CC BY
120
УДК 577.352
Исследование каналообразующей активности полиеновых антибиотиков в липидных бислоях с использованием дипольных модификаторов
С. С. Ефимова*, Л. В. Щагина, О. С. Остроумова Институт цитологии РАН, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 29.04.2014
реферат В работе исследована роль мембранных компонентов, стеринов, фосфолипидов и сфинголипидов в процессах формирования и функционирования ион-проницаемых нанопор, образуемых противогрибковыми макролидами, амфотерицином В, нистатином и филипином, в модельных мембранах. В качестве инструмента для выяснения молекулярных механизмов использованы дипольные модификаторы, фла-воноиды и стириловые красители. Показано, что введение в мембраноомывающие растворы дипольных модификаторов приводит к изменению проводимости одиночных каналов и равновесного трансмембранного тока, индуцированного полиеновыми антибиотиками в стеринсодержащих фосфолипидных бислоях. Установлено, что проводимость одиночных амфотерициновых каналов зависит от дипольного потенциала мембраны. Использование набора различных фосфолипидов, стеринов и полиеновых антибиотиков позволило заключить, что геометрия фосфолипидной молекулы, наличие двойных связей в 7- и 22-положениях молекулы стерина, число сопряженных двойных связей и наличие аминосахара в молекуле антибиотика определяют стабильность полиен-липидных комплексов, образующих проводящие трансмембранные поры. Представленные в работе экспериментальные и литературные данные позволяют сделать предположение о связи каналообразующей активности полиеновых антибиотиков с физико-химическими свойствами обогащенных полиеновыми макролидами упорядоченных мембранных областей.
ключевые слова плоские липидные бислои, полиеновые антибиотики, стерины, стириловые красители, сфинголипиды, флавоноиды, фосфолипиды.
список сокращений АМВ - амфотерицин В; НС - нистатин; ФЛ - филипин; ДФФХ - 1,2-дифитаноил-эте-глицеро-З-фосфохолин; ДФФС - 1,2-дифитаноил^те-глицеро-3-фосфосерин; ДОФХ -1,2-диолеил^те-глицеро-3-фосфохолин; ПОФХ - 1-пальмитоил-2-олеил-эте-глицеро-3-фосфохолин; ДОФС - 1,2-диолеил-эте-глицеро-З-фосфосерин; ДОФЭ - 1,2-диолеил-эте-глицеро-З-фосфоэтаноламин; ЛР-ДПФЭ - 1,2-дипальмитоил^те-глицеро-3-фосфоэтаноламин-^(лиззаминродамин); Хол - холестерин; Эрг - эргостерин; ДХол - 7-дегидрохолестерин; Стигм - стигмастерин; СФС - ^стеароил-фитосфингозин из Saccharomyces cerevisiae; СМ - сфингомиелин из мозга свиней; СЭС - ^стеароил-О-эритро-сфинганин.
введение
Макролидные полиеновые антибиотики - одни из самых эффективных препаратов, применяемых при грибковых инфекциях, глубоких системных микозах, они широко используются в клинической медицине уже много десятилетий. Интерес к поли-еновым макролидам обусловлен также их противоопухолевой и противовирусной активностью [1-3]. Несмотря на большое число побочных эффектов, таких, как нефротоксичность, анемия, сердечная аритмия [4, 5], полиеновые макролиды остаются препаратами выбора для лечения пациентов с им-мунодефицитным статусом [6, 7]. Современные фар-
мацевтические технологии разработки препаратов на основе полиеновых макролидов направлены на снижение действующей концентрации антибиотика без ущерба для его терапевтической эффективности.
Основными представителями класса неароматических макролидных полиеновых антибиотиков являются амфотерицин В (АМВ) [8], нистатин (НС) [9, 10] и филипин (ФЛ) [11]. В состав лактонного кольца молекулы амфотерицина В входят 38 углеродных атомов (рис. 1). Гидрофильная и гептаеновая цепи в макролактонном кольце молекулы АМВ представлены углеродными атомами С:-С15 и С20-С33 соответ-
нсД*^ но-^-^он
Флоретин
Биоханин А
RH 160
Флоридзин
Кверцетин
Генистеин
Мирицетин
RH 237
Генистин
ТГАФ
RH 421
Рис. 1. Химическая структура флаво-ноидов флоретина, флоридзина, гени-стеина,генистина, биоханина А, квер-цетина, мирицети-на и ТГАФ, стири-ловых красителей RH 160, RH 237 и RH 421,полиенов АМВ, НС и ФЛ, фосфолипидов ДФФХ, ДФФС, ДОФХ, ПОФХ, ДОФЭ и ДОФС, стеринов Хол, Эрг, ДХол и Стигм, сфинголипидов СФС, СМ и СЭС
АМВ
НС
ФЛ
ДФФХ
ДОФХ
ДФФС
ПОФХ
ДОФЭ
ДОФС
Хол
Эрг
Стигм
м|) н
ДХол
СФС
СМ
СЭС
ственно. Эти цепи располагаются параллельно друг другу. Гептаеновая цепочка С20-С33 - жесткая система, состоящая из семи двойных связей. В гидрофильной цепи молекулы АМВ содержатся гидроксиль-ные и карбонильные группы. Гидроксильные группы в гидрофильной области молекулы расположены в одной плоскости. В положениях 6 и 19 находятся
карбоксильная группа и остаток микозамина соответственно. Еще одна гидроксильная группа локализована в гидрофобной части молекулы в положении 35. Химическая структура молекулы нистатина, относящегося к классу тетраенов, близка к структуре АМВ. Нистатин отличается от АМВ положением ги-дроксильных групп в гидрофильной цепи и преры-
вистостью системы сопряженных двойных связей, насыщенная связь разделяет хромофор на диеновый и тетраеновый участки. Филипин относится к классу метилпентаенов, он отличается от АМВ и НС меньшим размером полиенового фрагмента, а также отсутствием аминосахарного остатка [12].
Считается, что клетки-мишени гибнут благодаря способности полиеновых антибиотиков связываться с их плазматическими мембранами, формировать в них трансмембранные поры и нарушать водно-электролитный баланс. Обязательное условие образования пор - наличие стеринов в мембранах клеток-мишеней [8, 13, 14]. Несмотря на 40-летнее исследование молекулярных механизмов формирования и функционирования АМВ-канала, его точная молекулярная архитектура все еще находится на стадии обсуждения. Предложены различные модели АМВ-канала, из которых наиболее популярна стерин-зависимая модель, в рамках которой образование канала при двусторонней относительно мембраны добавке антибиотика происходит при ассоциации двух «полупор», образованных полиен-сте-риновыми комплексами, расположенными в противоположных монослоях [8, 13, 15]. Полупора, имеющая цилиндрическую форму, образуется одинаковым числом (от 7 до 10) молекул антибиотика и стери-на, ориентированных перпендикулярно плоскости мембраны. Полость поры выстлана гидрофильными цепочками лактонового кольца. Сквозная трансмембранная пора формируется за счет образования водородных связей между гидроксильными группами молекул АМВ, сосредоточенных во взаимодействующих полупорах [12].
Стерин-зависимая мембранная активность амфо-терицина В указывает на то, что терапевтическая эффективность АМВ прежде всего связана с его неодинаковой специфичностью в отношении различных стеринов клеточных мембран. Как известно, холестерин (Хол) является основным стерином мембран клеток млекопитающих, а эргостерин (Эрг) - клеток грибов. До сих пор не ясно, обусловлена ли специфичность взаимодействия полиенов с мембранами различных клеток большей стабильностью комплекса АМВ с Эрг по сравнению с Хол или наблюдаемые эффекты опосредованы различным влиянием этих стеринов на структурные и динамические свойства мембран [16, 17].
Данные Нейман и соавт. [18, 19] свидетельствуют в пользу первой гипотезы. Более жесткая и удлиненная молекулярная геометрия Эрг по сравнению с Хол облегчает взаимодействие Эрг с молекулой АМВ. Принимая во внимание тот факт, что сила Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий стержне-образных молекул зависит от их взаимной ориен-
тации и достигает максимума, когда обе молекулы лежат в одной плоскости и параллельны друг другу, л-л-электронное взаимодействие между двойной связью в боковой цепи Эрг и полиеновым хромофором АМВ может быть дополнительной точкой, необходимой для стабилизации правильной ориентации комплекса (рис. 2А,Б) [20]. В случае Хол не только энергия комплексообразования больше (нет двойной связи в боковой цепи молекулы стерина), но также должны быть компенсированы энтропийные потери, связанные с уменьшением конформационной гибкости боковой цепи стерина. Результаты исследования подвижности молекул АМВ и стеринов в фосфо-липидных бислоях методом 2Н-ЯМР, проведенные Матсумори и соавт. [21], подтвердили гипотезу о более сильном межмолекулярном взаимодействии АМВ с Эрг по сравнению с Хол.
Стерины определяют текучесть мембран и преимущественно локализуются в более упорядоченных мембранных областях - липидных рафтах, что может служить основанием для принятия второй гипотезы. Показано, что АМВ имеет более высокое сродство к стеринсодержащей упорядоченной фазе и, следовательно, может, как и стерины, аккумулироваться в липидных рафтах [17, 22]. Целый ряд работ указывает на увеличение упорядоченности Хол-содержащих мембран в присутствии АМВ и в отсутствие подобного эффекта в случае мембран, включающих Эрг [17, 23, 24].
Кжуб и Багинский [17] показали, что отрицательно заряженная карбоксильная группа (COO-) в молекуле АМВ смещена в сторону водной фазы по сравнению с протонированной аминогруппой (NH3+). Авторы предположили, что диполь полярной головы АМВ (COO- — NH3+) стремится ориентироваться параллельно диполям полярных голов фосфатидилхоли-на и соответственно приводить к росту дипольного потенциала мембраны. Это скачок потенциала, возникающий на границе раздела фаз бислой-раствор в результате определенной взаимной ориентации диполей мембранных липидов и околомембранной воды [25-27] и играющий существенную роль в регуляции транспорта веществ через мембрану.
Как было отмечено, макролидные полиеновые антибиотики проявляют противогрибковый эффект, связываясь с мембранными стеринами, но при этом информации об участии других мембранных компонентов, в частности фосфолипидов и сфинголипидов, мало. Существует ряд свидетельств в пользу того, что фосфолипиды влияют на активность полиено-вых антимикотиков. Согласно опубликованным данным, полиеновые антибиотики способны образовывать трансмембранные поры в бислое и в отсутствие в нем стеринов [28-32]. Фуджи и соавт. [33] показали,
Двойные связи, которые могут участвовать в п-п-электронном взаимодействии
Ван-дер-Ваальсово Сеть водородных взаимодействие связей
д
Рис. 2. Схематическое представление межмолекулярных связей, образующихся в комплексах АМВ-Эрг (Л), АМВ-Хол (Б), АМВ-Стигм (в), АМВ-ДХол (Г), АМВ-Хол с флоре-тином (Д), ФЛ-Хол с кверцетином (Е), ФЛ-Эрг с квер-цетином (Ж), АМВ-Эрг-ДФФХ с флоретином (З) и АМВ-Эрг-ПОФХ с флоретином (И). Комплексы АМВ-Хол и АМВ-Эрг по [20] с изменениями
Б
В
З
Ж
И
Е
что молекула АМВ может специфически взаимодействовать с молекулами фосфолипидов. Дуфорк и соавт. [34], основываясь на результатах 2Н-ЯМР-исследования липосом из димиристоилфосфатидил-холина с АМВ, отметили упорядочивание ацильных цепей молекул этого липида при взаимодействии с АМВ. Кроме того, на основе анализа спектров кругового дихроизма АМВ в липосомах в отсутствие стерина Балакришнан и Еашаран [35] предположили существование в бислое организованной многомолекулярной структуры, в которой АМВ взаимодействует с ацильными цепями молекул дипальмитоил-фосфатидилхолина в соотношении 1 : 1. Результаты исследований, проведенных Фурниер и соавт. [36] методом дифференциальной сканирующей калориметрии, показали, что АМВ индуцирует разделение фаз в мембране, а именно в присутствии АМВ
в липосомах из дипальмитоилфосфатидилхолина выявляются одновременно три фазы. Первая фаза соответствует чистому фосфолипиду, вторая и третья характеризуются фазовым переходом в широком диапазоне температур выше температуры фазового перехода чистого фосфолипида. Более того, Паке и соавт. [23] показали дозозависимое увеличение температуры фазового перехода липидов из гель- в жидкокристаллическое состояние в присутствии АМВ. Мийо и соавт. [37] предположили, что молекулы АМВ взаимодействуют с полимолекулярными фосфоли-пидными ансамблями. Результаты Штернала и соавт. [38], полученные с использованием методов молекулярной динамики, не противоречат гипотезе о взаимодействии полярных голов АМВ и димиристоил-фосфатидилхолина. Такое взаимодействие отмечено, в частности, между карбоксильной группой АМВ
и аминогруппой липида. Херец и соавт. [39] предположили, что водородные связи между горизонтально ориентированными молекулами АМВ и полярными группами липидов приводят к конденсации бислоя.
Нам удалось найти только косвенные свидетельства возможного взаимодействия между полиеновы-ми макролидами и мембранными сфинголипидами. Например, Загер [40] показал, что полиеновые антибиотики влияют на концентрацию фосфолипидов и церамидов в плазматической мембране. Наджиек и соавт. [41] установили, что мутантный штамм Saccharomyces cerevisiae, способный расти без образования сфинголипидов, более восприимчив к АМВ, чем клетки дикого типа. Изучение влияния сфинго-липидного состава мембраны на активность полиено-вых макролидов представляет интерес еще и потому, что сфинголипиды, так же как стерины и полиены, локализуются в липидных рафтах [17].
Целью представленной работы было установление молекулярных механизмов образования полиеновых трансмембранных пор в мембранах, содержащих различные фосфолипиды, стерины и сфинголипиды. В качестве инструментов исследования использованы дипольные модификаторы - соединения, способные изменять величину дипольного потенциала мембран, а именно флавоноиды и стириловые красители. Основанием для применения дипольных модификаторов послужили данные об их успешном применении при исследовании процессов формирования и функционирования ионных каналов в модельных и клеточных мембранах [42-51].
экспериментальная часть
Материалы
В работе использовали следующие реактивы: KC1, HEPES, пентан, этанол, хлороформ, диметилсуль-фоксид (ДМСО), гексадекан и сквален, флоретин, флоридзин, генистин, генистеин, кверцетин, ми-рицетин, биоханин А, 2',4',6'-моногидрат триги-дроксиацетофенона (ТГАФ), RH 421 и амфотерицин В (АМВ), нистатин (НС) и филипин (ФЛ) (Sigma, США); RH 160 и RH 237 (Molecular Probes, США); 1,2-дифитаноил^те-глицеро-3-фосфохолин (ДФФХ), 1,2-дифитаноил^те-глицеро-3-фосфосерин (ДФФС), 1,2-диолеил^те-глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ), 1-пальмитоил-2-олеил^те-глицеро-3-фосфохолин (ПОФХ), 1,2-диолеил-зте-глицеро-3-фосфосерин (ДОФС), 1,2-диолеил-зте-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ), холестерин (Хол), эргостерин (Эрг), 7-дегидрохолестерин (ДХол), стигмастерин (Стигм), N-стеароил-фитосфингозин из S. cerevisiae (СФС), сфингомиелин из мозга свиней (СМ), синтетический сфинголипид N-стеароил-
D-эритро-сфинганин (СЭС) и 1,2-дипальмитоил^те-глицеро-3-фосфоэтаноламин-П-(лиззаминродамин) (ЛР-ДПФЭ) (Avanti Polar Lipids, США). Химические структуры флавоноидов, стириловых красителей, полиенов, фосфолипидов, стеринов и сфинголипидов показаны на рис. 1.
Регистрация токов, протекающих через плоские липидные бислои
Формирование бислойных липидных мембран проводили по методу Монтала и Мюллера [52] путем сведения конденсированных липидных монослоев на отверстии в тефлоной пленке, разделяющей экспериментальную камеру на два (цис- и транс-) отделения. Объем каждого отделения составлял 1.5 мл, толщина тефлоновой пленки - 10 мкм, диаметр отверстия - около 50 мкм. Перед началом процесса формирования мембраны отверстие в тефло-новой пленке обрабатывали гексадеканом. Монослои формировали на границе вода-воздух из раствора 1 мг/мл липида в пентане. Для образования монослоев использовали смеси фосфолипид : стерин или фосфолипид : эргостерин : сфинголипид в молярных соотношениях 67 : 33 моль % или 53 : 27 : 20 моль % соответственно. Каналообразующую активность полиенов измеряли при одинаковом ионном составе водных растворов электролита (2.0 M Kcl), кислотность растворов (рН 7.0) поддерживали буферной смесью 5 мМ Hepes-KOH.
Полиеновые антибиотики добавляли к водной фазе обоих отделений камеры: АМВ и НС из раствора в ДМСО 10-4 и 10-3 М соответственно и ФЛ из раствора в этаноле 10-4 М до конечной концентрации в околомембранных растворах 10-8-10-6 М. Двустороннее введение полиеновых антибиотиков обусловлено тем, что согласно [8, 13, 15], каналы формируются из двух ассоциированных полупор. Конечная концентрация спирта или ДМСО в камере не превышала 0.1% и не вызывала изменения стабильности проводимости мембраны.
Флавоноиды флоретин, флоридзин, генистин, ге-нистеин, кверцетин, мирицетин, биоханин А и ТГАФ вводили в оба отделения камеры из миллимолярных растворов в этаноле или ДМСО, до конечной концентрации в околомембранных растворах 20 мкМ, а стириловые красители RH 160, RH 237 и RH 421 -до концентрации 5 мкМ.
Ток, протекающий через бислойную липидную мембрану, измеряли в режиме фиксации потенциала. Для подачи трансмембранного потенциала (V) и отведения сигнала с мембраны использовали хлор-серебряные электроды (Ag/Agcl), соединенные с растворами камеры через мостики с 1.5% агарозой в растворе 2 М Kcl. Положительным считали потен-
циал, вызывающий поток катионов из цис- в трансотделение камеры. Электрофизиологические измерения проводили при комнатной температуре.
Измерения и оцифровку трансмембранных токов проводили в режиме фиксации потенциала с помощью Axopatch 200B и Digidata 1440A (Axon Instruments, США). Для обработки данных использовали 8-по-лярный фильтр Бесселя (Model 9002, Frequency Devices) и частоту фильтрации 1 кГц. Обработку записей трансмембранных токов осуществляли с использованием программного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments, США). Статистический анализ полученных данных проводили при помощи программы Origin 8.0 (OriginLab, США).
Среднее отношение равновесного инте-
грального трансмембранного тока, индуцированного каналообразующим агентом (АМВ, НС и ФЛ) в присутствии (IJ и в отсутствие дипольных модификаторов (IJ1), определяли как среднее арифметическое значение I^/IJ0 при измерении от трех до девяти бислоев (среднее ± SE). Равновесное число функционирующих в мембране каналов определяли как отношение равновесного трансмембранного тока (IJ1) к току, протекающему через одиночный канал (г).
Проводимость одиночных каналов (g) определяли как отношение протекающего через одиночный канал тока (г) к трансмембранной разности потенциалов (V). Для построения гистограмм флуктуаций тока значения трансмембранных токов определяли по изменениям амплитуды тока при открывании (или закрывании) одиночных каналов. Общее число событий (N), используемых для анализа при фиксированном значении трансмембранного потенциала, составляло от 100 до 5000. По оси ординат откладывали относительные частоты значений трансмембранного тока n/N. Все пики на гистограммах аппроксимировали плотностью нормального распределения. В качестве критерия проверки гипотезы о законе распределения использовали критерий х2 (P < 0.05).
Измерение селективности каналов
При измерении катион-анионной селективности каналов на мембране создавали 10-кратный градиент концентрации электролита KCl. Измерение селективности АМВ-каналов проводили при концентрациях растворов 2.0 и 0.2 М KCl в цис- и транс-отсеках экспериментальной камеры соответственно. Число переноса для анионов (t-) (t- + t+ = 1) рассчитывали согласно уравнению Гендерсона [53]:
Vrev = (RT/F)(1-2t-)ln(C /С ),
\ / / \ / \ цис транс''
(1)
где Утт - потенциал реверсии, соответствующий нулевому трансмембранному току при заданном от-
ношении концентраций проникающих ионов с цис-и транс-стороны мембраны (С /С ); R - универ-
цис транс
сальная газовая постоянная (R = 8.31 Дж/(моль-К)); T - термодинамическая температура (Т = 294 К); F -число Фарадея (F = 96485 Кл/моль).
Конфокальная микроскопия гигантских одноламеллярных липосом
Гигантские одноламеллярные липосомы изготавливали методом электроформации c помощью Nanion vesicle prep pro (Германия) (стандартный протокол, напряжение 3 В, частота 10 Гц, 1 ч, 25°C). Латеральное фазовое разделение визуализировали путем введения флуоресцентного зонда ЛР-ДПФЭ в исходный липидный раствор ПОФХ в хлороформе (11 мМ). Концентрация ЛР-ДПФЭ в образце составляла 1 моль %. Полученную суспензию липосом разделяли на аликвоты. В качестве контроля использовали аликвоту без АМВ. Экспериментальные образцы содержали 100 или 300 мкМ АМВ. Липосомы наблюдали через иммерсионный объектив 100.0Х/1.4 HCX PL в Leica TCS SP5 конфокальной лазерной системы Apo (Leica Microsystems, Германия). Препараты наблюдали при температуре 25°C. Свечение ЛР-ДПФЭ возбуждали светом с длиной волны 543 нм (гелий-неоновый лазер). Известно, что ЛР-ДПФЭ в бислое с фазовым разделением встраивается преимущественно в жидкую неупорядоченную фазу [54], в то время как жидкая упорядоченная и твердая упорядоченная (гель) фазы остаются неокрашенными [55]. Для каждой системы проводили как минимум четыре независимых эксперимента.
результаты и обсуждение
Влияние дипольных модификаторов
на проводимость одиночных амфотерициновых
каналов
На рис. 3 приведены примеры записей флуктуаций трансмембранного тока, протекающего через одиночные АМВ-каналы в ДФФХ : Хол-мембранах (рис. 3, левый столбец) и ДФФХ : Эрг-бислоях (рис. 3, правый столбец), до и после введения дипольных модификаторов, флавоноидов (флоретина и кверцети-на) и стириловых красителей (RH 160, RH 237 и RH 421). Из рис. 3А,Б видно, что ток, протекающий через одиночные АМВ-каналы в отсутствие диполь-ных модификаторов не зависит от вида стерина (Хол или Эрг) в мембране. Введение в мембраноомыва-ющие растворы флоретина вызывает уменьшение трансмембранного тока, протекающего через одиночные АМВ-каналы, как в ДФФХ : Хол-мембранах, так и в ДФФХ : Эрг-бислоях (рис. 3В,Г). При этом до-
0 пА ^
.ШООмн
_| 0.2 пА 0.5с
_| 0.2пА 1с
Таблица 1. Отношения проводимостей одиночных амфотерициновых каналов в отсутствие и в присутствии различных дипольмодифицирующих агентов при V = 50 мВ (g/gV=50). Мембраны сформированы из ДФФХ : Хол (67= : 33 моль %) и ДФФХ : Эрг (67 : 33 моль %) в растворах 2.0 M KCl (pH 7.0)
0 пА — wJUHffiWUMjHlttiWMa^ —
_I 0.2пА
1 с
Д
0 пА Jp!^^
J 0.2пА
0.5с
Ж
_| 0.2пА 1с
_1 0.2пА 0.5с
0 пА
J,
_I 0.2пА
0.5с
И
_| 0.2 пА 0.5с
К
0 пА jJ
L
_| 0.2пА 1с
Л
_| 0.2пА 0.5с
М
0 пА
_I 0.2пА
1с
J 0.2пА
1с
Рис. 3. Записи флуктуации трансмембранного тока, протекающего через одиночные АМВ-каналы в липидных бислоях. Мембраны сформированы из ДФФХ : Хол (67 : 33 моль %) и ДФФХ : Эрг (67 : 33 моль %) в растворах 2.0 M KCl (pH 7.0). А, Б - контроль (отсутствие дипольных модификаторов). Мембраноомы-вающий раствор содержит (мкМ): 20 флоретина (В, Г), 20 кверцетина (Д, Е), 5 RH 160 (Ж, З), 5 RH 237 (И, К), 5 RH 421 (Л, М). Штриховые линии соответствуют 0 пА. V = 50 мВ
бавка кверцетина уменьшает трансмембранный ток, протекающий через АМВ-каналы в ДФФХ : Хол-мембранах, и не влияет на трансмембранный ток, протекающий через АМВ-каналы в ДФФХ : Эрг-мембранах (рис. 3Д,Е). Введение в мембраноомыва-
Дипольный модификатор Мембранообразующий раствор
ДФФХ : Хол ДФФХ : Эрг
Флоретин 3.30 ± 0.21 2.20 ± 0.41
Флоридзин 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.10
Кверцетин 1.72 ± 0.21 0.95 ± 0.15
Флавоноид Генистеин 0.98 ± 0.09 -
Генистин 0.96 ± 0.08 -
Биоханин А 0.89 ± 0.11 -
ТГАФ 0.91 ± 0.15 -
RH 421 0.69 ± 0.07 0.49 ± 0.06
Стириловый краситель RH 237 0.71 ± 0.08 0.61 ± 0.05
RH 160 0.80 ± 0.09 0.63 ± 0.06
ющие растворы стириловых красителей серии ИН вызывает увеличение трансмембранного тока, протекающего через одиночные АМВ-каналы: ток возрастает в ряду ИН 160 < ИН 237 < ИН 421 как в случае ДФФХ : Хол-мембран (рис. 3Ж,И,Л), так и в случае ДФФХ : Эрг-бислоев (рис. 3З,К,М).
В табл. 1 представлены отношения проводимостей одиночных АМВ-каналов в отсутствие и в присутствии дипольмодифицирующих агентов при трансмембранном потенциале, равном 50 мВ (g/gV = 50). Приведенные в табл. 1 результаты показывают, что флоретин уменьшает проводимость одиночных АМВ-каналов в ДФФХ : Хол- и ДФФХ : Эрг-мембранах в 3 и 2 раза соответственно. При этом добавка кверцетина уменьшает проводимость одиночных АМВ-каналов в 1.7 раза в ДФФХ : Хол-мембранах и практически не изменяет g в случае ДФФХ : Эрг-бислоев. Видно, что добавка в мембра-ноомывающие растворы других флавоноидов: фло-ридзина, биоханина А, ТГАФ, генистина или ге-нистеина практически не влияет на проводимость АМВ-каналов. Введение в мембраноомывающие растворы стириловых красителей вызывает увеличение g в ряду ИН 160, ИН 237 и ИН 421 в ДФФХ : Хол-мембранах в 1.3, 1.4 и 1.5 раза и в ДФФХ : Эрг-бислоях - в 1.6, 1.7 и 2.1 раза соответственно.
В табл. 2 представлены величины изменения дипольного потенциала ДФФХ : Хол- и ДФФХ :
Б
В
Г
Е
З
предположить, что изменение д при введении фло-ретина или стириловых красителей в растворы, омывающие Хол- и Эрг-содержащие ДФФХ-мембраны, и кверцетина в растворы, омывающие ДФФХ : Хол-бислой, может быть связано с изменением дипольно-го потенциала мембран. Выявленные несоответствия между изменениями проводимости одиночных АМВ-каналов и дипольного потенциала стеринсодержа-щих ДФФХ-бислоев при введении дипольных модификаторов позволяют утверждать, что изменение д обусловлено не только варьированием дипольного потенциала бислоя, но может быть результатом взаимодействия дипольных модификаторов (флоретина, кверцетина и/или стириловых красителей) с комплексами АМВ-Хол и/или АМВ-Эрг.
На рис. 2 схематически представлены межмолекулярные связи в полиен-стериновых комплексах. Известно, что полиен-стериновые комплексы образуются за счет Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий [19]. Сила взаимодействия в этом случае зависит от параллельности и копланарности молекул поли-ена и стерина. Взаимная ориентация молекул происходит благодаря образованию водородных связей между ОН-группой молекулы стерина и аминосаха-ром молекулы полиена. Присутствие дополнительных (по сравнению с Хол) двойных связей в стероидном ядре и боковой цепи молекулы Эрг приводит к образованию более стабильного комплекса АМВ-Эрг за счет дополнительных точек л-л-электронного взаимодействия по сравнению с комплексом АМВ-Хол [20] (рис. 2А,Б). По этим причинам комплексы АМВ-Эрг и АМВ-Хол могут по-разному взаимодействовать с дипольными модификаторами.
Влияние дипольных модификаторов на индуцированную полиеновыми антимикотиками мультиканальную проводимость мембран
Варьирование стеринового состава. Для проверки предположения о взаимодействии дипольных модификаторов с полиен-стериновыми комплексами изучили влияние дипольмодифицирующих агентов на равновесный трансмембранный ток, индуцированный амфотерицином В. Среднее отношение равновесного трансмембранного тока, индуцированного АМВ в Хол- и Эрг-содержащих ДФФХ-бислоях, после и до введения различных дипольных модификаторов (1о/1„0), при трансмембранном напряжении 50 мВ представлено в виде диаграммы на рис. 4. Добавка флоретина в мембраноомывающие растворы вызывает существенное увеличение равновесного трансмембранного тока, индуцированного АМВ (1^) в ДФФХ : Хол-бислоях. В ДФФХ : Эрг-
Таблица 2. Изменение дипольного потенциала (Дф^), мВ) ДФФХ : Хол (67:33 моль %)* или ДФФХ : Эрг (67:33 моль %)* мембран в присутствии различных дипольмодифицирующих агентов
Дипольный модификатор Мембранообразующий раствор
ДФФХ : Хол ДФФХ : Эрг
Флоретин -75 ± 10 -150 ± 5
Флоридзин -45 ± 10 -50 ± 10
Кверцетин -110 ±10 -105 ±15
Флавоноид, 20 мкМ Генистеин -35 ± 5 -40 ± 10
Генистин -30 ± 5 -
Биоханин А -75 ± 15 -80 ± 15
ТГАФ -40 ± 10 -40 ± 10
Стириловый краситель, 5 мкМ ИН 421 50 ± 8 57 ± 9
ИН 237 75 ± 10 85 ± 5
ИН 160 55 ± 10 45 ± 5
*Результаты взяты из [69].
Эрг-бислоев в присутствии использованных ди-польных модификаторов в мембраноомывающих растворах. Так, например, флоретин уменьшает дипольный потенциал ДФФХ : Хол-мембран на 75 ± 10 мВ, а ДФФХ : Эрг-бислоев на 150 ± 5 мВ. Добавка кверцетина в мембраноомывающие растворы приводит к практически одинаковому падению фй Хол- и Эрг-содержащих ДФФХ-бислоев на 100 ± 15 мВ. Введение в мембраноомывающие растворы генистина и ТГАФ слабо влияет на фй ДФФХ : : Хол- и ДФФХ : Эрг-бислоев. Добавка в околомембранные растворы стириловых красителей серии ИН приводит к росту дипольного потенциала мембран, при этом способность увеличивать дипольный потенциал стеринсодержащих мембран возрастает в ряду ИН 421 ~ ИН 160 < ИН 237. Добавка в околомембранные растворы стирилового красителя ИН 237 увеличивает фй стеринсодержащих бисло-ев на 80 ± 10 мВ независимо от стеринового состава мембраны. При этом ИН 421 или ИН 160 в мембра-ноомывающих растворах увеличивают дипольный потенциал ДФФХ : Хол- и ДФФХ : Эрг-мембран на 55 ± 10 мВ и 50 ± 10 мВ соответственно. Сравнение величин, приведенных в табл. 1 и 2, указывает на корреляцию изменений проводимости одиночных АМВ-каналов и дипольного потенциала стеринсо-держащих ДФФХ-бислоев при введении дипольных модификаторов. Полученные результаты позволяют
Рис. 4. Отношение равновесного трансмембранного тока, индуцированного амфотерицином В в стерин-содержащих бислоях, после и до введения различных дипольных модификаторов (I^/IJ0). Мембраны сформированы из ДФФХ : Хол (67 : 33 моль %) или ДФФХ : : Эрг (67 : 33 моль %) и омываются 2.° M KCl (pH 7.°)
мембранах влияние флоретина на ^ отсутствует. Введение в мембраноомывающие растворы квер-цетина не влияет на ^ в ДФФХ : Хол-мембранах и приводит к уменьшению ^ в ДФФХ : Эрг-бислоях. Влияния таких флавоноидов, как флоридзин, гени-стеин, генистин, биоханин А, мирицетин и ТГАФ, на ^ в Хол- и Эрг-содержащих ДФФХ-мембранах не наблюдается. Введение ИН 421 в растворы, омывающие ДФФХ : Хол-бислои, практически не изменяет Iaa, а добавка этого модификатора в растворы, омывающие ДФФХ : Эрг-мембраны, увеличивает Iao. При этом другие стириловые красители ИН 160 и ИН 237 не оказывают эффекта на мультиканальную активность АМВ в Хол- и Эрг-содержащих ДФФХ-мембранах. По всей вероятности, в случае менее выгодного с энергетической точки зрения комплекса АМВ-Хол, флоретин, благодаря своей «шпилечной» конформации, способен выполнять роль медиатора между полиеновой и стериновой молекулами и стабилизировать комплекс АМВ-Хол (рис. 2Д), что выражается в увеличении каналообразующей активности АМВ в присутствии этого дипольно-го модификатора в Хол-содержащих мембранах. Кверцетин, благодаря большей, чем у флоретина, глубине погружения в бислой [56], может конкурировать со стерином за взаимодействие с АМВ и де-
стабилизировать самый выгодный с энергетической точки зрения комплекс АМВ-Эрг, что выражается в уменьшении каналообразующей активности поли-ена (рис. 4). Учитывая, что стириловый краситель ИН 421 имеет промежуточную между ИН 160 и ИН 237 глубину погружения хромофора в бислой и наиболее близкую к нормали к поверхности мембраны ориентацию [57], можно предполагать его колокализацию с комплексом АМВ-Эрг. В этом случае стириловый краситель можно рассматривать в качестве третьего участника Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, служащего дополнительным взаимоориентирующим фактором за счет участия в л-л-электронных взаимодействиях.
Учитывая, что главное отличие молекулы Эрг от Хол заключается в наличии двух двойных связей - в 7-м положении стероидного ядра и в 22-м положении боковой углеводородной цепи, были также выбраны стерины, которые отличаются от холестерина наличием одной двойной связи в 7-м или 22-м положении, 7-дегидрохолестерин (ДХол) и стигмастерин (Стигм) соответственно (см. рис. 1). Установлено, что добавка флоретина в мембраноомы-вающий раствор приводит к большему росту равновесного трансмембранного тока, протекающего через ДФФХ : Стигм-мембраны (^Д^0 = 5.3 ± 3.1), по сравнению с ДФФХ : ДХол-бислоями (^/М = 1.7 ± 0.3). Выраженность эффекта флоретина в модифицированных АМВ ДФФХ : Хол и ДФФХ : Стигм-мембранах, а также его отсутствие в ДФФХ : Эрг-бислоях и малость в случае ДФФХ : ДХол-мембран могут свидетельствовать в пользу сходства геометрии комплексов АМВ-Хол и АМВ-Стигм, АМВ-Эрг и АМВ-ДХол соответственно. Схематическое представление образования межмолекулярных связей в комплексах АМВ-ДХол и АМВ-Стигм представлено на рис. 2В,Г. Учитывая, что сходство молекул Хол и Стигм, а также Эрг и ДХол заключается в отсутствие или наличии двойной связи в положении 7, соответственно можно думать об определяющей роли распределения электрической плотности в области стероидного ядра (вблизи 7-го положения), что может сказываться на возможности образования водородной связи между гидроксильной группой молекулы стерина и одной из ОН-групп молекулы флоретина. Введение ИН 421 в растворы, омывающие ДФФХ : ДХол- и ДФФХ : Стигм-бислои, практически не изменяет ^ (Ix/IJ> = 1.1 ± 0.1). Поскольку ИН 421 эффективен только в отношении ДФФХ : Эрг-мембран и не влияет на модифицированные АМВ ДФФХ : ДХол-бислои, а Эрг отличается от ДХол наличием двойной связи в 22-м положении, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что ИН 421 является более чувствительным инстру-
флоретин кверцетин RH 421
2-
флоретин М кверцетин l=lRH 421
ДффХ:Хол ДФФХ:Эрг
ДффХ:Хол ДФФХ:Эрг
Рис. 5. Отношение равновесного трансмембранного тока, индуцированного нистатином (А) и филипином (Б) в стеринсодержащих бислоях, после и до введения различных дипольных модификаторов (I^/IJ°). Мембраны сформированы из ДФФХ : Хол (67 : 33 моль %) или ДФФХ : Эрг (67 : 33 моль %) и омываются 2.° M KCl (pH 7.°)
3
3
0
0
ментом для изучения АМВ-стериновых комплексов, чем флоретин, а двойная связь в положении 22 все-таки влияет на геометрию и энергию комплекса.
Варьирование вида полиенового антибиотика. Поскольку полиеновые молекулы также могут взаимодействовать с дипольными модификаторами, было изучено их влияние на равновесный трансмембранный ток, индуцированный в стеринсодержащих бислоях нистатином и филипином (рис. 1). Молекула НС отличается от молекулы АМВ отсутствием двойной связи в середине полиенового фрагмента, что может сказаться на л-л-электронных взаимодействиях в полиен-стериновых комплексах. Молекула ФЛ, в отличие от АМВ и НС, не содержит остатка ами-носахара. Подобное структурное отличие должно отразиться на формировании сети водородных связей между полиеновой и стериновой молекулами. В случае нистатина I^ увеличивается при добавке флоретина как в ДФФХ : Хол-, так и в ДФФХ : Эрг-содержащих мембранах, при этом введение квер-цетина не влияет на I^ в присутствии в мембране как Хол, так и Эрг (рис. 5А). Оба флавоноида (флоре-тин и кверцетин) независимо от вида мембранообра-зующего стерина вызывают рост стационарного равновесного трансмембранного тока, индуцированного филипином (в 2 и 10 раз для ДФФХ : Хол- и ДФФХ : Эрг-мембран соответственно) (рис. 5Б). При этом добавка ИН 421 в растворы, омывающие ДФФХ : Холи ДФФХ : Эрг-мембраны, не изменяет стационарный трансмембранный ток, индуцированный как нистатином, так и филипином (рис. 5А,Б). Нарушение конъюгации двойных связей в молекуле НС может дестабилизировать полиен-стериновый комплекс и увеличивать глубину погружения стерина в бис-лой, отодвигая его от полярной «головы» полиеновой молекулы. Флоретин, по всей вероятности, способен стабилизировать такие НС-стериновые комплексы. Отсутствие аминосахара в молекуле филипина приводит к изменению сети водородных связей в по-
лиен-стериновых комплексах и их дестабилизации. Можно думать, что локализация кверцетина в углеводородной области бислоя делает возможным его взаимодействие с более гидрофобным полиеном фи-липином (рис. 2Е,Ж), в результате чего наблюдается существенный рост стационарного трансмембранного ФЛ-индуцированного тока в Хол- и Эрг-содержащих ДФФХ-бислоях.
Варьирование фосфолипидного состава. Для изучения взаимодействия полиенов с другими мембранными компонентами была исследована ка-налообразующая активность АМВ в липидных бислоях, включающих, кроме стеринов, различные фосфолипиды и сфинголипиды в присутствии фло-ретина и ИН 421. Средние отношения равновесного трансмембранного тока, индуцированного АМВ в Эрг-содержащих фосфолипидных бислоях, после и до введения дипольных модификаторов (1^/1^°) при трансмембранном напряжении 50 мВ представлены в виде диаграммы на рис. 6А. Установлено, что введение флоретина в околомембранный раствор приводит к существенному увеличению каналообра-зующей активности АМВ в Эрг-содержащих ПОФХ-бислоях (в 12 раз) и ДОФХ (в 4 раза), в то время как этот дипольный модификатор не влияет на модифицированные АМВ Эрг-содержащие мембраны, сформированные с участием ДФФХ, ДФФС, ДОФЭ и ДОФС. Введение ИН 421 в мембраноомы-вающий раствор вызывает многократное увеличение I^ через Эрг-содержащие бислои из ДФФХ (в 15 раз) и ДФФС (в 42 раза) и не влияет на равновесный трансмембранный ток, индуцированный АМВ, в Эрг-содержащих мембранах, включающих ПОФХ, ДОФХ, ДОФЭ и ДОФС. Учитывая, что молекулы ДФФХ, ДФФС, ДОФЭ и ДОФС имеют коническую, а ДОФХ и ПОФХ - цилиндрическую форму [58, 59], можно предположить, что последние лучше соответствуют жесткой молекуле АМВ. Схематическое представление образования межмолекулярных свя-
А I
фосфолипид:Эрг
флоретин RH 421
Б /«//«
фосфолипид:Эрг:СФС
3 флоретин ]RH 421
I-
1
т
1 1 1
ш,
Х С Х Х Э С
Ф Ф Ф Ф Ф Ф
Ф Ф О О О О
Д Д а Д Д Д
В I«//«
ДФФС:Эрг:сфинголипид
3 флоретин ]RH 421
Рис. 6. Отношение равновесного трансмембранного тока, индуцированного амфо-терицином В в эргосте-ринсодержащих бисло-ях, после и до введения дипольных модификаторов (I«/I«°). Мембраны сформированы из фос-фолипид : Эрг (67 : 33 моль %) (А), фосфоли-пид : Эрг : СФС (53 : 27 : 2° моль %) (Б) и ДФФС : Эрг : сфинголипид (53 : 27 : 2° моль %) (в) и омываются 2.° M KCl (pH 7.°)
°
60
3-
40
20
0
0
°
3-
2-
зей между АМВ-Эрг-ДФФХ и АМВ-Эрг-ПО ФХ представлено на рис. 2З,И. Можно думать, что сильное взаимодействие «полиен-фосфолипид» ослабляет взаимодействие «полиен-эргостерин». Такой полиен-стериновый комплекс может быть стабилизирован молекулами флоретина, которые, благодаря высокой конформационной подвижности и четырем функциональным гидроксильным группам, способны служить посредниками в образовании сети водородных связей между стерином и АМВ. Несоответствие между жесткой палочкообразной молекулой АМВ и фосфолипидами конической формы (ДФФХ, ДФФС, ДОФЭ и ДОФС) предотвращает сильное взаимодействие «полиен-фосфолипид» и поэтому не происходит дестабилизации полиен-стериново-го комплекса. Выше мы предположили, что ИН 421 увеличивает каналообразующую активность АМВ в Эрг-содержащих ДФФХ-мембранах в результате вклада этого дипольного модификатора в сеть как водородных связей, так и л-л-электронных взаимодействий между молекулами Эрг и АМВ. По всей вероятности, аналогичные процессы имеют место и в случае модифицированных АМВ Эрг-содержащих ДФФС-бислоев.
Варьирование сфинголипидного состава. Введение в мембранообразующий раствор сфинголипидов существенно влияет на взаимодействие между молеку-
лами АМВ и фосфолипидов. Установлено, что фло-ретин в 2 раза увеличивает I^ в случае ДФФХ : Эрг : СФС-мембран, а ИН 421 - в 1.7 раза в ДФФС : Эрг : СФС-бислоях. При замене сфинголипидной (СФС на СЭС или СМ (рис. 6В)) или фосфолипидной (ДФФХ на ДФФС, ПОФХ, ДОФХ, ДОФЭ или ДОФС в случае флоретина и ДФФС на ДФФХ, ПОФХ, ДОФХ, ДОФЭ или ДОФС в случае ИН 421 (рис. 6Б)) составляющей в указанных смесях не наблюдается увеличения ^ в присутствии дипольных модификаторов. Полученные результаты показывают, что молекулы сфинголипидов, введенные в мембра-нообразующий раствор, играют существенную роль во взаимодействии молекул АМВ с фосфолипидами и стеринами.
Учитывая, что флоретин уменьшает проводимость одиночных АМВ-каналов в ДФФХ : Эрг-мембранах, отсутствие влияния дипольного модификатора на равновесный трансмембранный ток, индуцированный АМВ, должно означать одномоментный скачок числа открытых АМВ-каналов. Необоснованность подобного заключения позволяет выдвинуть два предположения: 1) различие свойств одиночных АМВ-каналов, в частности, отсутствие селективности у АМВ-каналов, обеспечивающих интегральный ток, тогда проводимость каналов не должна быть функцией ди-польного потенциала мембраны; 2) различие свойств липидного микроокружения каналов в мембране, т.е.
АМВ-канал
Гель-фаза
Неупорядоченная липидная фаза
Рис. 7. Схематическое представление микроокружения АМВ-каналов в мембранах с различной концентрацией полиенового антимикотика, соответствующей функционированию одиночных каналов (А) и интегральному мультиканальному току (Б). При высоких концентрациях (Б) АМВ провоцирует образование в мембране более упорядоченной липидной фазы (показана зеленым цветом)
одиночные АМВ-поры и каналы, обеспечивающие интегральный ток, локализуются в областях мембраны с различными свойствами, в том числе и с различным значением дипольного потенциала бислоя (рис. 7).
Катион-анионная селективность амфотерициновых каналов
Для проверки первого предположения были проведены измерения катион-анионной селективности одиночных АМВ-каналов и интегрального трансмембранного тока. Результаты измерений показали, что АМВ-каналы в стеринсодержащих бислоях преимущественно анион-селективны, независимо от степени модификации мембраны АМВ. Число переноса анионов для одиночных АМВ-каналов составляет V = 0.9 ± 0.1, а для интегрального тока, индуцированного АМВ, равно V = 0.8 ± 0.1. Приведенные данные указывают на то, что ввиду высокой селективности проводимость АМВ-каналов, обеспечивающих интегральный ток, должна зависеть от дипольного потенциала мембраны.
Амфотерициновые каналы в мембранах с фазовым разделением
Существует ряд свидетельств в пользу второго предположения. Так, в присутствии АМВ показано
дозозависимое увеличение температуры фазового перехода липидов из гель- в жидкокристаллическое состояние [23]. Это означает, что АМВ провоцирует образование в мембране более упорядоченной фазы. Более того, как уже отмечалось ранее, молекулы АМВ обладают более высоким сродством к упорядоченным липидным доменам (рафтам) [17]. Поскольку упорядоченные липидные домены обогащены сте-ринами и сфинголипидами, очевидно, что их физико-химические свойства определяются липидным составом мембраны. Известно, что степень упорядоченности липидных молекул и вероятность формирования рафтов зависят от типа включенного в бис-лой стерина [60-62]. Существенное значение имеет и сфинголипидный состав мембраны. В частности, СФС отличается от СЭС наличием одной гидроксиль-ной группы в положении С4. Идковиак-Балдис и со-авт. показали, что С4-гидроксилирование существенно влияет на физические и структурные свойства липидных микродоменов [63]. По всей вероятности, дополнительная гидроксильная группа способствует конденсации липидных молекул за счет увеличения числа водородных связей [64]. Плазматические мембраны клеток грибов содержат фитосфингозин и эр-гостерин [65], а плазматические мембраны клеток млекопитающих - сфингомиелин и холестерин [66]. Эволюционное предпочтение указанным комбинациям может быть обусловлено свойствами формируемых ими упорядоченных липидных доменов. Более того, некоторые фосфолипиды с низкой температурой плавления, которые не локализуются в упорядоченных мембранных областях, способны индуцировать образование этих доменов. Так, способность стабилизировать рафты зависит от структуры фос-фолипида и уменьшается в следующем ряду: ДФФХ, ДФФС, ПОФХ (ДОФХ) [67].
С помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии гигантских одноламеллярных липосом показано, что дипольные модификаторы влияют на фазовое разделение в липосомах [68]. Флавоноиды, биоханин А и флоретин приводят к разжижению твердокристаллических областей в мембранах липо-
А
Рис. 8. Микрофотографии одноламеллярных липосом из ПОФХ в отсутствие по-лиенового антибиотика (А), в присутствии в мембра-ноомывающих растворах 300 мкМ АМВ (Б) и комбинации 300 мкМ АМВ и 400 мкМ флоретина (б)
Б
Б
б
сом и способствуют образованию рафтов в мембране, в то время как мирицетин скорее вызывает конденсацию бислоя. Данные, полученные методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, подтверждают влияние флавоноидов на фазовое разделение в липосомах [68].
Результаты наших исследований показали, что в отсутствие АМВ липосомы из ПОФХ окрашены гомогенно; латеральной гетерогенности мембран не наблюдается (рис. 8А). Введение 300 мкМ АМВ индуцирует образование в липосомах неокрашенных доменов дендритной формы, которые могут быть отнесены к твердокристаллической липидной фазе (рис. 8Б). Флоретин в концентрации 400 мкМ приводит к разжижению гель-доменов в модифицированных АМВ везикулах, и липосомы оказываются гомогенно окрашенными (рис. 8В). Эти данные указывают на то, что дипольные модификаторы влияют
на образование и динамику обогащенных полиено-выми макролидами упорядоченных мембранных областей.
заключение
Установлено, что каналообразующая активность по-лиеновых антибиотиков в липидных бислоях определяется суперпозицией нескольких факторов: дипольного потенциала мембраны, стабильности по-лиен-липидных комплексов и физико-химических свойств упорядоченных липидных областей. •
Авторы выражают благодарность Е.Г. Чулкову за участие в некоторых экспериментах.
Работа поддержана РФФИ (грант № 12-04-33121), программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и НШ-1721.2014.4.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Malewicz B., Momsen M., Jenkin H.M. // Antimicrob. Agents Chemother. 1983. V. 23. P. 119-124.
2. Kuwano M., Akiyama S., Endo H., Kohga M. // Biochem. Biophys. Res. Commun 1972. V. 49. P. 1241-1248.
3. Medoff G., Kwan C.N., Schlessinger D., Kobayashi G.S. // Cancer Res. 1973. V. 33. P. 1146-1149.
4. Craven P.C., Gremillion D.H. // Antimicrob. Agents Chemother. 1985. V. 27. P. 868-871.
5. Shigemi A., Matsumoto K., Ikawa K., Yaji K., Shimodozono Y., Morikawa N., Takeda Y., Yamada K. // Int. J Antimicrob. Agent. 2011. V. 38. P. 417-420.
6. Guinet R., Chanas J., Goullier A., Bonnefoy G., Am-broise-Thomas P.J. // Clin. Microbiol. 1983. V. 18. P. 443-444.
7. Hawkins J.L., Baddour L.M. // Clin. Infect. Dis. 2003. V. 36. P. 14-18.
8. Andreoli T. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1974. V. 235. P. 448-468.
9. González-Damián J., Ortega-Blake I. // Membr. Biol. 2010. V. 237. P. 41-49.
10. Récamier K.S., Hernández-Gómez A., González-Damián J., Ortega-Blake I. // J. Membr. Biol. 2010. V. 237. P. 31-40.
11. Samedova A.A., Kasumov Kh.M. // Antibiot. Khimioter. 2009. V. 54. P. 44-52.
12. Касумов Х.М. Структура и мембранная функция полие-новых макролидных антибиотиков. М.: Наука, 2009. 512 с.
13. de Kruijff B., Gerritsen W. J., Oerlemans A., Demel R.A., van Deenen L.L. // Biochim. Biophys. Acta. 1974. V. 339.
P. 30-43.
14. Baginski M., Resat H., Borowski E. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1567. P. 63-78.
15. Marty A., Finkelstein A. // J. Gen. Physiol. 1975. V. 65. P. 515-526.
16. Venegas B., Gonzalez-Domian J., Celis H., Ortega-Blake I. // Biophys. J. 2003. V. 85. P. 2323-2332.
17. Czub J., Baginski M. // J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110. P. 16743-16753.
18. Neumann A., Czub J., Baginski M. // J. Phys. Chem. B. 2009. V. 113. P. 15875-15885.
19. Neumann A., Baginski M., Czub J. // J. Am. Chem. Soc. 2010. V. 132. P. 18266-18272.
20. Baran M., Borowski E., Mazerski J. // Biophys. Chem. 2009. V. 141. P. 162-168.
21. Matsumori N., Tahara K., Yamamoto H., Morooka A., Doi M., Oishi T., Murata M. // J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131.
P. 11855-11860.
22. Hamilton K.S., Barber K.R., Davis J.H., Neil K., Grant C.W. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1062. P. 220-226.
23. Paquet M.J., Fournier I., Barwicz J., Tancrede P., Auger M. // Chem. Phys. Lipids. 2002. V. 119. P. 1-11.
24. Gabrielska J., Gagos M., Gubernator J., Gruszecki W.I. // FEBS Lett. 2006. V. 580. P. 2677-2685.
25. Liberman E.A., Topaly V.P. // Biofizika (Russian). 1969. V. 4. P. 452-461.
26. Hladky S.B., Haydon D.A. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 318. P. 464-468.
27. Brockmann H. // Chem. Phys. Lipids. 1994. V. 73. P. 57-79.
28. Hsuchen C.C., Feingold D. // Antimicrob. Agents Chemother. 1973. V. 4. P. 316-319.
29. Vertut-Croquin A., Bolard J., Chabbert M., Gary-Bobo C. // Biochemistry. 1983. V. 22. P. 2939-2944.
30. Hartsel S.C., Perkins W.R., McGarvey G.J., Cacso D.S. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 2656-2660.
31. Cohen B.E. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1108. P. 49-58.
32. Ruckwardt T., Scott A., Scott J., Mikulecky P., Hartsel S.C. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1372. P. 283-288.
33. Fujii G., Chang J.E., Coley T., Steere B. // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 4959-4968.
34. Dufourc E.J., Smith I.C.P., Jarell H.C. // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 778. P. 435-442.
35. Balakrishnan A.R., Easwaran K.R.K. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 4139-4144.
36. Fournier I., Barwicz J., Tancrede P. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1373. P. 76-86.
37. Milhaud J., Ponsinet V., Takashi M., Michels B. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1558. P. 95-108.
38. Sternal K., Czub J., Baginski M. // J. Mol. Model (Online). 2004. V. 10. P. 223-232.
39. Herec M., Dziubinska H., Trebacz K., Morzycki J.W., Gruszecki W.I. // Biochem. Pharmacol. 2005. V. 70. P. 668-675.
40. Zager R.A. // Am. J. Kidney Dis. 2000. V. 36. P. 238-249.
41. Nagiec M.M., Young C.L., Zaworski P.G., Kobayashi S.D. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 307. P. 369-374.
42. Sun X., Garlid K.D. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 1914719154.
43. Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Antonenko Y.N. // Biophys. J.
2002. V. 82. P. 865-873.
44. Hwang T.C., Koeppe R.E., Andersen O.S. // Biochemistry.
2003. V. 42. P. 13646-13658.
45. Ostroumova O.S., Kaulin Y.A., Gurnev P.A., Schagina L.V. // Langmuir. 2007. V. 23. P. 6889-6892.
46. Asandei A., Mereuta L., Luchian T. // Biophys. Chem. 2008. V. 135. P. 32-40.
47. Остроумова О.С., Щагина Л.В. // Биол. мембраны. 2009. V. 26. P. 287-292.
48. Apetrei A., Mereuta L., Luchian T. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1790. P. 809-816.
49. Ostroumova O.S., Malev V.V., Ilin M.G., Schagina L.V. // Langmuir. 2010. V. 26. P. 15092-15097.
50. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Schagina L.V. // Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 2011. V. 1808. P. 2051-2058.
51. Mereuta L., Asandei A., Luchian T. // PLoS One. 2011. V. 6. P. e25276.
52. Montal M., Muller P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 65. P. 3561-3566.
53. Morf W.E. // Anal. Chem. 1977. V. 49. P. 810-813.
54. Juhasz J., Davis J.H., Sharom F.J. // Biochem. J. 2010. V. 430. P. 415-423.
55. Muddana H.S., Chiang H.H., Butler P.J. // Biophys. J. 2012. V. 102. P. 489-497.
56. Tarahovsky Y.S., Muzafarov E.N., Kim Y.A. // Mol. Cell Biochem. 2008. V. 314. P. 65-71.
57. Passechnik V.I., Sokolov V.S. // Bioelectrochemistry. 2002. V. 55. P. 47-51.
58. Bezrukov S.M. // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2000. V. 5. P. 237-243.
59. Sakuma Y., Taniguchi T., Imai M. // Biophys. J. 2010. V. 99. P. 472-479.
60. Hsueh Y.W., Chen M.T., Patty P.J., Code C., Cheng J., Frisken B.J., Zuckermann M., Thewalt J. // Biophys. J. 2007. V. 92. P. 1606-1615.
61. Cournia Z., Ullmann G.M., Smith J.C. // J. Phys. Chem. 2007. V. 111. P. 1786-1801.
62. Rog T., Pasenkiewicz-Gierula M., Vattulainen I., Karttunen M. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1788. P. 97-121.
63. Idkowiak-Baldys J., Grilley M.M., Takemoto J.Y. // FEBS Lett. 2004. V. 569. P. 272-276.
64. Lofgren H., Pascher I. // Chem. Phys. Lipids. 1977. V. 20. P. 273-284.
65. Rest M.E., Kamminga A.H., Nakano A., Anraku Y., Poolman B., Konings W.N. // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 304-322.
66. Simons K., Toomre D. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000. V. 1. P. 31-39.
67. Bakht O., Pathak P., London E. // Biophys. J. 2007. V. 93. P. 4307-4318.
68. Ostroumova O.S., Chulkov E.G., Stepanenko O.V., Schagina L.V. // Chem. Phys. Lipids. 2014. V. 178. P. 77-83.
69. Efimova S.S., Ostroumova O.S. // Langmuir. 2012. V. 28. P. 9908-9914.
