания липид-ного монослоя, а увеличение площади, приходящейся на одну молекулу липида в мембране, обусловлено, главным образом, электростатическим отталкиванием сульфогрупп молекул красителей, локализованных в полярной области бислоя [27].
Помимо типа модификатора, регуляторную роль играют также геометрические характеристики молекул липидов, образующих фазу, куда встраиваются модифицирующие соединения. В случае липидов, имеющих близкую к цилиндрической форму, ДОФХ, ПОФХ и СМ [29-31] можно ожидать более выраженного «разжижения» ^-областей по сравнению с упорядоченными доменами, поскольку встраивание модификаторов в последние области должно быть затруднено ввиду более плотной упаковки липидов. Такой сценарий соответствует случаю, схематически изображенному на левой части рис. 2.
Как видно на нижней панели рис. ЗА, в случае ДПОФХ-содержащих мембран не выявлено статистически значимых различий паттернов фазового разделения до и после введения тестируемых модификаторов. Учитывая, что преобладающее число везикул, включающих ДПОФХ, не характеризуется фазовой сегрегацией даже в отсутствие диполь-модифицирующих агентов вследствие наибольшей среди изучаемых липидных систем величины несоответствия толщины мембраны в упорядоченном и неупорядоченном состоянии, дальнейший рост Дd не приводит к значимым изменениям особенностей фазового разделения в бислоях.
В отличие от СМ, ТМКЛ имеет форму инвертированного конуса, что обуславливает отрицательную спонтанную кривизну образуемых им монослоев [32]. По всей вероятности, это облегчает встраивание модификаторов, молекулы которых имеют коническую форму, в упорядоченную фазу, обогащенную ТМКЛ. Одновременное «разжижение» как неупорядоченных ^-областей, так и упорядоченных доменов не приведет к существенному изменению скачка толщины на границе раздела липидных фаз, а следовательно, изменения сценария фазовой сегрегации под действием модификаторов наблюдаться не будут. На рис. 4А можно видеть, что независимо от вида легкоплавкого фосфолипида, входящего в состав модельных мембран, в присутствии дипольных модификаторов не происходит достоверного увеличения относительного числа ТМКЛ-содержащих ли-посом с l -доменами или появления везикул, не демонстрирующих видимого фазового разделения. Микрофотографии липидных везикул, включающих ДОФХ, Хол и ТМКЛ и модифицированных флорети-ном или RH 421, представлены на рис. 4Б.
Таким образом, полученные нами результаты указывают на ключевую роль величины несоответствия толщины мембраны в упорядоченном и неупорядоченном состоянии в регуляции фазового разделения в трехкомпонентных модельных мембранах, а также открывают новые перспективы использования ди-польных модификаторов для направленного видоизменения сценария латеральной гетерогенности ли-пидных бислоев. •
Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-14-00565-П).
С.С. Ефимова удостоена стипендии Президента РФ (СП-69.2015.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cevc G. // Chem. Phys. Lipids. 1991. V. 57. P. 293-307.
2. Almeida P.F., Vaz W.L., Thompson T.E. // Biophys. J. 1993. V. 64. P. 399-412.
3. Aresta-Branco F., Cordeiro A.M., Marinho H.S., Cyrne L., Antunes F., de Almeida R.F. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 5043-5054.
4. Brown D. // Int. J. Med. Microbiol. 2002. V. 291. P. 433-437.
5. Simons K., Ikonen E. // Nature. 1997. V. 387. P. 569-572.
6. Simons K., Toomre D. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000. V. 1. P. 31-39.
7. Tsui-Pierchala B.A., Encinas M., Milbrandt J., Johnson E.M. // Trends Neurosci. 2002. V. 25. P. 412-417.
8. Pierce S.K. // Nat. Rev. Immunol. 2002. V. 2. P. 96-105.
9. Van Laethem F., Leo O. // Curr. Mol. Med. 2002. V. 2. P. 557-570.
10. Morgan M.J., Kim Y.S., Liu Z. // Antioxid. Redox. Signal. 2007. V. 9. P. 1471-1483.
11. Jury E.C., Flores-Borja F., Kabouridis P.S. // Semin. Cell Dev. Biol. 2007. V. 18. P. 608-615.
12. Yoshizaki F., Nakayama H., Iwahara C., Takamori K., Ogawa H., Iwabuchi K. // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1780.
P. 383-392.
13. Fulop T., Le Page A., Garneau H., Azimi N., Baehl S., Dupuis G., Pawelec G., Larbi A. // Longev. Healthspan. 2012. V. 1. P. 6.
14. Head B.P., Patel H.H., Insel P.A. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1838. P. 532-545.
15. Ratajczak M.Z., Adamiak M. // Leukemia. 2015. V. 29. P. 1452-1457.
16. Farnoud A.M., Toledo A.M., Konopka J.B., Del Poeta M., London E. // Curr. Top. Membr. 2015. V. 75. P. 233-268.
17. Wesoiowska O., Michalak K., Jadwiga Maniewska J., Hend-rich A.B. // Acta Biochim. Pol. 2009. V. 56. P. 33-39.
18. Ostroumova O.S., Chulkov E.G., Stepanenko O.V., Schagina L.V. // Chem. Phys. Lipids. 2014. V. 178. P. 77-83.
19. Efimova S.S., Malev V.V., Ostroumova O.S. // J. Membr. Biol. 2016. V. 279. P. 97-106.
20. Juhasz J., Davis J.H., Sharom F.J. // Biochem. J. 2010. V. 430. P. 415-423.
21. Muddana H.S., Chiang H.H., Butler P.J. // Biophys. J. 2012. V. 102. P. 489-497.
22. Garcla-Saez A.J., Chiantia S., Schwille P. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 33537-33544.
23. Heberle F.A., Petruzielo R.S., Pan J., Drazba P., Kucerka N., Standaert R.F., Feigenson G.W., Katsaras J. // J. Am. Chem. Soc. 2013. V. 135. P. 6853-6859.
24. Cseh R., Hetzer M., Wolf K., Kraus J., Bringmann G., Benz R. // Eur. Biophys. J. 2000. V. 29. P. 172-183.
25. Tarahovsky Y.S., Muzafarov E.N., Kim Y.A. // Mol. Cell Bio-chem. 2008. V. 314. P. 65-71.
26. Ollila F., Halling K., Vuorela P., Vuorela H., Slotte J.P. //
Arch. Biochem. Biophys. 2002. V. 399. P. 103-108.
27. Apetrei A., Mereuta L., Luchian T. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1790. P. 809-816.
28. Cseh R., Benz R. // Biophys. J. 1999. V. 77. P. 1477-1488.
29. Sakuma Y., Taniguchi T., Imai M. // Biophys. J. 2010. V. 99. P. 472-479.
30. Bezrukov S.M. // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2000. V. 5. P. 237-243.
31. Byström T., Lindblom G. // Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2003. V. 59. P. 2191-2195.
32. Powell G.L., Hui S.W. // Biophys. J. 1996. V. 70. P. 1402-1406.
